CC BY
58
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2009. Вып. 2. С. 230-238
Химия =
УДК 577.15
Очистка салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)
Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, А.П. Соколов, К.А. Понаморев,
К.В. Петриков, В.А. Алферов
Аннотация. Из штамма Pseudomonas sp. 142NF, содержащего плазмиду pNF142, несущую pDTGl-нодобный ген nahG, была выделена и очищена салицилатгидроксилаза (ЕС: 1.14.13.1). Путем комбинации ионообменной, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации фермент был очищен более чем в 270 раз с выходом около 25%. Очищенный фермент был гомогенным и имел удельную активность 7,55 Ед/мг белка.
Ключевые снова: салицилатгидроксилаза, очистка фермента, Pseudomonas, салицилат.
Введение
Гидроксилазы ароматических соединений являются объектом биохимических и генетических исследований не только в силу их важной роли в процессах детоксикации, но также как превосходные системы для изучения механизмов ферментативного включения молекулярного кислорода в молекулу субстрата.
Фермент салицилатгидроксилаза относится к классу оксидорсдуктаз, является 1-монооксигеназой и катализирует гидроксилирование и одновременное декарбоксилирование салицилата в присутствии НАДИ, приводящее к образованию катехола (рис. 1), т.е. одну из реакций пути биодеградации нафталина и сходных с ним полициклических ароматических углеводородов.
Салицилатгидроксилаза штамма Pseudomonas putida S-1 была первой флавинсодсржащей монооксигеназой, которая была охарактеризована в [1]. В последующем этот фермент был очищен из трех других штаммов псевдомонад Pseudomonas sp. АТСС 29352 [2] Pseudomonas sp. АТСС 29351 [3] и Pseudomonas cepacia [4]. Все эти салицилатгидроксилазы содержали FAD в качестве кофактора и катализировали гидроксилирование и одновременное
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты Ш 08-04-99019-р_офи, Ш 08-04-90028-Бел_а).
дскарбоксилированис салицилата с образованием катсхола. Для многих са-лицилатгидроксилаз показана широкая субстратная специфичность [1-3, 5].
салицилат +02+2Н+ + Н20 катехол
Рис. 1. Реакция, катализируемая салицилатгидроксилазой
Биохимические исследования салнцилатгидроксилаз в последнее десятилетие были дополнены активными генетическими исследованиями [6]. В лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН) был проведен анализ генов салнцилатгидроксилаз (nah G) штаммов-деструкторов полицикличе-ских ароматических углеводородов [7] и было показано, что практически во всех проанализированных образцах прошла амплификация генов nahG со специфичными праймерами. У исследованных штаммов было обнаружено шесть типов последовательностей nahG генов: NAH7, pDTGl, AN10, KF715, А88 и NKNS [7]. Оказалось, что в 32 изучаемых штаммах присутствует ген салицилатгидроксилазы, аналогичный nahG плазмиды pDTGl (тип pDTGl), у четырех штаммов — хромосомному гену у штамма P. stutzeri AN10 (тип AN10), у четырех — P. putida KF715 (тип KF715) и только у двух (37NF и А24) - NAH7 (тип NAH7).
В литературе пет данных по выделению и характеристике салицилат-гидроксилаз, гены которых относятся к группе pDTGl-подобных nahG генов. Выделение салицилатгидроксилазы из штамма Pseudomonas sp. 142 NF с плазмидой pNF142, содержащей pDTGl-подобный nahG ген, позволит сравнить свойства фермента с уже имеющимися данными для ферментов других групп салнцилатгидроксилаз и провести анализ того, как изменения в структуре гена приводят к изменению свойств фермента и его субстратной специфичности, т. с. как происходит процесс адаптации бактерий к новым условиям загрязнения.
1. Методика эксперимента
В работе использовался штамм Pseudomonas sp 142NF (pNF142) из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, г. Пущино.
Микроорганизмы выращивали в ферментере с богатой средой, содержащей кислотный гидролизат казеина — 10 г/л; дрожжевой автолизат — 70 г/л; (NH4)S04 — 6 г/л; К2НРО4 — 12 г/л; глюкоза — 20 г/л; MgS04 — 0,3 г/л;
Мп804 — 0,05 г/л; псногаситсль «СОФЭКСИЛ» — 0,8 мл/л. Индукцию фермента проводили добавлением салицилата 0,2 г/л в конце логарифмической фазы роста культуры [8].
Очистка фермента. Все стадии очистки проводились при +4 °С, если не оговорено особо. Размеры всех колонок указаны в виде высота х внутренний диаметр. Все буферные растворы содержали 0,1 мМ фенилмстилсульфонил-фторид и 0,5 мМ дитиотриэтол. В процессе очистки фермент терял кофактор РАБ и становился не активным. Для восстановления активности в раствор фермента добавляли РАБ.
Стадия 1: разрушение клеток и удаление нуклеиновых кислот.
Бактериальные клетки (35 г) размораживали при 7 °С, затем добавляли в 20 мл 20 мМ калиевого фосфатного буфера, pH 7,5. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе М8Е150 на максимальной мощности по 5 мл 3 х 30 секунд и центрифугировали при 12000 й', 4 °С 20 минут. К супернатанту добавляли стрептомицин (5-10 мг/мл), давали постоять 20 минут, затем препарат центрифугировали при 12000 4 °С в течение 40
минут. Полученный супернатант использовали в качестве бесклеточного экстракта.
Стадия 2: ионообменная хроматография. Бесклсточный экстракт наносили на колонку (14 см х 1,6 см), заполненную БЕАЕ-Тоуореагі 650-М, и предварительно уравновешенную 20 мМ фосфатом калия, pH 7,5. Колонка была промыта 25 мл того же буфера и фермент элюировали 200 мл линейного градиента с концентраций фосфатного буфера pH 7,5 от 20 мМ до 400 мМ на скорости 80 мл/час. Собирали фракции по 6,7 мл. Фракции с самой высокой активностью объединяли и добавляли КС1 до конечной концентрации 1М.
Стадия 3: гидрофобная хроматография. Объединенные фракции предыдущей стадии были нанесены на колонку (11 см х 0,9 см), заполненную гидрофобным сорбентом РЬспуІ-ЗерЬагозе СЬ-бВ, предварительно уравновешенную 200 мМ фосфатным буфером pH 7,5, содержащим ЇМ КС1. Колонку промывали 15 мл этого же буфера, затем создавали градиент КС1 от 1М до 0 в 200 мМ фосфатном буфере pH 7,5; затем создавали градиент этиленгликоля от 0 до 10% в 200 мМ фосфатном буфере pH 7,5. После этого создавали линейный градиент от 200 мМ фосфатного буфера pH 7,5 с 10% этиленгликоля до 10 мМ буфера Трис/НС1 pH 8 с 10% этиленгликоля, после этого продолжая элюирование 25 мл 10 мМ буфера Трис/НС1 pH = 8 с 10% этиленгликоля. Элюирование вели при скорости 25 мл/час. Фракции с пиковой активностью фермента были объединены.
Стадия 4: гель-фильтрация. В объединенную фракцию объемом 4 мл, полученную после гидрофобной хроматографии, добавляли для вязкости 700 мг сахарозы и осторожно наносили на колонку (80см х 1,6см), заполненную ЗерЬасгуІ 8-200, и уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером pH = 7,5. Фермент элюировали тем же буфером на скорости 40 мл/час. Фракции с активностью фермента не объединяли.
Определение активности салицилатгидроксилазы. Активность салици-латгидроксилазы определяли спсктрофотометрически на спектрофотометре UV-160A (Shimadzu, Япония) по уменьшению экстинкции НАДН в реакционной смеси, содержащей 100 мкМ НАДН, 10 мкМ FAD и 100 мкМ сали-цилат, бесклсточный экстракт и 0.05 М фосфатный буфер pH 7.5 (Л = 340 нм, s = 6.220 мМ”1 • см-1) [9]. Удельную активность фермента выражали в микромолях потребленного НАДН в минуту (Ед) на мг белка, учитывая эндогенное окисление НАДН.
Определение содержания белка. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [10] с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в качестве стандарта. Содержание белка в элюатс из хроматографических колонок определялось при 280 нм.
Электрофорез в полиакриламидном геле. Гомогенность белка и молекулярную массу субъединиц определяли посредством электрофореза в присутствии SDS в полиакриламидном геле (12,5%). Электрофорез проводили при максимальном напряжении 150 В в течение 3 часов. Белки окрашивали красителем кумасси G 250 в растворе, содержащем 30% этанола, 10% уксусной кислоты. Гель отмывали тем же раствором без красителя.
2. Результаты и их обсуждение
Для получения биомассы культуру выращивали в ферментере на богатой среде в условиях периодического культивирования, для индукции салицилатгидроксилазы в конце логарифмической фазы роста добавляли салицилат.
Очистка фермента салицилатгидроксилазы проводилась в три этапа: ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография,
гель-фильтрация.
На первом этапе для очистки салицилатгидроксилазы использовали ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl 650-М. Салицилат-гидрокси-лаза элюировалась при концентрации 100 мМ фосфатного буфера. Данные по результатам ионообменной хроматографии приведены на рис. 2.
Для дальнейшей очистки на втором этапе использовали гидрофобную хроматографию, в качестве носителя применяли Phenyl-Sepharose CL-6B. При снижении концентрации КС1 с 1М до 0 белок с носителя не элюировался. Далее, для снижения гидрофобности мы использовали фосфатный буфер с этиленгликолем, однако белок по-прежнему оставался связанным с носителем. Затем мы использовали 10 мМ буфер трисНО pH 8 с этиленгликолем, и после изменения pH белок сошел с колонки. Данные по результатам гидрофобной хроматографии представлены на рис. 3.
На третьем этапе белок очищали от примесей, используя гель-фильтрацию на носителе Sephacryl S-200. Фермент элюировался в объеме 85 мл. Данные по результатам гель-фильтрации представлены на рис. 4.
О 20 40 60 80 100 120 140 160
V. мл
—•— А (280 нм)
—■— Активность, Ед/мл ---- Градиент фосфатного буфера pH 7,5. мМ
Рис. 2. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl 650-М
О 20 40 60 80 100
V, мл
—•— А (280 нм)
—■— Активность фермента, Ед/мл
---- Г радиент фосфатного буфера pH 7,5, мМ
----Г радиент Трнс/НС1 pH 8,0, мМ
-----Градиент KCI, от IM до О
-----Градиент птиленглнколя от 0 до 10%
Рис. 3. Гидрофобная хроматография на носителе Phenyl-Sepharose CL-6B
Степень очистки фермента от посторонних белков мы контролировали с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза, результаты которого представлены на рис. 5.
На электрофореграмме (рис. 5) видно, что после ионообменной и гидрофобной хроматографии препарат содержит посторонние белки. Только после проведения гель-фильтрации получен гомогенный препарат фермента. Молекулярная масса салицилатгидроксилазы по данным SDS-электрофореза составляет 46 кДа.
Данные по очистке фермента представлены в табл. 1.
Оптическая плотность Удельная активность, Ед/мг белка
Рис. 4. Гель-фильтрация на носителе Sephacryl S-200
Рис. -5. Электрофореграмма образцов препарата на различных стадиях очистки: 1 — маркерные белки (Fermentas), 2 — препарат после ионообменной хроматографии, 3 — после гидрофобной хроматографии, 4, 5, 6 — отдельные фракции после гель-фильтрации
Активность салицилатгидроксилазы в бссклсточном экстракте составляет
0,11 Ед/мг белка. После ионообменной хроматографии фермент был очищен более чем в 4 раза, а его потери составили менее 20%. Гидрофобная хроматография оказалась более эффективной. Фермент на этой стадии был очищен почти в 8 раз, но его потери составили около 50%. После гель-фильтрация фермент был очищен тоже почти в 8 раз, примерно так же, как и после гидрофобной хроматографии, но его потери во время гель-фильтрации оказались чуть меньше, около 40%. В результате трех стадий очистки был получен гомогенный препарат. Учитывая, что выход фермента составил 24,7%, содержание его в неочищенном гомогенате составляет порядка 1,5% от всех растворимых
Таблица 1. Очистка салицилатгидроксилазы Pseudomonas sp. 142NF (pNF 142)
Этаны очистки Концен- трация белка, мг/мл Количе- ство белка, мг Количе- ство фермента, Ед Удельная актив- ность, Ед/мг Выход, % Степень очистки
Весклет. экстракт 16,70 367,4 40,4 0,11 100 1,0
DEAE- Toyopearl 4,62 83,16 32,43 0,39 80,3 4,4
Phenyl- Sepharose 2,64 10,56 16,37 1,55 40,5 34,8
Sephacryl 0,33 1,32 9,97 7,55 24,7 278
клеточных белков, что сравнимо с данными, полученными в работе Ramsay et al. [11].
Вопросу очистки фермента салицилатгидроксилазы посвящено не так много работ. Так, в работе Banat et al. [12] использовали сочетание ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, в работе Ramsay et al. [11] использовали сочетание ионообменной и гидрофобной хроматографии, а в работе Balashova et al. [13] — сочетание ионообменной, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации для очистки белка. В нашей работе использование сочетания ионообменной и гидрофобной хроматографии позволило очистить препарат салицилатгидроксилазы в примерно 35 раз, что несколько ниже чем в работе Ramsay et al. [11], в которой препарат был очищен в 54 раза. Чтобы добиться высокой степени очистки фермента, мы дополнительно использовали гель-фильтрацию. В итоге фермент салицилатгидроксилаза был очищен 278-кратно с общим выходом 24,7%. Его удельная активность составила 7,55 Ед/мг белка.
Список литературы
1. Yamamoto S., Katagiri М., Maeno H., Hayaishi О Salicylate hydroxylase, monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. Purification and general properties // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. P. 3408-3413.
2. White-Stevens R.H., Kamin H. Studies of a flavopritein, salicylate hydroxylase. Preparation, properties, and the uncoupling of oxygen reduction from hydroxylation Ц J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 2358-2370.
3. Presswood R.P., Kamin H. Reactions of reduced form of salicylate hydroxylase in Flavins and flavoproteins / T.P. Singer ed., Elsevier. Amsterdam. 1976. P. 145-154.
4. Wang L.-H., Tu S.-С., Lusk R.C. Apoenzyme of Pseudomonas cepacia salicylate hydroxylase // J. Biol. Chem. 1984. V. 259.>. 1136-1142.
5. Bosch R., Moore E.R.B., Garcia-Valdes E., Pieper D.H. NahW, a Novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN 10 //J. Bacterid. 1999. V. 181. P. 2315-2322.
6. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Воронин А.М. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorés cens ü Микробиология, 2005. Т. 74, № 1. С. 70-78.
7. Кошелева И.А., Измалкова Т.Ю., Соколов С.Л., Сазонова О.И., Воронин А.М. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полициклических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas putida ü Генетика. 2003. Т. 39, № 9. С. 997-1004.
8. Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус И.Ф., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Среды и условия культивирования Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) для получения биомассы с максимальной активностью фермента салицилатгидроксилазы // Известия Тульского государственного университета. Серия Естественные науки. 2008. Выи. Ï. С. 197-203.
9. Kiyohara H., Nagao К. The Catabolism of Phenantrene and Naphthalene by Bacteria ¡I J. Gen. Microbiol. 1978. V. 105. P. 69-75.
10. Bredford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantity of protein utilizing the principle of proteindye binding // Ann. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
11. Ramsay J.R., McEntee I.B., Hammond P.M. Production and purification of salicylate monooxygenase from Pseudomonas cepacia ATCC 29351 // Bioseparation. 1992. V. 2. P. 375-383.
12. Banat I.М., Marchant A., Nigam P., Gaston S.J.S., Kelly B.A., Marchant К. Production, partial characterization, and potential diagnostic use of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida UUC-1 // Enzyme Microbial Technology. 1994. V. 16. P. 665-670.
13. Balashova N. V., Stolz A., Knackmuss H-J., Kosheleva LA., Naumov A. V., Boronin A.M. Purification and characterization of a salicylate hydroxylase involved in 1-hydroxy-2-naphthoic acid hydroxylation from the naphthalene and phenanthrene-regrading bacterial strain Pseudomonas putida BS202-P1 // Biodégradation. 2001. V. 12. P. 179-188.
Поступило 25.05.2009
Власова Елена Павловна ([email protected]), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Пунтус Ирина Филипповна, к.б.н., научный сотрудник, лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, Московская обл.
Соколов Александр Павлович, к.б.н., старший научный сотрудник, отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, Московская обл.
Понаморев Константин Алексеевич ([email protected]), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Петриков Кирилл Владимирович ([email protected]), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Алферов Валерий Анатольевич ([email protected]), к.х.н., профессор, зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Purification of salicylate hydroxylase from Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)
E.P. Vlasova, I.F. Puntus, A.P. Sokolov, K.A. Ponamorcv, K.V. Pctrikov,
V.A. Alferov
Abstract. Salicylate hydroxylase (EC: 1.14.13.1) has been purified from strain Pseudomonas sp. 142NF contained the plasmid pNF142 with pDTG 1-like nahG gene. The enzyme was purified over 270-fold, with a recovery of about 25%, by a combination of ion exchange, hydrophobic interaction chromatography and gcl-filtration. The purified enzyme was homogeneous and had a specific activity of 7,55 U/'mg protein.
Keywords: salicylate hydroxylase, enzyme purification, Pseudomonas, salicylate.
Vlasova Elena ([email protected]), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Puntus Irina, candidate of chemical sciences, rcscarchcr, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS, Pushchino, Moscow Region.
Sokolov Aleksande-r, candidate of chemical sciences, senior rcscarchcr, department of all-russian collection of microorganisms, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms RAS , Pushchino, Moscow Region.
Ponamirev Konstantin ([email protected]), student, department of chemistry, Tula State University.
Petrikov Kirill ([email protected]), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Alferov Valeriy ([email protected]), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.
