CC BY
69
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 581.1:632.122.1
ВЛИЯНИЕ МЕДИ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ IN VITRO ОРГАНЫ И ТКАНИ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ
®2011 Алиева З.М.
Дагестанский государственный университет
Изучено действие медного купороса на культивируемые in vitro ткани и органы сортов томата и огурца, которое оценивали по выживаемости, росту и регенерационной активности эксплантов на среде с медным купоросом. У томата более устойчивым к медному купоросу оказался сорт Волгоградский. Для огурца выявлена большая чувствительность сорта Апрельский. Экспланты огурца в целом проявили большую чувствительность к медному купоросу, чем экспланты томата. Гормональная среда Мурасиге-Скуга, содержащая 25 мг/п CuS04, может быть использована в качестве селективной для оценки устойчивости органов этих растений к медному купоросу.
The action of the copper sulphate on the cultivated in vitro tissues and organs of tomato and cucumber sorts which was estimated according the survival rate, the growth and the regenerative activity of explants in the copper sulphate environment is researched. The most resistant to the copper sulphate tomato sort is Volgogradsky. The most sensitive is Aprelsky cucumber sort. The cucumber explants as a whole showed the larger sensitivity to the copper sulphates, than the tomato explants. The hormonal Murasige-Skuga environment containing 25 mg/l CuS04, can be used as selective for the estimation of tissue stability of these plants to the copper sulphate.
Ключевые слова: устойчивость растений, засоление, тяжелые металлы, медь, in vitro.
Keywords: plant resistance, salinity, heavy metals, copper, in vitro.
Изучение устойчивости растений к неблагоприятным факторам -проблема, давно привлекающая внимание физиологов растений [6,
10]. Актуальность ее постоянно возрастает в связи с повышением уровня антропогенной нагрузки, в том числе поступлением в окружающую среду все больших количеств тяжелых металлов [4, 7,
11]. Перспективным в разработке
методов диагностики устойчивости растений к стрессам и изучении механизмов формирования
адаптаций являются такие модели, как изолированные органы, в том числе культивируемые in vitro [1]. Метод культуры тканей использован при изучении действия на растения ионизирующей радиации [1], крайних температурных условий [2], почвенного засоления [6]. Применение этого метода дает возможность разграничения
клеточных и организменных механизмов устойчивости [1,2 6, 7]. Среди практических задач, которые могут быть решены с помощью
метода культуры тканей, - и выявление видов и сортов, чувствительных и устойчивых и к действию тяжелых металлов. Это имеет значение как для сельского хозяйства, так и для разработки методов фиторемедиации почв и выявления видов -
гипераккумуляторов тяжелых
металлов [4, 8]. Среди
предложенных подходов есть и методы, основанные на
использовании черенков или пробирочных микрорастений и анализе состояния побегов и характера повреждений (потери тургора, некрозов), возникающих у них при кратковременном действии тяжелых металлов [8]. Однако вопрос об адекватности такой
модели, как изолированные органы и ткани растений, интактному, целостному растению, остается
дискуссионным. Кроме того, разные органы растений в интактном и изолированном состоянии имеют разную чувствительность к стрессам, поэтому необходима комплексная оценка действия стрессов на разные органы, а также анализ разных показателей жизнеспособности, которые могут иметь тестовую значимость и среди которых особое внимание следует уделить
процессам морфогенеза.
Известно также, что тяжелые металлы с разной интенсивностью накапливаются у разных видов, а также в разных органах и частях растений. Так, отмечено, что двудольные поглощают большее количество металлов, чем однодольные, а у плодовых деревьев медь и свинец накапливаются преимущественно в листьях и плодах [7]. Культура изолированных органов позволяет оценить непосредственное воздействие тяжелых металлов на тот или иной орган, который у многих видов в интактном состоянии оказывается защищенным вследствие высокой аккумуляции ионов в корнях, и выявить вклад клеточного и организменного уровней в регуляцию
устойчивости к этим токсикантам у разных видов растений.
Целью данной работы было выявление специфики реакции на действие медного купороса у изолированных органов разных сортов культурных растений (томата и огурца) в культуре in vitro. В конкретные задачи работы входило изучение влияния CuS04 на регенерационную активность
эксплантов соответствующих органов и установление ингибирующих концентраций для разных объектов и структур.
Материал и методы
Действие тяжелых металлов на культивируемые in vitro ткани и органы проводилось нами на примере сортов культур томата и огурца. Выбор сортов (томата -Волгоградский и Факел, огурца -Апрельский и Конкурент) был произведен, главным образом, с учетом их солеустойчивости, о которой судили на основании предварительных опытов по прорастанию семян и накоплению биомассы проростков в растворах CuS04 разной концентрации. В качестве стрессора использована соль тяжелого металла - меди -медный купорос (CuS04 5Н20). Медный купорос широко
используется в сельском хозяйстве для борьбы с болезнями культурных растений [3], вследствие чего загрязнение им среды постоянно нарастает.
Опыты проводили в условиях in vitro по общепринятой методике [1]. После обработки 10-20-дневных проростков 0,1% раствором HgCI2 (10 мин) их промывали несколько раз стерильной дистиллированной водой и отделяли фрагменты - экспланты гипокотилей (ЭГ), апикальных сегментов гипокотиля с точкой роста (далее точек роста, ТР) и семядолей (ЭС) размером 5-10 мм. Экспланты помещали на среду Мурасиге-Скуга (МС) и культивировали в пенициллиновых стаканчиках при естественном освещении и
температуре 22-26°. В среду добавляли регуляторы роста (РР): индолил-3-масляную кислоту (ИМК) и 6-бензиламинопурин (БАП),
минимальная среда МС содержала минеральные соли и витамины без регуляторов роста. Опыты проведены в трехкратной повторности. Каждый вариант опыта включал 25 стаканчиков, в каждом -по 3 экспланта. Оценку состояния изолированных органов проводили по комплексу показателей. Выживаемость определяли в процентах выживших эксплантов от общего количества в варианте. Активность роста эксплантов выражали в баллах от 1 до 3: слабое, умеренное (в 2 раза) и интенсивное (в несколько раз) увеличение размеров экспланта. Интенсивность корне- и каллусообразования эксплантов оценивали в % от общего числа эксплантов в варианте, а также в баллах (от 1 до 3: слабый,
умеренный и интенсивный рост соответственно), определяли также сырую биомассу сформировавшейся на эксплантах каллусной ткани. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методам и с помощью программы Microsoft Exell, в таблицах приведены средние арифметические и их стандартные ошибки.
Результаты и их обсуждение
Одной из задач работы было комплексное и сравнительное
изучение влияния солей ТМ на рост и регенерацию разных структур у различных объектов, при этом важным моментом было выявление пороговых и сублетальных доз. В связи с этим первоначально экспланты разного происхождения культивировали на питательной среде с добавлением солей СиБ04 в широком диапазоне концентраций. Опыты, проведенные с эксплантами томата сорта Факел, показали, что в вариантах с концентрацией медного купороса порядка 2-10 мг/л выживаемость, рост и доля эксплантов семядольных листьев, сформировавших каллус, достоверно не изменялись, оставаясь на уровне контроля. При этом уже при более низких концентрациях токсиканта (5мг/л) заметно снижалась интенсивность роста образующейся каллусной ткани. Так, снижение биомассы каллуса в варианте 5 и 10 мг/л происходило в 1,2, 20 мг/л - в 3,2, а 40 мг/л - в 16,1 раз, сочетаясь в последнем случае с почти 2-кратным снижением укореняемости эксплантов (с 33 до 18%). Снижение выживаемости и активности ростовых процессов у ЭГ и ТР происходило при более низких концентрациях соли. Достоверное снижение же накопления биомассы каллуса у ЭГ, как и у ЭС, начиналось с варианта 20 мг/л, а у ТР - уже с 10 мг/л.
Таблица 1
Состояние эксплантов томата (с. Факел) при введении в среду разных концентраций Си804
Вариант Выживаемость, % Рост экспланта Каллусообразование Ризогенез
% балл % балл масса
ЭС 1 100 93±5 2 93±5 2 193±10 86±10
2 100 100 2 66±10 2 127±14 21 ±5
3 100 100 2 100 2 246±14 30±5
4 100 100 2 100 2 114±9 0
5 100 100 2 100 2 154±10 21 ±5
6 100 100 3 100 3 155±9 12±5
7 100 100 2 О +| 2 61 ±4 29±5
8 100 94±4 1 64±5 1 12±1 27±7
ЭГ 1 71 ±3 71 ±3 2 71 ±5 2 110±15 57±10
2 100 88±5 2 78±8 3 140±10 0
3 53±3 50±4 2 50±10 2 125±6 0
4 47±4 45±4 2 50±10 2 120±10 0
5 21 ±3 22±3 2 22±2 2 147±11 0
6 55±5 45±5 1 45±5 2 144±11 0
7 23±3 23±3 1 23±3 2 45±5 0
8 100 68±5 1 65±5 2 31 ±4 0
ТР 1 100 100 3 100 2 152±11 100
2 100 100 2 60±5 3 110±15 0
3 100 100 3 100 3 150±11 66±10
4 100 84±4 2 92±5 2 78±7 0
5 100 90±5 2 100 2 147±12 0
6 90±5 90±5 2 90±10 3 106±8 0
7 100 94±4 2 100 2 94±6 0
8 95±5 90±5 2 71 ±7 2 41 ±5 0
Примечание. Варианты культивирования: 1 - МС, 2 - МС + РР (ИМК, БАП), 3 - МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (1мг/л), 4 - МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (2мг/л), 5 - МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (5мг/л), 6-МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (10мг/л), 7 - МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (20 мг/л), 8-МС + РР (ИМК, БАП) + CuS04 (40 мг/л)
Поскольку отрицательное
действие СиБ04 на экспланты начинало проявляться в наших опытах с концентрации 20 мг/л, то дальнейшее сравнение сортов Факел и Волгоградский производилось на среде с дозой токсиканта 25 мг/л. Выявленная в предварительных опытах несколько более высокая жизнеспособность сорта
Волгоградский при действии растворов медного купороса в целом проявилась и в культуре in vitro. При этом наблюдалась
органоспецифичность этой реакции. Так, у сорта Факел семядоли проявили большую устойчивость к стрессу, чем гипокотили и точки роста (табл. 2).
Таблица 2
Состояние эксплантов томата при введении в среду CuS04 (25 мг/л)
Варианты, экспланты Выживаемость на 20 сут. (%) Рост Каллусообразование Корни
% | баллы % | баллы % | баллы
Волгоградский
ЭС 1 100 100 2,0 100 1,0 50±10 3,0
2 100 100 2,9 100 1,4 29±5 2,8
3 100 100 1,3 100 1,0 48±5 3,0
4 100 100 1,7 100 1,0 0 -
ЭГ 1 100 100 1,6 100 1,0 30±6 1,3
2 100 100 2,3 100 1,7 27±5 2,0
3 80±6 80±8 1,3 79±5 1,0 10±3 1,0
4 100 100 2,0 100 2,0 14±4 1,0
ТР 1 100 100 3,0 100 1,0 38±8 2,0
2 100 100 2,0 100 1,8 0 -
3 74±5 100 1,2 100 1,0 50±5 1,6
4 100 100 1,9 92±5 1,0 75±10 2,0
Факел
ЭС 1 100 100 2,3 58±10 2,0 86±6 1,8
2 100 100 3,1 100 1,4 33±3 2,0
3 78±9 78±5 2,0 100 1,0 74±7 2,0
4 97±7 97±4 2,4 80±10 1,0 0 -
ЭГ 1 60±5 60±5 1,0 40±5 1,0 30±5 1,3
2 75±5 35±3 3,0 75±10 1,7 27±5 2,0
3 37±5 37±4 1,7 20±5 1,0 10±5 1,0
4 100 100 2,0 43±5 1,0 14±4 1,0
ТР 1 40±3 40±5 1,0 40±5 1,1 30±5 2,0
2 100 100 2,0 100 1,9 33±3 1,0
3 10±5 10±5 1,0 0 - 0 -
4 47±10 47±7 1,4 30±5 1,6 0 -
Примечание. Варианты культивирования: 1. минимальная среда Мурасиге-Скуга-(МС). 2. МС + ИМК (0,5 мг/л) + БАП (2,5 мг/л). 3. МС + CuS04 (25 мг/л). 4. МС + РР + CuS04 (25 мг/л)
Изолированные органы огурца проявили большую чувствительность к медному купоросу по сравнению с гомологичными структурами томата. Так, у сорта Апрельский добавление Сиё04 к минимальной среде понижало процент каллусообразования в 3,7, к гормональной - в 1,4 раза. Снижение этих же показателей для ЭГ составило 1,7 и 2,5 раз, при этом у гипокотилей подавлялся и прирост ткани, оцененный в баллах (в 1,5 и 1,9 раз соответственно), и развитие корней. Максимальную чувствительность у сорта Апрельский проявили точки роста, которые на среде с медным купоросом отмирали без роста и регенерации.
Особенности реакции сорта Конкурент проявились в высокой чувствительности всех эксплантов на минимальной среде (отмирание происходило без роста и каллусообразования). На
гормональной среде медный купорос снижал выживаемость и рост эксплантов, достоверно не влиял на процент эксплантов, сформировавших каллус, но подавлял мощность его развития (табл. 3).
Поскольку состояние эксплантов на минимальной среде во многом определяется эндогенным
гормональным статусом, основную
оценку реакции на действие медного купороса мы проводили по вариантам введения его в гормональную среду. Опыты показали большую чувствительность сорта Апрельский, жизнеспособность эксплантов
которого полностью подавлялась на среде с медным купоросом, особенно у апикальных сегментов стебля. У томата более устойчивым оказался сорт Волгоградский, а экспланты огурца в целом - более чувствительны, чем томата.
Эффект действия медного купороса зависел от наличия фитогормонов в питательной среде. При введении его в минимальную, не содержащую фитогормонов среду, эффект был более выраженным и приводил к большему снижению выживаемости, роста и регенерации эксплантов. При этом, независимо от содержания медного купороса, при более интенсивном
каллусообразовании менее активно формировались корни, и наоборот. Поэтому при оценке устойчивости растений по реакции их эксплантов in vitro следует оценивать
регенерационную активность в целом, а не проводить независимую оценку мощности каллуса или корней.
Таблица 3
Состояние эксплантов огурца при введении CuS04 (25 мг/л)
Варианты, экспланты Выживаемость на 20 сут. (%) Рост Каллусообразование Корни
% | баллы % | баллы % | баллы
Апрельский
ЭС 1 100 100 1,4 63±6 1,0 50±5 3,0
2 94±10 94±10 3,0 82±8 1,4 29±6 2,8
3 85±5 85±5 1,1 17±5 1,0 48±5 3,0
4 100 100 2,3 58±8 1,0 0 -
ЭГ 1 100 100 2,1 100 2,4 100 2,0
2 100 100 2,7 100 3,7 50±5 1,7
3 60±5 60±5 1,0 60±5 1,6 20±5 1,1
4 80±10 80±10 1,2 40±5 2,0 20±5 2,0
ТР 1 67±7 67±7 2,0 100 2,0 40±5 2,0
2 100 100 4,0 100 4,0 0 -
3 0 0 - 0 - 0 -
4 0 0 - 0 - 0 -
Конкурент
ЭС 1 100 100 2,5 75±10 2,0 50±10 2,0
2 100 100 3,1 100 2,7 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0
4 100 75±10 1,3 100 0,9 50±10 2,0
ЭГ 1 50±5 75±10 1,0 100 1,3 100 2,0
2 100 100 2,5 100 3,1 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0
4 67±7 100 1,0 100 1,4 50±5 1,7
TP 1 100 100 2,0 50±5 1,0 50±5 2,0
2 100 100 2,5 100 2,6 57±5 1,0
3 0 0 0 0 0 0 0
4 100 100 1,8 100 1,0 0 0
Примечание. Обозначение вариантов см. в таблице 2
Таким образом, у томата более устойчивым к медному купоросу оказался сорт Волгоградский. Для огурца выявлена большая чувствительность сорта Апрельский, жизнеспособность эксплантов которого полностью подавлялась на среде с медным купоросом. Экспланты огурца в целом проявили большую чувствительность к медному купоросу, чем экспланты томата. Гормональная среда МС, содержащая 25 мг/л Си304, может быть использована в качестве селективной для оценки устойчивости органов этих растений к медному купоросу.
Сопоставление данных по реакции культивируемых органов и каллусных тканей с более выраженными сортовыми различиями интактных проростков позволяет предположить, что в формирование устойчивости к
медному купоросу у сортов томата и огурца большой вклад вносят не только клеточные, но и организменные системы регуляции. Это согласуется с литературными данными о преимущественном накоплении ионов металлов в корнях (по сравнению с надземной частью) у многих культур [7,10]. В тоже время в литературе имеются данные и о высоком накоплении ионов тяжелых металлов в листьях растений [4]. Интенсивность их накопления может коррелировать с устойчивостью растений и даже может быть использована как биоиндикационный показатель [5]. Все это нуждается в проверке на разных объектах путем изучения аккумуляции ионов в разных частях у растений разных сортов.
Примечания
1. Калинин Ф. Д., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев : Наукова думка, 1980. 489 с. 2. Аукаткин А. С., Гераськина А. В. Скрининг клеточных культур огурца на повышенную холодоустойчивость // Биотехнология. 2003. № 3. С. 65-73. 3. Мельников Н.Н. Пестициды и регуляторы роста растений: Справ, изд. М. : Химия, 1995. 576 с. 4. Прасад М. Н. Практическое использование растений для восстановления экосистем, загрязненных металлами // Физиология растений. 2003. Т. 50. № 5. С. 764-780. 5. Рыбальский и др. Экология и безопасность. Справочник. Т. 2 // Экологическая безопасность. Ч. 1. М. : ВНИИПИ, 1993. 293 с. 6. Строгонов Б. П., Клышев Л. К., Азимов Р. А. и др. Проблемы солеустойчивости растений. Ташкент : ФАН, 1989. 184 с. 7. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М., Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск : Кар. НЦ РАН, 2007. 170 с. 8. Фролова Л. В., Джигадло М. И. Экспресс-метод определения устойчивости вишни к воздействию тяжелых металлов в почве // Межд. конф. «Проблемы физиологии растений Севера». Петрозаводск, 2002. С. 191. 9. Gurrier Gilles. Proline accumulation in salt-stress tomato: Different proline precursors in Lycopersicon esculentum and Lycopersicon pennellii // J. Plant Nutr. 1998. 21, № 3. P. 505-513. 10. Tester M„ Davenport R. Na+Tolerance and Na+Transport in Higher Plants // Annals of Botany.-2003. 91. P. 503-527. 11. Prasad M.N. Heady Metal stress in plants // From Molecules to Ecosistems. 2003. 520 p.
Статья поступила в редакцию 28.02.2011 г.
