CC BY
146
Известия Тульского государственного университета
Естественные науки 2008. Выпуск 2. С. 226-237
ХИМИЯ
V. I К 579.222.2:543.553
К.В. Петриков, Е.П. Власова, О.Н. Понаморева, В.А. Алферов, Т.В. Якшина, И.А.Нечаева, Л.И Ахметов, И.Ф. Пунтус,
В.А. Самойленко, А.Е. Филонов
Тульский государственный университет, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г. К. Скрябина РАН, г. Нунцию
СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И ДЕГРАДАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ХРАНЕНИЯ
БИОМАССЫ*
Аннотация. Изучена выживаемость микроорганизмов родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения биомассы: в охлажденном, замороженном и лиофилизированном видах. Лучшим из исследованных консервантов для хранения биомассы при 2-4 °С оказался бензоат натрия. Подобраны защитные среды, обеспечивающие наибольшую выживаемость и сохранение деградативной активности клеток Pseudomonas и Rhodococcus при лиофилизации.
Введение. Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами в настоящее время достигает огромных масштабов. Процессы самовосстановления нефтезагрязнённых территорий могут продолжаться десятилетиями [1]. Проведение биоремедиационных работ с использованием биопрепаратов, включающих штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов, позволяет существенно интенсифицировать процесс очистки загрязненных экосистем [2].
Распространённой формой биопрепаратов является биомасса, обезвоженная с использованием лиофильной (сублимационной) сушки. Сухой препарат более стабилен при продолжительном хранении, но необходим подбор
*Работа была выполнена при поддержке гос. контракта Тема РНП 2.1.1.7789, CRDF RUB2-010001-PU05, РНП 2.1.1.9290, РФФИ 08-04-99019-р_офи, РФФИ 08-04-90721-моб ст и РФФИ 08-04-90028-Бел а.
условий для сохранения выживаемости клеток. На практике это означает, что при использовании сухой биомассы для получения требуемого эффекта необходимо тратить большее количество препарата [3].
При проведении биоремедиационных работ более удобна концентрированная суспензия микроорганизмов, т.к. она обладает более высокой численностью живых клеток, не требует подготовки и существенно дешевле. С другой стороны время сохранения жизнеспособности микроорганизмов очень мало по сравнению с лиофилизированной биомассой.
Таким образом, основными недостатками биопрепаратов являются:
- для лиофилизированной биомассы - низкая выживаемость микроорганизмов;
- для жидкой формы - невозможность длительного хранения.
Поэтому применяют различные протекторы для сохранения жизнеспособности микроорганизмов при лиофилизации и хранении [4].
Целью данной работы являлся подбор консервантов, криопротекторов и условий хранения биомассы микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus, при которых будет сохранена деградативная активность, а выживаемость бактерий будет максимальной.
Материалы и методы.
Бактериальные штаммы. В работе были использованы два штамма активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН: Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), содержащий плазмиду биодеградации полиароматических углеводородов p.XFl 12. и Rhodococcus sp. S67 [5].
Приготовление посевных культур. Для получения чистой рабочей культуры пересевы до отдельных колоний повторяли три раза подряд на чашки Петри с агаризованной средой Эванса [6] с нафталином (для бактерий рода Pseudomonas) или дизельным топливом (для бактерий рода Rhodococcus). Для инокуляции ферментёра готовили посевной материал в глубинной культуре. Для этого культуры микроорганизмов выращивали при 24° С в колбах Эрленмейра на орбитальной качалке (и 200 об/мин) в течение 24 часов (“суточная культура”). В качестве ростовой среды использовали 100 мл богатой среды Лурия-Бетани (LB) [7] или 100 мл минимальной среды Эванса с нафталином или дизельным топливом (ДТ) (ТУ 0251-001-33683428-98).
Условия проведения ферментаций. Все ферментации проводили в фер-
ментёре АНКУМ-2М объёмом 10 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментёр был оснащён механической мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, кислотности среды, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию.
Для культивирования микроорганизма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) была выбрана среда КГКДА следующего состава: кислотный гидролизат казеина - 10 г/л; дрожжевой автолизат - 70 мл/л; (ХН j)2S() j - б г/л; К2НРО4 - 2 г/л; глюкоза - 20 г/л; MgSO 1 - 0,3 г/л; M11SO4 - 0,05 г/л; пеногаситель аСОФЭКСИЛ-1520” (20 % водно-масляная эмульсия полиме-тилдисилоксана, “Софэкс-Силикон”, Россия) - 1 мл/л; водопроводной воды до б л. В качестве добавок использовали или салицилат натрия (содержание 0,2 г/л), или дизельное топливо (0,45 мл/л). Добавки вносили в экспоненциальной фазе роста. Режим культивирования: температура 28 °С; число оборотов мешалки 450 об/мин; кислотность среды pH 6,8±0,2 (поддерживалась автоматически, добавлением в среду 12% раствора аммиака); аэрация воздухом 3 л/мин от 0 до 4 часов роста, затем и до конца процесса - 6,0 л/мин.
Условия ферментации штамма Rhodococcus sp. S67 были выбраны сходные с условиями культивирования псевдомонад. Состав среды отличался содержанием кислотного гидролизата казеина - 5 г/л; дрожжевого автолизата - 100 мл/л и добавлением пептона - 5 г/л. В середине экспоненциальной фазы роста вносили добавку ДТ (1 мл/л). Режим культивирования был аналогичен режиму культивирования для псевдомонады, за исключением кислотности среды (pH 7.0±0.2) и аэрации (3 л/мин от 0 до 8 часов роста, затем 6,0 л/мин).
Сепарация культуральной жидкости. Отделение биомассы клеток производили путём центрифугирования на центрифуге К70 (Janetzki, Германия) при скорости 5000 об/мин в течение 15 мин при 4 °С. Затем к осадку добавляли фосфатный буфер (1:1 по массе), ресуспендировали и снова центрифугировали .
Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов. Для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл суспензии (концентрации живых клеток) применяли метод стандартных серийных разведений с последующим высевом на агаризованую среду Лурия-Бетани [8].
Определение деградативной способности микроорганизмов. 100-200 ко-
лоний микроорганизмов, выросших на среде Лурия-Бетани, методом отпечатков проверяли на способность к росту на агаризованой среде Эванса, содержащей нефть, ДТ или гексадекан в качестве единственного источника углерода и энергии, а также на агаризованую среду Лурия-Бетани для контроля жизнеспособности микроорганизмов.
Проверка стабильности плазмиды. Стабильность плазмиды pNF142 в клетках бактерий микроорганизма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) проверяли методом отпечатков 100-200 колоний, выросших на среде Лурия-Бетани, на агаризованую среду Эванса, содержащей нафталин или салици-лат натрия в качестве единственного источника углерода и энергии.
Хранение. Хранение полученной биомассы осуществляли следующими способами: биомассу хранили без добавления консервантов при 2-4 °С в качестве контроля, а так же с использованием различных консервирующих растворов: 0,05 М натрий-калиевым фосфатным буфером pH 7.0. 20 % раствором сахарозы, 0,2 % раствором бензоата натрия и 0,2 % раствором глу-тамата натрия (отношение биомасса:раствор составляло 1:1 по массе).
В качестве способа длительного хранения использовали заморозку и лио-филизацию.
В замороженном виде биомассу хранили при -20 °С с добавлением 20 % раствора сахарозы в качестве криопротектора (1:1 по массе).
Лиофилизацию биомассы проводили на установке для лиофильной сушки КСЗО (Frigera, Чехия), при температуре 35 °С и давлении 4 мкм рт. ст. (0,5 Па). Полученную сухую биомассу хранили при комнатной температуре в стеклянных флаконах. Перед лиофилизацией биомассу, смешанную с защитной средой выдерживали при температуре -20 °С 24 ч. В качестве защитных сред использовали: 20 % раствор сахарозы; раствор №1: 4% тио-мочевины, 8 % сахарозы, 4 % полиглюкина; раствор JV»2: б % тиомочевины, 10 % сахарозы. Соотношение биомасса:защитная среда составляло 1:1 по массе.
Результаты и обсуждение
Кратковременное хранение биомассы.
Ранее в работе Дербышева с соавт. [9] хранение клеток Pseudomonas flu-orescens осуществлялось при 22 °С. Выживаемость клеток через трое суток составляла 7 %. В работе Куюкиной и И вши пой [10] показано изменение численности микроорганизмовД/ш^ососсмз erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 в зависимости от температуры хранения (5, 10, 15 и 20 °С). Наибольшая выживаемость микроорганизмов была при 5 °С (80 % через 10 дней). Поэтому в нашей работе изменение численности микроорганизмов при хранении биомассы с различными консервантами при 2-4 °С проверяли через 7, 14, 30 и 60 дней (табл. 1-3). Причём, было изучено хранение клеток, полученных в фазе замедления роста, и клеток, выращенных до стационарной фазы роста.
Из данных табл. 1 и 2, следует, что клетки бактерий Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) могут удовлетворительно храниться в таких условия не более двух недель. За этот период процент живых клеток уменьшился до 43 % для бензоата. Однако, через месяц выживаемость снизилась уже до
Таблица 1
Изменение численности и выживаемости микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) (фаза замедления роста) при хранении
Дли- тельность хранения Численность жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ/мл) и выживаемость (%)
Биомасса Биомасса + фосфатный буфер Биомасса + сахароза
0 дней (4,2±0,6)хЮ10 (100%)
7 дней (2,9±0,4)хЮ10 69 (2,9±0,6)хЮ10 69 (9,0±1,1)х109 22
14 дней (5,1±0,5)х109 12 (1,3±0,4)хЮ10 31 (2,3±0,4)х108 0,6
30 дней (1,8±0,3)х108 0,4 (2,0±0,5)х108 0,5 (1,1±0,3)х108 0,3
60 дней (2,8±0,4)х106 0,007 (4,0±0,3)х106 0,010 (3,8±0,3)х105 0,001
Таблица 2
Изменение численности и выживаемости микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) (стационарная фаза роста) при хранении
Дли- тельность хранения Численность жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ/мл) и выживаемость (%)
Биомасса Биомасса + бензоат Биомасса + глутамат
0 дней (1,1±0,2)х1011 (100%)
7 дней (8,9±0,9)хЮ10 82 (9,0±0,8)хЮ10 82 (7,3±0,8)хЮ10 66
14 дней (4,3±0,4)хЮ10 31 (4,7±0,5)хЮ10 43 (2,6±0,3)хЮ10 24
30 дней (2,0±0,3)х109 1,8 (4,0±0,3)х109 3,6 (3,0±0,4)х109 2,7
60 дней (9,0±0,7)х107 0,08 (1,9±0,3)х108 0,17 (1,6±0,2)х108 0,15
3,6%, при этом концентрация клеток была 1.0x109 КОЕ/мл. Исходя из оптимальной численности бактерий в биомассе не менее 1хЮ10 КОЕ/мл для
применения в биопрепарате, очевидно, что хранить биомассу в данных условиях более двух недель не целесообразно. Из данных табл. 1 и 2 и рис. 1 следует, что биомасса, полученная в результате ферментации, остановленной в стационарной фазе роста, имеет лучшие показатели по сохранению численности живых клеток при хранении. В контроле через 14 дней выживаемость составила 39%, а для клеток, полученных в фазе замедления роста, - 12%. Это можно объяснить тем, что в стационарной фазе скорость роста бактерий становится равной нулю, процессы метаболизма в клетках замедляются, вследствие чего выживаемость у них выше.
Время хранения, дни
Рис.1. Сравнение изменения выживаемости микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) при хранении при 2 — 4 °С с различными консервантами: 1 - биомасса, полученная в фазе замедления роста микроорганизмов; 2 - биомасса, полученная в стационарной фазе роста микроорганизмов; 3 - биомасса с 0,2 % раствором бензоата натрия, полученная в стационарной фазе роста микроорганизмов; 4 - биомасса с 20 % раствором сахарозы, полученная в фазе замедления роста
микроорганизмов
Что касается действия различных консервантов, то лучшим оказался 0,2 % раствор бензоата натрия (см. рис. 1). Сахароза является худшим консервантом. При её использовании численность микроорганизмов была ниже, чем в биомассе без консервантов.
При хранении родококков наилучшие показатели были получены при использовании бензоата в качестве консерванта (табл. 3, рис. 2), что наблюдалось и для псевдомонад. Процент выживших клеток через месяц был равен 48,5 %, а для биомассы без консервантов - 35 %. Применение сахарозы оказалось самым неэффективным, как и в случае с псевдомонадами.
В настоящей работе было установлено, что микроорганизмы рода Rhodococcus хранятся лучше Pseudomonas. Так, для биомассы родококков
Таблица 3
Изменение численности и выживаемости микроорганизмов штамма
Шьо(1ососси8 8р.Б67 при хранении
Дли- тель- ность хране- ния Численность жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ/мл) и выживаемость (%)
Биомасса Биомасса + фосфатный буфер Биомасса + сахароза Биомасса + бензоат Биомасса + глутамат
0 дней (1,3±С Ъо X О ю о о
7 дней (6,4±0,5) хЮ11 49 (7,0±0,6) хЮ11 54 (5,3±0,6) хЮ11 41 (1,2±0,3) хЮ12 92 (1,1±0,1) хЮ12 85
14 дней (5,2±0,4) хЮ11 40 (4,3±0,3) хЮ11 33 (3,1±0,5) хЮ11 24 (8,6±0,8) хЮ11 66 (7,6±0,8) хЮ11 58
30 дней (4,5±0,5) хЮ11 35 (2,5±0,6) хЮ11 19 (2,3±0,4) хЮ11 1,8 (6,3±0,6) хЮ11 48 (6,2±0,8) хЮ11 48
60 дней (1,2±0,2) хЮ10 0,9 (2,5±0,4) хЮ10 1,9 6,3±0,6) хЮ9 0,5 (3,9±0,4) хЮ10 3,0 (3,7±0,5) хЮ10 2,8
без консерванта выживаемость через месяц составила 32 %, а для псевдомонад - 1,8 % (стационарная фаза) (рис. 2).
Рис. 2. Изменение выживаемости микроорганизмов штамма Rhodococcus sp.S67 при хранении при 2 — 4 °С с различными консервантами в сравнении со штаммом Pseudomonas sp. 142NF(pNF142): 1 - биомасса Rhodococcus с 0,2 % раствором бензоата натрия; 2 - биомасса Pseudomonas с 0,2 % раствором бензоата натрия; 3 - биомасса Rhodococcus без консервантов; 4 - биомасса Rhodococcus с 20 % раствором сахарозы
Длительное хранение биомассы.
Для длительного хранения микроорганизмов обычно используют замораживание или лиофильную сушку.
В работе Борзенкова с соавт. [3] хранение биопрепарата в течение 30 дней осуществляли в виде суспензии биомассы с 10 % NaCl и добавками витаминов и осмопротектора бетаина. Температуру хранения суспензии варьировали в диапазоне от +5 до -10 °С. Оптимальной температурой хранения была -10 °С. При этих условиях не было отмечено падения численности микроорганизмов. В нашей работе численность микроорганизмов, хранящихся в замороженном виде при -20 °С, проверяли через два месяца. В качестве защитного раствора использовали 20 % раствор сахарозы, смешиваемый с биомассой в массовом отношении 1:1.
Как показывает анализ данных, представленных на рис. 3, хранение биомассы в замороженном виде позволяет сохранить значительно больше жизнеспособных микроорганизмов, чем при 2-4 °С. Таким образом, замораживание биомассы с 20 % раствором сахарозы в качестве криопротектора является хорошим способом сохранить достаточно высокую численность микроорганизмов при длительном хранении. Однако, такой способ сохранения жизнеспособности микробных клеток не всегда может быть удобен, а именно при наработке больших объёмов биомассы.
Рис. 3. Сравнение выживаемости микроорганизмов с 20 %-ным раствором сахарозы при -20 °С и без консервантов при 2-4 °С после двух месяцев хранения: 1 - биомасса Pseudomonas, полученная в фазе замедления роста микроорганизмов; 2 - биомасса Pseudomonas, полученная в стационарной фазе роста микроорганизмов; 3 - биомасса
Rhodococcus
При сублимационном высушивании клетки подвергаются воздействию различных повреждающих факторов, так что значительная часть их гибнет уже в процессе сушки. Поэтому определяли численность микроорганизмов в лиофилизированной биомассе и сравнивали полученные данные с численностью микроорганизмов до сушки.
Как видно из данных табл.4, наибольший процент выживших микроорганизмов после лиофилизации был у штамма Шюйососсия ер.867. Это свидетельствует о том, что родококки более устойчивы к различным стрессовым воздействиям, чем псевдомонады. Полученные результаты демонстрируют, что наилучшей защитной средой для псевдомонад является 20% раствор сахарозы, а для родококков является раствор, содержащий сахарозу, тио-мочевину и полиглюкин.
Известно, что выживаемость вегетативных клеток различных родов микроорганизмов выживаемость после лиофилизации варьируется в пределах 30-80%. Поэтому другие перспективные криопротекторы также могут быть использованы для повышения процента жизнеспособных клеток после сушки у псевдомонад.
Таблица 4
Сравнение эффективности действия различных защитных сред на сохранение выживаемости микроорганизмов при лиофилизации
Рвеи^огаопав эр. 142ХК(р.\К142) Шъойососсш зр.867
Защитная среда 20% р-р сахарозы Раствор №1 Раствор №2 20% р-р сахарозы Раствор №1 Раствор №2
Исходная численность бактерий, КОК хм г 4,2хЮ10 1,1х10п 1,3 х1012
Численность бактерий после лиофилизации, КОК мг 6,8х109 2,8х109 1,3х109 2,4x10“ 6,8x10“ 1,7x10“
Выживаемость сразу после лиофилизации, % 16,2 2,6 0,9 18,5 52,3 13,1
Примечание: раствор №1: 4 % тиомочевины, 8 % сахарозы, 4 % поли-глюкинщраствор ЖЙ2: 6 % тиомочевины, 10 % сахарозы
Численность микроорганизмов, хранящихся в лиофилизированной форме, проверяли через два месяца хранения и сравнивали с выживаемостью в
жидкой форме (биомасса с 0,2 % р-ром бензоата) при 2-4 °С (рис. 4). Анализ результатов говорит о том, что псевдомонады и родококки хранятся лучше в лиофилизированной форме с применением сахарозы как криопротектора.
Pseudomonas sp. 142KF(pKF142) Khodococcus sp.S67
Штамм
Рис. 4. Сравнение выживаемости микроорганизмов при хранении в лиофилизированной форме и в жидкой форме через два месяца:
1 - криопротектор - 20 %-й раствор сахарозы;
2 - криопротектор - раствор 4 %-й тиомочевины, 8 %-й сахарозы,
4 %-й полиглюкина; 3 - криопротектор - раствор 6 %-й тиомочевины,
10 %-й сахарозы; 4 - биомасса в жидкой форме с 0,2 %-м р-ром
бензоата при 2-4 °С
Определение деградативной способности микроорганизмов и проверка стабильности плазмиды.
Способность микроорганизмов утилизировать нефть и её компоненты после хранения проверяли методом отпечатков. По результатам проверки, 95100 % микроорганизмов способны утилизировать нефть, ДТ или гексадекан после хранения всеми способами, исследованными в данной работе.
Для микроорганизмов рода Pseudomonas проверялась стабильность плазмиды pNF142. На ней расположены гены, контролирующие деградацию моно- и полиароматических субстратов. Поэтому утрата способности утилизировать нафталин и салицилат может быть связана с потерей плазмиды. Проверка фенотипической стабильности плазмиды меодом отпечатков на среды Эванса, содержащие показала, что способность потреблять нафталин и салицилат сохраняется у 98-100 % клеток. Это свидетельствует о стабильности плазмиды при хранении во всех исследованных условиях.
Выводы.
При краткосрочном хранении наилучшее сохранение числа жизнеспособных клеток достигается при использовании бензоата натрия в качестве консерванта. Хранение биомассы микроорганизмов при 2-4 °С с данным консервантом можно осуществлять в течение 14 дней для штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и 1 месяца для штамма Rhodococcus sp. S67. Установлено, что клетки бактерий, полученные в стационарной фазе роста, выживают лучше по сравнению с полученными в фазе замедления роста.
Для длительного хранения (более 1 месяца) биомассы были выбраны защитные среды, обеспечивающие сохранение жизнеспособности клеток: для штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) это 10 % й раствор сахарозы, для штамма Rhodococcus sp. S67 это раствор 2 % й тиомочевины, 4 % й сахарозы, 2 % го полиглюкина.
Установлено, что при длительном хранении в течение двух месяцев микроорганизмов родов Pseudomonas и Rhodococcus в лиофилизированной форме, их выживаемость превышает выживаемость при хранении в жидкой форме при 2-4 °С в течение того же срока с любым консервантом.
Библиографический список
1. Андресон Р. К. Экологические последствия загрязнения почв нефтью/ Р.К. Андре-сон, А.Х.Мукатанов, Т.Ф. Бойко // Экология. - 1980. - №6. - С. 21-25.
2. Jonathan D. van Натте. Recent Advances in Petroleum Microbiology/ D. van Hamme Jonathan, Singh Ajay and P.Owen // Ward Microbiology and Molecular Biology Reviews.-December 2003,- V. 67,- № 4. - P. 503-549.
3. Пат. RU 2114071 Cl, МКИ 6 C02F3/34, B09C1/10, C12X1 20. C12N1/26, C12Q1/02. Способ очистки почвы, природных и сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием биопрепаратов. / Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин P.P., Поспелов М.Е., Свитнев А.И. Опубл. 1998.06.27.
4. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К.Е. Долинов. - М.: Медицина, 1969.
5. Пырченкова И. А. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти / И.А. Пырченкова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 298-305.
6. Evans С. The continiuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a Chemostat / C. Evans, D. Herbert, D. Tempest // Methods in Microbiology. - 1970. - V.2 - P. 277-327.
7. Carhart G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonas putida / G. Carhart, G. Hegeman // Appl. Microbiol. - 1975. - V.30. - P. 1046.
8. Методы общей бактериологии / под ред. Герхарда [и др.]. -Т.З. - М: Мир, 1984. -264 с.
9. Пат. RU 2111246 С1, МКИ 6 C12N1/20. Способ получения биомассы аэробнорас-тущих микроорганизмов / Дербышев В.В., Глухов Н.Н., Клыков С.П., Набокова А.П., Щербаков Г.Я. Опубл. 1998.05.20.
10. Пат. ки 2180276 С1, МКИ 7 В09С1/10, С12X1 20. (’12X1 2(1 С 12X1/2(5. С12Ш:01.
Олеофильный биопрепарат, используемый для очистки нефтезагрязненной почвы / Ку-юкина М.С., Ившина И.Б. Опубл. 2002.03.10.
Поступило 15.07.2008
