CC BY
92
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 579.873.6. + 57.086.132
ОСОБЕННОСТИ КОНСЕРВАЦИИ АКТИНОБАКТЕРИЙ рода дяояососсш
Т. Н. Каменских3, М. С. Куюкина2, И. Б. ИвшинааЬ
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Определен показатель жизнеспособности лиофилизированных культур Юю<1ососс№ ввр. после длительного хранения, достаточный для восстановления клеточной популяции. Консервацию алканотрофных родококков рекомендовано производить в условиях предварительного их культивирования на питательных углеводородсодержащих средах. Экспериментально обосновано, что эффективными лиопротекторами являются сахарозо-желатиновый агар и желатиновый агар с добавлением /?/гоЛ>соссг«-биосурфактанта.
Перспектива практического использования алканотрофных микроорганизмов рода Rhodococcus sensu stricto в различных областях биотехнологии и охраны окружающей среды - от биоиндикации углеводородных залежей до интенсификации процессов биодеградации нефтяных загрязнений и биокатализа в тонком органическом синтезе - требует надежных методов гарантированного хранения культур без потери их исходных свойств. Известно, что на хранение, как правило, закладываются микроорганизмы, предварительно выращенные на богатых питательных средах. Использование таких сред для культивирования родококков, осуществляющих синтез на основе углеводородных субстратов, представляется не совсем корректным. Так, выращивание бактериальных клеток на сложных питательных средах приводит к снижению содержания клеточных липидных компонентов, облегчающих потребление гидрофобного углеводородного субстрата (Милько, Егоров, 1991; Коронелли и др., 1993, 1994), повышению антибиотикочувствительности (Ившина и др., 1990), а следовательно, к снижению конкурентноспособности, уменьшению биохимической активности организмов в отношении ряда ксенобиотиков (Ротмистров и др., 1990).
Цель настоящих исследований - разработка эффективных способов консервации и последующего хранения алканотрофных родококков с учетом их биологических особенностей.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили 53 штамма ак-тинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (Каталог штаммов..., 1994; www.ecolo-gy.psu.ru/iegmcol), принадлежащих к шести видам
Rhodococcus {R. erythropolis, R. fascians, R. "longus ", R. opacus, R. rkodochrous, R ruber).
Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА) и в жидкой минеральной среде с пропаном в качестве единственного источника углерода в газовоздушной атмосфере (1:5) (Ившина и др., 1987). Консервацию культур осуществляли методом лио-филизации - высушивания клеток в вакууме из замороженного состояния с помощью лабораторного лиофилизатора типа ОЕ-960 (Венгрия). В качестве лиопротекторов использовали сахарозо-желатиновый агар (СЖА) Файбича (10% сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агара “Difco”), трегалозо-желатиновый агар (ТЖА: 10% трегалозы, 1,5% желатина, 0,1% агара “Difco”) и желатиновый агар с добавлением биосурфактанта (БС+ЖА), полученного из штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ 235 (Kuyukina et al., 2001). Количество жизнеспособных клеток определяли методом точечных высевов по числу колониеобразующих единиц (Веслополова, 1'995). Эффективность метода хранения оценивали по показателям выживаемости и биологической активности поддерживаемых культур. Константы скорости отмирания лиофильно высушенных штаммов родококков и рациональную длительность хранения их в лиофи-лизированном состоянии рассчитывали по известным формулам (Нестеров и др., 1986; Mikata, Banno, 1989). Проверку сохранения исходных свойств культур осуществляли путем контрольного определения ключевых признаков (Методы общей бактериологии, 1983; Ившина и др., 1995). Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета компьютерных программ Microsoft Excel.
© Т.Н. Каменских, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, 2004
110
Результаты и обсуждение
Известно, что успешность лиофилизации и эффективность последующего хранения родококков существенно зависят рт условий предварительного культивирования и наличия протекторного соединения при консервации клеток (Ившина, Каменских и др., 1995; Каменских, Ившина, 20Q0). Так, изучение жизнеспособности культур, поддерживаемых в течение 2-12 лет в лиофильно высушенном состоянии, показало, что применение сахарозо-желатиновоґо агара (СЖА) в качестве протектора способствует сохранению большого числа жизнеспособных клеток родококков, предварительно выращенных на МПА (табл. 1). При этом необходимо отметить, что наиболее высокая (107-108 клеток/мл) выживаемость бактериальных клеток отмечается у пигментированных культур - представителей видов R. fascians, R. rhodochrous и R. ruber.
Таблица 1
Жизнеспособность родококков после длительного сохранения их в лиофилизированном состоянии
Штамм Длительность Число жизнеспособ-
хранения, годы ных клеток/мл
Rhodococcus
erythropolis
ИЭГМ 12 11,5 (35,1 ±0,94) х 106
ИЭГМ 16 11,5 (14,7 ± 0,61) х 105
ИЭГМ 17 11,5 (21,7 ± 0,74) х ГО6
ИЭГМ 19 11,5 (70,7+ 1,33) х 106
ИЭГМ 21 11,5 (98,6 ± 1,57) х 103
ИЭГМ 190 10,0 (15,3 ± 0,62) х 106
ИЭГМ 193 10,0 (30,9 +0,88) х 104
ИЭГМ 201 10,0 (36,0 ± 0,95) х 106
ИЭГМ 202 10,0 (12,4+ 1,76) х 104
R. fascians
ИЭГМ 35 11,5 (49,5+ 1,11) хЮ6
ИЭГМ 38 11,5 (81,6+ 1,43) хЮ6
ИЭГМ 42 11,5 (21,3 + 0,73) х106
ИЭГМ 174 10,0 (47,3 ± 1,09) х10б
ИЭГМ 178 10,0 (18,1 ±0,67) хЮ6
ИЭГМ 288 10,0 (54,8 ± 1,17) хЮ6
R. «¡ongus»
ИЭГМ 27 2,0 (3,66 ± 0,95) х 106
ИЭГМ 69 2,0 (19,1 ± 2,18) хЮ7
R. opacus
ИЭГМ 56 2,5 (14,2 ± 0,60) х 106
ИЭГМ 58 2,5 (31,0 ± 0,28) х 101
ИЭГМ 263 11 (12,2 + 0,55) х 105
R. rhodochrous
ИЭГМ 63 10,5 (32,4 ± 0,9) х 106
ИЭГМ 653 4,0 (11,4+ 1,69) хЮ7
ИЭГМ 655 4,0 (13,0 ± 0,57) хЮ4
R. ruber
ИЭГМ 77 12 (20,9 ± 2,29) х107
ИЭГМ 81 10,5 (11,3 ± 1,68) хЮ7
ИЭГМ 91. 8 (31,0 ±6,40) х 107
ИЭГМ 93 9 (64,0 ± 5,10) х 106
ИЭГМ 321 10,5 1 (59,7 ± 1,22) х106
Примечание. Приведены средние данные определения численности (клеток/мл) и 95%-ный доверительный
интервал.
Однако выборочная проверка углеводородокис-ляющей способности отдельных штаммов показала выраженное снижение исследуемой активности некоторых культур родококков. В то же время метод лиофилизации бактериальных клеток, предварительно выращенных на пропане, с применением
классического протектора (СЖА) приводит к существенному снижению срока гарантированного хранения газоокисляющих родококков (табл. 2). По нашим данным, средний срок рациональной длительности хранения пропанокисляющих штаммов составляет 7,6 лет.
Ранее нами (Каменских, 1998; Каменских, Ившина, 2000) было показано, что повышение степени устойчивости газоокисляющих родококков к длительному хранению в лиофилизированном состоянии может быть достигнуто путем изменения состава защитной среды. В частности, добавление 1 мМ ацетата-а-токоферола в качестве антиоксиданта в состав защитной среды способствует увеличению числа жизнеспособных клеток, осуществляющих окисление пропана. С целью поиска новых эффективных условий консервации алкано-трофных родококков нами было осуществлено предварительное культивирование клеток на среде с пропаном, при этом использовались новые криопротекторы - трегалозо-желатиновый агар и желатиновый агар с добавлением Rhodococcus-биосурфактанта - гликолипида трегалозы. В состав . этих соединений входит низкомолекулярный диса-харидный компонент - трегалоза, обладающая эффективным защитным действием (Волков и др., 1992; Israeli et al., 1993; Ivshina et al., 1998; Arguelles, 2000; Kuyukina et al., 2001).
По нашим данным, высокая выживаемость исследуемых культур в процессе лиофилизации достигается при использовании в качестве протектора сахарозо-желатинового или трегалозо-желатино-вого агара. Как видно из табл. 3, показатель выживаемости родококков R. ruber ИЭГМ 333, предварительно выращенных в присутствии пропана, в этих условиях опыта составляет 37-40%. С целью прогнозирования эффективности данного способа лиофилизации для длительной консервации был использован тест на ускоренное хранение. Для этого при помощи графиков Аррениуса, построенных по экспериментальным данным, определяли величины констант скорости отмирания клеток при температуре +4°С, обычно используемой для хранения лиофилизированных препаратов, а также рассчитывали рекомендуемую продолжительность хранения исследуемых культур в лиофилизирован-ном состоянии (табл. 4). Произведенные расчеты показывают, что рациональная длительность хранения родококков при условии предварительного выращивания их в присутствии пропана и использования в качестве протектора сахарозо-желатинового агара составляет более 5 лет, тогда как применение желатинового агара с добавлением Rhodococcus-Qmcyp^aKTdma способствует значительному увеличению прогнозируемого срока хранения - до 18 лет. Учитывая стабилизирующую роль трегалозы при продолжительном хранении бактериальных препаратов в лиофилизированном
112
Т. Н. Каменских, М. С. Куюкина, И. Б. Ившина
состоянии, следует отметить, что определяющим ствия с клеточными биополимерами, в частности аспектом, по-видимому, является состояние трега- липидными компонентами (Волков и др., 1992). лозы, которое существенно зависит от взаимодей-
Таблица 2
Влияние среды предварительного культивирования на жизнеспособность лиофилизированных культур R. ruber при хранении в течение 1-9 лет
Среда lg числа жизнеспособных клеток
Штаммы культи- сразу после через 1 через 3 через 6-7 через 8-9 к, РДХ,
вирова- лиофилиза- год хра- года лет хране- лет хране- ГОД1 годы
ния ции нения хранения ния ния
ИЭГМ 71 1 7,79 - - 6,72 - 0,18 28,3
2 7,75 6,48 - - 2,23 0,61 8,3
ИЭГМ 74 1 9,65 8,23 - - 6,79 0,21 26,3
2 8,00 7,15 5,80 - - 0,73 7,3
ИЭГМ 83 1 8,84 7,76 - 7,83 - 0,14 43,9
2 7,54 6,60 - - 3,94 0,40 12,0
ИЭГМ 84 1 8,71 7,88 - 7,63 - 0,18 33,4
2 6,80 6,25 3,50 - 0,00 1,10 3,7
ИЭГМ 87 1 9,67 7,62 - 8,18 - 0,25 27,9
2 10,11 7,00 - - 0,00 3,11 2,4
ИЭГМ 333 1 9,79 8,54 - 7,38 - 0,19 30,7
2 8,97 6,70 - - 4,18 0,53 11,8
Примечание. нет данных. 1- мясопептонный агар; 2 - минеральная среда с пропаном отмирания лиофильно высушенных культур родококков. РДХ - рациональная длительность
, К - константы скорости хранения культур.
Таблица 3
Выживаемость газоокисляющих родококков R. ruber ИЭГМ 333 в зависимости от условий лиофилизации
Крио- протек- тор СЖА Число жизнеспособных клеток/мл Выживаемость, %
до лиофилизации сразу после лиофилизации
3,4 х 105 (34,4±2,62)х104 1,4 х 105 (13,8±1,66)х104 40,1
ТЖА 3,4 х 10s (34,4±2,62)х104 1,3 х 105 (13,0±1,61)х104 37,8
БС+ЖА 3,4 х 105 (34,4±2,62)х104 3,0 х 104 (З0,1±2,45)х103 8,8
Примечание. Здесь и в табл. 4 СЖА - сахарозожелатиновый агар; ТЖА - трегалозо-желатиновый агар; БС+ЖА - желатиновый агар с добавлением ЙЛо^ососсыз-биосурфактанта.
Таблица 4
Прогноз выживаемости R. ruber ИЭГМ 333 в зависимости от криопротектора и среды предварительного культивирования родококков
Среда культивирования / К, год1 РДХ, го-
криопротектор ды
С3 / СЖА -2,9 5,1
С3 /ТЖА -3,1 7,8
С3 / БС+ЖА -3,6 17,9
Примечание. С3 - минеральная среда с пропаном в качестве единственного источника углерода и энергии.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что для гарантированного сохранения биохимической активности газоокисляющих родококков целесообразно проводить консервацию в условиях предварительного культивирования их на углеводородсодержащей среде. При этом наиболее эффективным протектором для
лиофилизации газоокисляющих родококков является желатиновый агар с добавлением ЯАос/ососсги-биосурфактантов.
Библиографический список
Веслополова Е.Ф. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов // Микробиология. 1995. Т. 64, № 2. С. 279-284. Волков В.Я., Сахаров Б.В., Щепкин В.Д., Федюкина Г.Н., Кашуба A.A. О природе устойчивости клеток дрожжей к высушиванию // Микробиология. 1992. Т. 61, вып. 2. С. 214-222.
Ившина И.Б., Бердичевская М.В., Зверева Л.В., Рыбалка J1.B., Еловикова Е.А. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем // Микробиология. 1995. Т. 64, №4. с. 507-513.
Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Козырева Г.И. Ан-тибиотикочувствительность родококков, культивируемых на разных средах // Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций. Свердловск, 1990. С. 92-98.
Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин O.A., Чумаков ОБ. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков // Микробиология. 1995. Т. 64, вып. 1. С. 118-128. Ившина И.Б., Пшеничное P.A., Оборин A.A. Про-панокисляющие родококки. Свердловск, 1987. Каменских Т.Н. Консервация и гарантированное сохранение родококков ex situ: Дис... канд. биол. наук. Пермь, 1998.
Каменских Т.Н., Ившина И.Б. Консервация и гарантированное сохранение бактерий рода Rhodococcus // Вестник Перм. ун-та. 2000. Вып. 2. Биология. С. 122-130.
Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.
Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Юферева С.Г., Ильинский В.В., Чивкунова О.Б., Розынов Б.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий среды // Микробиология. 1993. Т. 62, вып. 2. С. 231-237.
Коронелли Т.В., Дермичева СТ., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63, вып. 5. С. 917-922.
Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Гер-хардта и др. М.: Мир, 1983. Т. 1,2.
Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-воМГУ, 1991.
Нестеров А.И., Кошелев A.B., Гальченко В.Ф., Иванов М.В. Выживаемость облигатных мета-нотрофных бактерий при лиофилизации и последующем хранении // Микробиология. 1986. Т. 55, вып. 2. С. 271-277.
Ротмистров М.Н., Ставская С.С., Татанова Л.А., Григорьева Т.Ю., Тренина Г.А., Ключева М.В., Емцева Т. В. Хранение псевдомонад, разлагающих поверхностно-активные вещества // Микробиология. 1990. Т. 59, вып. 1.С. 156-161.
Arguelles J.C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts: a comparative analysis // Arch. Microbiol. 2000. Vol. 174. P. 217-224.
Israeli E., Shaffer B.T., Ligthart B. Protection of freeze-dried Escherichia coli by trehalose upon exposure to environmental conditions // Cryobiology. 1993. Vol. 30. P. 519-523.
Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Philp J.C., Christofi N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species // World J. Microbiol. Biotech-nol. 1998. Vol. 14. P. 711-717.
Mikata K, Banno I. Preservation of yeast cultures by L-diying viability after 5 years of storage at 5°C // EFO Research Communications. 1989. № 14. P. 80-103.
Kuyukina M.S., Ivshina IB., Philp J.C., Christofi N., Dunbar S.A., Ritchkova M.I. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiaiy-butyl ether extraction // J. Microbiol. Methods. 2001. Vol. 46, №2. P. 149-156.
Работа поддержана грантом программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Биологические ресурсы”.
Some features in preserving actinobacteria of the genus Rhodococcus
T.N. Kamenskikh, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina
The viability level necessary to recover cell populations upon long-term storage was measured. It is recommended to preserve alkanotrophic rhodococci pre-cultivated on nutrient hydrocarbon-containing media. The duration of rhodococci storage could be increased with the helot protectants. The most effective lyoprotectants are shown to be a sucrose-gelatine agar or gelatine agar supplemented with ÆAoi/ococcztf-biosurfactants.
