CC BY
75
СИСТЕМНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АРИДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ
Уде 581.143.5
СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬ РАЗНЫХ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ И ИХ
РЕАКЦИЯ НА ЗАСОЛЕНИЕ
© 2007 г. З.М. Алиева, А.Г. Юсуфов
Дагестанский государственный университет, Россия, 367000, Махачкала, ул. М.Гаджиева, 43А
Реферат. Изучена чувствительность к засолению (NaCl, C11SO4 и Z11SO4) у изолированных листьев, гипокотильных и стеблевых черенков, целых растений фасоли, свеклы, баклажана, подсолнечника. У всех видов моделей и объектов при засолении с разной интенсивностью (более высокой у чувствительных культур) снижались показатели жизнеспособности -выживаемость и активность каллусо- и ризогенсза, накопление биомассы каллусной ткани. Наиболее адекватна реакции на стресс целых растений и стеблевых черенков. Ключевые слова: NaCl, C11SO4, ZnS04, изолированные органы, in vitro, фасоль, подсолнечник, баклажан, свекла.
Изучение устойчивости растений к стрессам имеет как познавательное, так прикладное значение (разработка методов диагностики). Имеющиеся методы либо недостаточно адекватны, либо длительны и трудоемки, либо узкоспецифичны. В этом отношении представляет интерес сравнительное изучение возможностей использования метода культуры разных изолированных органов и структур ввиду высокой их чувствительности к стрессам. Однако до сих пор в этом направлении анализированы возможности клеток и тканей (Бутенко, 1975; 1999), реакция которых не всегда оказывалась адекватной особенностям экологии растений (Носов, 1999; Gulati, Jaiwal, 1994).
Имеются пока лишь сведения о перспективах использования метода культуры изолированных листьев (Yarwood,1946; Юсуфов, 1988) и корней (Смирнов, 1970) для оценки реакции отдельных объектов на стрессы. Все еще ограничены сравнительные данные о реакции на стрессы более сложных изолированных образований и целых растений (Алиева, 2001; Магомедова и др., 2003). Такие сравнения и представляют интерес для оценки экологической устойчивости растений па основе учета проявлений морфогенеза.
Методика
Цель работы - анализ чувствительности к засолению (NaCl, C11SO4, ZnS04) у изолированных листьев, гипокотильных и стеблевых черенков, целых растений фасоли обыкновенной {Phaseolus vulgaris L.) сорта Сакс, свеклы {Beta vulgaris L.) с. Бордо 437, баклажана {Solatium melongena L.) с. Алмаз, подсолнечника (Helianthus annum L.) с. ВНИИМК 8883.
Семена всех культур замачивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге. После проклевывания их сажали в ящики с промытым песком. Черенки (листовые, стеблевые с листьями и без них и гипокотильные (с семядолями и без) отделяли от 5-30-дневных проростков и культивировали в растворах NaCl, C11SO4 и ZnS04 (0.0001 -0.1М). Контроль -дистиллированная вода. Соль NaCl является компонентом почвенного засоления, a C11SO4 и ZnS04 обычно попадают в экосистемы в связи с различной деятельностью человека.
Опыты проводили также in vitro по общепринятой методике (Калинин и др., 1980). После стерилизации структур 0.1 % раствором AgCl в течение 10 мин их промывали несколько раз в дистиллированной воде. Экспланты помещали в пенициллиновые стаканчики с агаризованной средой Мурасиге - Скуга (МС). В среду вводили индолилмаеляную кислоту
(ИМК), бензиламинопурин (БАЛ) в разных комбинациях, а также хлорид натрия (NaCl). В каждом варианте - 20-25 стаканчиков с эксплантами гипокотиля, семядоли, листовой пластинки (далее ЭГ,ЭС,ЭЛ соответственно). Опыты /// vitro включали следующие варианты культивирования: 1) минимальная среда МС без фитогормонов, 2) среда МС + соль (NaCl -10 г/л), 3) МС + фитогормоны (ИМК - 0.5 и БАЛ - 2.5 мт/л).4). МС + фитотрмоны +NaCl.
Состояние изолированных структур оценивали по выживаемости, продолжительности жизни, образованию каллуса и корней, а также величине биомассы. В таблицах приведены средние арифметические и их стандартные ошибки.
Результаты и обсуждение
Для объектов и структур характерна специфика реакции на солевой стресс. У фасоли минимальную выживаемость проявляли ЭС даже при относительно невысоком уровне засоления (0.5 % NaCl), тогда как у ЭЛ и ЭГ ее снижение отмечено при засолении 1% (табл.1).
Таблица 1. Реакция эксплантов фасоли, подсолнечника и баклажана (А-В) на внесение NaCl в питательную среду. Table 1. Reaction of expiants of bean, sunflower and eggplant (A-B) on introduction of NaCl to nourishing environment.
Варианты Выживаемость на 28 день, % Каллусообразование, %
А Б В А Б В
ЭГ 1 2 3 100+10 100+10 50 + 9 85 + 10 80 + 10 50 + 8 60 + 11 55 + 8 20 + 9 90+10 85 + 10 71 + 10 85 + 9 80 + 10 50 + 8 63 + 11 55 + 10 0
ЭС 1 2 3 40 + 10 10 + 6 13+7 100 + 0 100 + 5 75 + 10 95 + 5 80 + 5 41 + 1 66 + 9 13 + 1 23+5 100 + 5 90 + 10 70 + 10 75 + 10 70 + 10 50 + 10
ЭЛ 1 2 3 70 + 9 70 + 9 27 + 9 60 + 9 50 + 9 40 + 8 100 100 100 75 + 10 18 + 7 30 + 5 25 + 5 20 + 5 0 90 + 8 86+10 86+5
Примечание. 1 - МС+ИМК (0.5 мг/л) + БАП (2.5 мг/л); 2 - МС + ИМК + БАЛ + ШС1 (0.5%); 3 -МС + ИМК + БАП + №С1 (1%).ЭГ у фасоли оказались менее чувствительными к засолению, чем листьев. Солевой стресс сильнее подавлял прирост биомассы экспланта и каллуса у ЭЛ, чем ЭГ (рис.).
400
300
200-
0 100-
Рис. Прирост Каллуса у экспланта (Г) у листьев (А) и каллуса (11) и гипокотилей (Б) фасоли в условиях засоления среды. Fig. Increase of explant (I) and callus (TI) of leaves (A) and hypocolyl (B) of beans in conditi on of environment salinization.
При этом на среде МС с добавлением 0.5% NaCl у ЭГ наблюдалось даже некоторое стимулирование процесса каллусообразования. Масса каллуса, образовавшегося на 30 сут., у ЭГ составила 120, ЭЛ - 96 % по сравнению с контролем. В варианте с засолением 1% NaCl -53 и 36 % соответственно. Менялся и тип каллуса: в варианте с 0.5% NaCl - от рыхлого до плотного, обычно желтый или белый, тогда как с 1% NaCl - только коричневый плотный. Более чувствителен к солевому стрессу процесс корнеобразования, который подавлялся уже в варианте 0.5 % NaCl. По итогам реализации всех показателей жизнеспособности, можно построить убывающий ряд чувствительности к солевому стрессу для фасоли: ЭС —»ЭЛ—»ЭГ. Такая же картина наблюдалась и в опытах с черенками в нестерильных условиях (табл.4). Структуры баклажана также отличались по чувствительности к солевому стрессу. У ЭС отмечено менее значительное снижение выживаемости, интенсивности и мощности каллусообразования, чем у ЭГ. Масса каллуса, образованного на ЭС в контроле (без соли), составила 575 мг, а в варианте с NaCl (1%) -уже 153 мг (табл.2). В контроле образование корней замечено у 18% проростков. Введение соли в среду ингибировало ризогенез. В варианте без засоления на каллусах ЭС и ЭГ закладывались почки, что полностью подавлялось при засолении среды. ЭЛ баклажана менее чувствительны к солевому стрессу, их ингибирование наблюдалось в более высоких концентрациях, чем у ЭГ и ЭС (табл.1). Так, выживаемость, прирост и каллусообразование ЭЛ при введении в среду соли (1%) составили для фасоли соответственно 39, 76 и 53 % по сравнению с контролем, а для баклажан все показатели остались на уровне контроля. У всех структур баклажана и фасоли в условиях засоления процесс корнеобразования сильнее ингибировался, чем каллусообразование.
Таблица 2. Влияние засоления среды на сырую биомассу каллусной ткани (мг). Table 2. Impact of salinization of environment on raw biomass of callóse tissue (nig).
Варианты Фасоль Баклажан Подсолнечник Свекла
ЭС1 - 0 155 ±18 52±8
2 - 0 64 ±23 47 ± 12
3 - 575 ±35 292 ± 46 85 ± 18
4 - 153 ± 19 202 ± 20 199±33
ОБК - 27 69 230
ЭГ1 О(корни) 1 5±5 0 45±5
2 О(корни)* 0 0 15±2
3 273 ± 46 40 ±7 115± 20 30 ±3
4 146±25 10 ± 3 130 ±15 40 ±6
ОБК 53 35 13 133
ЭЛ 1 60 ±10 - 64 ±10 45±6
2 48 ±13 - 15± 10 110± 20
3 149 ±39 - 76 ±15 168± 19
4 54 ± 11 - 66 ±14 400 ± 5
36 - 89 242
ОБК ЭС - 27 69 230
ЭГ 53 35 13 133
ЭЛ 36 - 89 242
Среднее** 45 26 90 202
Примечание. 1-4 - обозначения вариантов. - см. в п. «Материал и методы исследований». 0)-каллус не образуется; -)- наблюдения не проводились ; *) в данном варианте корни развиты слабо; **) приведены средние величины для всех эксплантов у каждой культуры; ОБК - относительное накопление биомассы каллуса.
Засоление приводило к снижению показателей выживаемости, роста и каллусообразования и у эксплантов подсолнечника. При этом введение хлорида натрия (1%) в минимальную среду МС способствовало летальному исходу всех эксплантов, а слабый каллус отмечен только у 10% ЭС. Наблюдалась также задержка сроков развития каллуса. При одновременном же введении регуляторов роста и соли отмечено полное подавление каллусообразования у ЭЛ. У ЭС и ЭГ оно происходило менее активно, чем па среде без соли. Масса эксплантов семядолей к 20 дню культивирования в варианте без соли и регуляторов достигала 155 мг, в варианте только с солью (1%) ~ 64 мг. На среде с регуляторами без соли масса экспланта с каллусом составила 293 мг, а при введении соли -160 мг. Интенсивность каллусообразования ЭГ подсолнечника также снижалась при засолении, что наблюдалось и в опытах других исследователей (Prakash et al., 1993).
У эксплантов свеклы введение соли в среду не только не приводило к снижению жизнеспособности, но в ряде случаев даже стимулировало рост каллуса. Особенно существенные различия отмечены в биомассе образовавшейся каллусной ткани (табл.2). Показательны различия также у эксплантов разных структур свеклы. Высокую чувствительность проявили ЭГ, меньшую- ЭС.
Итак, у всех видов структур при культивировании в условиях засоления отмечено снижение показателей жизнеспособности. Специфика заключалась в скорости изменений, а также в интенсивности накопления биомассы каллусной ткани. Биомасса каллуса уменьшалась более заметно у эксплантов более солечуветвительных культур (фасоли и баклажана), а менее - у устойчивой свеклы (табл. 2). Показателем, характеризующим устойчивость растений к разным воздействиям, в том числе и к засолению, может служить относительная длина проростков (Альдеров, Баташева, 1999), а в наших опытах- величина относительного накопления биомассы каллуса (ОБК), рассчитываемая как отношение массы каллуса опыта к контролю (в процентах). При сравнении биомассы каллусов разного происхождения у объектов преимущество оказалось у свеклы. При сравнении усредненных показателей по всем структурам у объектов фасоль незначительно отличалась от баклажана (45 и 26), заметно возрастал он у подсолнечника (90) и свеклы (202) (табл.2). Эти величины соответствуют солеустойчивости целых растений каждого объекта (Косулина и др., 1993). Характер и органоспецифичность признака солеустойчивости следует учитывать при конкретизации методов диагностики устойчивости.
Органоспецифичность солеустойчивости и видовые особенности проявлялись и в условиях нестерильной культуры. Так, такие структуры у объектов, как черенки, отличались по выживаемости и укореняемости при культивировании в растворах солей. Отличия проявлялись не только по объектам, но и по структурам и типам засоления. При этом, как правило, по мере упрощения структуры ее чувствительность к стрессам повышалась. Растворы сульфата меди оказали на изолированные структуры более выраженное негативное воздействие, чем растворы сульфата цинка и хлорида натрия (табл.4), что согласуется с данными литературы о высокой токсичности этой соли (Елькина, 2001).
Высокую чувствительность к засолению проявили изолированные листья, которые отмирали без развития корней в растворах 20 мМ NaCl и 0.0005 мМ CuS04. Отрезки эпикотилей оказались менее жизнеспособными по сравнению с гипокотилями. Пороговая чувствительность органа зависела и от его организации. Так, у гипокотильных и стеблевых черенков (с листьями или семядолями) отмечен ризогенез в условиях засоления (40-50 мМ NaCl для подсолнечника и 15-30 мМ для фасоли), уровень которого для отрезков гипокотилей и эпикотилей без листьев и семядолей оказался токсичным. В связи с этим отмстим, что ризогенез у изолированных листьев с черешками подавлялся в растворах несколько более высокой концентрации соли, чем у листьев без черешков. Наблюдалась у них и задержка закладки корней на 3-5 дней по сравнению с контролем. Так, например, период ризогенеза составлял в контроле 6 дней, тогда как в растворе ZnS04 (0.0006%) - 19
дней. В целом у стеблевых h гнпокотнльных черенков фасоли снижение и полное подавление укореняемости происходило в растворах NaCl соответственно 10-20 и 25-45 мМ, у подсолнечника - 40-50 и 45-55 мМ (табл.3,4).
Таблица 3. Пороговые дозы чувствительности к NaCl (мМ). Table 3. Extreme doses sensitivity to NaCl (mM).
Объекты и структуры Летальные Состояние
концентра ингибирования ризогенеза
ции, мм слабое полное
Фасоль 25±5 15±5 20±5
Облиственные стеблевые черенки 10±5 5±2 10±5
Отрезки эпикотилей 45±10 30±5 45±5
Гииокотильные черенки с семядолями 20±10 20±5 40±5
Отрезки гипокотилей 20±5 10±3 15±5
Отделенные листья 120± 15
Целые растения
Подсолнечник 65± 10 40±5 50±5
Облиственные стеблевые черенки 30±5 10±5 20±10
Отрезки эпикотилей 60± 10 45±5 55±5
Гииокотильные черенки с семядолями 25 ±5 15 ±5 20 ±5
Отрезки гипокотилей 15±5 5±3 10±5
Отделенные листья 190±20
Целые оастения
Таблица 4. Укореияемость разных структур фасоли при культивировании в солях меди и цинка. Table 4. Ingraining of different structures of bean while cultivation in salts of copper and zinc.
Вариант ZnS04 CuS04
7 16 cvt. Общая 7 cvt. 16 cvt. Общая
Н20 1 80 90 90 70 80 80
2 50 80 90 50 80 90
3 - - - 20 50 50
4 20 60 60 20 100 100
CuS04mM
0.024 1 0 10 10 0 0 10
2 10 30 30 0 30 30
3 - - - 0 5 10
4 0 10 20 10 20 20
0.020 1 0 10 10 0 20 30
2 20 40 50 0 40 50
3 - - - 0 20 20
4 0 20 20 20 30 30
0.012 1 50 10 10 20 50 60
2 20 70 70 20 70 70
3 - - 0 30 30
4 1 30 30 20 35 40
Примечание. Обозначения структур: 1 изолированные листья; 2 облиственные стеблевые черенки; 3 -отрезки эпикотилей; 4 гииокотильные черенки. Прочерки (-) наблюдения не проводились.
Не у всех объектов солеустойчивость структур коррелировала с таковой целых растений. Например, листья более солеустойчивого гюдсолнечника и менее устойчивой фасоли проявляли одинаковую чувствительность к засолению. При этом наблюдалось
ингибирование при равных низких концентрациях (около 10 мМ). Наибольшее соответствие реакции у всех объектов наблюдалось для ризогенеза облиственных стеблевых черенков, наиболее приближающихся по уровню организации к целому растению, что позволяет их использовать в качестве адекватной модели при оценке чувствительности растений к солям, в том числе меди и цинка.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для разных объектов и моделей (проростков, изолированных органов и структур) характерна специфика реакции на засоление среды. При этом меньшая чувствительность характерна изолированным структурам более солеустойчивых растений (свекла и подсолнечник). В то же время изменение уровня организации структуры также имеет значение для реакции на засоление. Реакция гипокотильных и стеблевых черенков более адекватна таковой проростков и самих растений, чем изолированных листьев и отрезков стеблей.
В этом отношении наиболее отзывчивы такие показатели, как развитие корней у структур и накопление биомассы каллуса. По величине относительного накопления биомассы каллуса выделяются подсолнечник и свекла, как более солеустойчивые культуры. На подсолнечнике показано также явное преимущество стеблевых черенков при действии хлорида натрия и сульфатов меди и цинка. Отличия обнаружены и между другими объектами, хотя и менее резкие. В связи с этим надо отметить, что культивирование изолированных органов и тканей для оценки действия экстремальных факторов на растения значимо, когда сравнение ведется с учетом результатов разных структур в пределах одного и того же растения. Это позволяет оценить специфику реакции сравниваемых культур с поправками на особенности отдельных структур.
По реакции отдельной изолированной структуры не всегда удается определить солеустойчивость растения, так как заметно меняется пороговая чувствительность структур к засолению в пределах индивидуума (Алиева, 2001; Магомедова и др., 2003). Анализ пороговой чувствительности структур к стрессам, являющейся результатом дифференциации индивидуума и все еще слабо изученной, позволяет судить о сложной природе экологической устойчивости растений. Нарастание дифференциации и метамерпости организации индивидуума в ходе эволюции растений привело к необходимости возникновения механизмов, определяющих физиологическое взаимодействие между структурами в онтогенезе. Такая возможность реальна только при отборе индивидуума как структурно-функциональной целостной системы. В этом и проявляется значимость механизмов, направленных на обеспечение устойчивости индивидуума к стрессам и разного уровня пороговой чувствительности его тканей (Шмальгаузен, 1982). Эти механизмы и служат для поддержки гомеостаза и надежности индивидуума растений в неблагоприятных условиях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ллъдеров A.A., Баташева Б.А. Внутривидовое разнообразие пшеницы и ячменя по солеустойч и вости // Достижения и современные проблемы развития науки в Дагестане. Тез. докл. Межд. научн. конф. Махачкала: ДНЦ РАН,1999. С.249-250.
2. Алиева З.М. Реакция отделенных органов растений на солевой стресс. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. М., Московский университет, 2001. 21 с.
3. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.: Наука, 1975. 51 с.
4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС 1999. 160 с.
5. Елъкина Г.Я. Влияние тяжелых металлов на урожайность //Агрохимия. 2001. №8. С. 70 -78.
6. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры изолированных тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980. 489 с.
7. Косулина Л.Г.. Луценко Э.К., Аксенова В.А. Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Ростов н/Д.: Изд. РГУ. 1993. 240 с.
8. Магомедова М.А., Юсуфов А.Г., Алиева З.М. Системный контроль регуляции жизнеспособности растений и накопления ионов натрия у структур при засолении среды //Вестник Дагестанского научного центра РАН. Махачкала. 2003. № 14. С. 46-53.
9. Носов A.M. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент //Физиология растений. 1999. Т.46. №6. С. 837 - 844.
10. Смирнов A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. М.: Наука, 1970.455 с.
11. Шмалъгаузен И.И. Организм как целое в индивидуальном и историческом развитии. М.: Наука. 1982.382 с.
12. Юсуфов А.Г. Культура изолированных листьев. М.: Наука, 1988. 103 с.
13. Gulati A., Jaiwal Р.К. Cellular and whole plant response of Vigna radiata to NaCl stress // Biol. Plant. 1994. V. 36; №2. P.301-307.
14. Fung L.E., Wang S.S., Altman A., Hutterman A. Effect of growth, photosynthesis, ion and water relations of four poplar genotypes // Forest Ecology and Managemant. 1998. V. 107. P. 135-146.
15. Prakash A.M., Vajrana Bhaiah, P.C. Reddy. Effect of salt stress on callus development from hypoeotyl segments of sunflower (Helianthus annuus L.) genotypes //Hella. -1993. -16. №18 P.71-76.
16. YarwoodC.E. Detached leaf culture//The Botanical Review. 1946. V. 12. №1. P. 1-56.
TOLERANCE OF DIFFERENT-PARTS OF PLANTS TO SALTS
2006 Z.M. Alieva, A G. Yusufov
Daghestan State University, Makhachkala, 367000, M. Gacijievstr., 43a
We studied sensitivity to salinization (NaCl, CuS04 and ZnS04) of isolated leafs of stalk haft of hole plants of bean, beet, eggplant, sunflower. The factor of viability - survival and activity of callose and rhizogenesis, storage of biomass and callose tissue of all kinds of models and objects in condition of salinization with different intensity (that is higher of sensitive plants) reduced. The most similar reaction on the stress is the reaction of stalk haft.
