Содержание флавоноидов в некоторых видах рода Euphorbia L Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 581.192.2:582.757.2

СОДЕРЖАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В НЕКОТОРЫХ ВИДАХ РОДА EUPHORBIA L.

© Е.А. Карпова , Е.П. Храмова, Г.И. Высочина

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолинская,

101, Новосибирск, 630090 (Россия) E-mail: karpova@csbg.nsc.ru

Определено содержание гликозидов и агликонов флавоноидов в надземной части растений 6 видов Euphorbia L. из секции Esula и 3 видов из секции Tulocarpa хроматоспектрофотометрическим методом. Содержание гликозидов составило 0,92-3,63% для видов секции Esula и 0,46-1,12% для видов секции Tulocarpa, агликонов - 0,04-0,34% и 0,04-0,45% соответственно. В надземной части растений интродуцированного вида E. polychroma гликозидов и агликонов флавоноидов 1,29 и 0,21% соответственно.

Изучена сезонная динамика содержания гликозидов кверцетина, кемпферола и неидентифицированного флавоноло-вого агликона (k max 259, 362) в надземной части растений дикорастущего вида E. virgata и интродуцированного вида E. polychroma.

Ключевые слова: Euphorbia, флавоноиды, флавонолы, кверцетин, кемпферол.

Введение

Фитохимическое исследование видов рода Euphorbia L. представляет интерес в связи с наличием в них соединений с высокой биологической активностью, имеющих значительный потенциал для медицинского использования. В литературе имеются сведения о медицинском применении молочаев при более чем 30 заболеваниях [1]. При этом было показано, что биологическая активность, в частности противовоспалительное [2], антимикробное [3], фунгицидное [4], антилейкемическое [5, 6] и спазмолитическое действие [7], связана прежде всего с полифенольным комплексом [8, 9].

Актуальность исследования полифенольных соединений рода молочай определяется также возможностью их использования для решения проблем хемотаксономии рода и необходимостью включения химических признаков в систему анализа филогенетических связей [10].

На территории бывшего СССР известно около 200 видов молочаев [11]. В Сибири распространено около 30 видов, относящихся главным образом к 3 секциям крупнейшего подрода Северной Азии Esula Pers.: Esula Dumort., Tulocarpa (Raf.) Prokh. и Holophyllum (Prokh.) Prokh.

Перспективы применения фенольных соединений в хемотаксономии рода Euphorbia определяются наличием фенольных веществ различной природы - флавонов, флавонолов, флавононов, фенолкарбоновых кислот, кума-ринов [4]. В составе флавонолов найдены агликоны: кверцетин, кемпферол, мирицетин, рамнетин, изорамнетин и их 3-гликозиды: глюкозиды, рамнозиды, рутинозиды, глюкурониды, галактозиды [12-15], а также галлаты галак-тозидов кверцетина [16]. При этом сведения о фенольных соединениях сибирских видов крайне ограничены и касаются главным образом содержания суммарных фракций флавоноидов и кумаринов [17, 18].

Цель исследования - определение содержания флавоноидов в образцах видов Euphorbia, а также изучение изменчивости состава и содержания флавонолгликозидов.

В задачи исследования входило определение содержания флавоноидов в надземной части 10 видов рода Euphorbia - из секции Esula Dumort.: E. esula L., E. subcordata Ledeb., E. virgata Waldst. et Kit., E. chancoana Worosch., E. mandshurica Maxim., E. leoncroizatii (Hurusawa) Oudejans; из секции Tulocarpa (Raf.) Prokh.):

* Автор, с которым следует вести переписку.

E. lutescens Ledeb., E. soongarica Boiss., E. pachyrhiza Kar. et. Kir.; содержания флавоноидов в надземной части интродуцированного вида E. polychroma Kern.; исследование сезонной изменчивости состава флавонолг-ликозидов в надземной части растений дикорастущего вида E. virgata (Бердск, Новосибирская обл.) и ин-тродуцированного - E. polychroma (территория ЦСБС СО РАН).

Экспериментальная часть

Хроматоспектрофотометрическим методом [i9, с. 32-33] определяли содержание флавоноидов в надземной части растений i0 видов рода Euphorbia: E. polychroma (европейский вид [20, с. 3б4-3б5], интродуциро-ванный в ЦСБС СО РАН, 200б г.), E. esula (Алтайский край, Алтайский р-н, i993 г.), E. subcordata (Восточный Казахстан, хр. Саур, i998 г.), E. virgata (г. Бердск, Новосибирская обл., 2002 г.), E. chancoana (Приморский край, Ханкайский р-н, оз. Ханка, 2004 г.), E. mandshurica (Приморский край, Октябрьский р-н, 2004 г.), E. leon-croizatii (Приморский край, Ханкайский р-н, 2004 г.), E. lutescens (Респ. Алтай, Семинский перевал, 2003 г.), E. soongarica (Вост. Казахстан, Зайсанский р-н, i998 г.), E. pachyrhiza (Вост. Казахстан, хр. Манрак, i998 г.).

Образцы для анализа были собраны в фазе плодоношения (из гербария лаборатории систематики и флорогене-тики ЦСБС, за исключением E. virgata, E. lutescens и E. polychroma).

Содержание флавонолгликозидов в надземной части растений дикорастущего вида E. virgata (г. Бердск, Новосибирская обл.) и интродуцированного вида E. polychroma (территория ЦСБС СО РАН) определяли в различные фазы вегетации растений в 200б г.

Точную навеску воздушно-сухого сырья (0, i-0,5 г) измельчали и исчерпывающе экстрагировали 70%-ным водным этанолом на кипящей водяной бане. Объединенные извлечения концентрировали под вакуумом до полного удаления спирта и освобождали от липофильных соединений хлороформом. Водный остаток использовали для определения содержания флавонолов.

Для двумерной хроматографии экстрактов на бумаге использовали системы: н-бутанол - уксусная кислота - вода (40 : i2 : 28) (БУВ) (первое направление) и дистиллированная вода (второе направление) [2i, с. 4i]. Гидролиз гликозидов проводили 2 N соляной кислотой в течение 2 ч на кипящей водяной бане. Для двумерной хроматографии гидролизатов на бумаге использовали системы: н-бутанол - уксусная кислота - вода (40 : i2 : 28) (БУВ) (первое направление) и уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (i0 : 2 : 3) (второе направление).

Оптическую плотность полученных элюатов определяли на спектрофотометре СФ-2б при длине волны 3б5 нм (для гликозидов) и 370 нм (для агликонов). Для построения калибровочного графика использовали растворы рутина в 40% этаноле и кверцетина в 9б% этаноле.

Для определения содержания флавонолгликозидов в образцах (отдельно гликозидов кверцетина, кемп-ферола и неидентифицированного компонента A) при изучении сезонной динамики E. virgata и E. polychroma проводили анализ агликонов, образующихся после кислотного гидролиза соответствующих гликозидов методом ВЭЖХ [22, 23].

Кислотный гидролиз: к 0,5 мл водно-этанольного растительного экстракта прибавляли 0,5 мл HCl (2 н) и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения разбавленный экстракт пропускали через концентрирующий патрон Диапак Об (ЗАО «БиоХимМак») для освобождения от примесей гидрофильной природы, затем агликоны смывали 9б%-ным этанолом.

Анализ гидролизатов проводили на аналитической ВЭЖХ-системе, состоящей из жидкостного хроматографа “Agilent ii00” с УФ-спектрофотометрическим детектором и системы для сбора и обработки хроматографических данных (Германия). Разделение осуществляли на колонке Hypersil ODS размером 125x2,0 мм с октадецилсиликагелем (С 18) с диаметром частиц 3 мкм при градиентном режиме элюирования. В подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0,1%) изменялось от 45 до 48% за i8 мин. Скорость потока элюента - 0,2 мл/мин. Объем вводимой пробы - 3 мкл. Температура колонки -35 °С. Детектирование - при К 3б0 нм. Перед использованием подвижную фазу фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Для приготовления подвижных фаз и экстракции применяли метанол (ос.ч.), ортофосфорную кислоту (ос.ч.), бидистиллированную деионизированную воду. Стандартные растворы готовили в концентрации І0 мкг/мл. Стандарты кверцетина, кемпферола - производства фирмы «Fluka».

Количественное определение индивидуальных компонентов проводили по методу внешнего стандарта как наиболее оптимальному для хроматографического анализа многокомпонентных смесей [22].

Суммарное содержание флавонолгликозидов (отдельно гликозидов кверцетина, кемпферола и компонента A) рассчитывали по содержанию агликонов, образующихся после кислотного гидролиза, применяя известные из литературных данных коэффициенты для пересчета концентрации агликона на концентрацию соответствующего гликозида: 2,504 - для кверцетина и 2,588 - для кемпферола [22, 23]. Для расчета содержания гликозидов неиден-тифицированного агликона А использовали коэффициент пересчета для кверцетина.

Идентификацию веществ проводили по данным качественных реакций, УФ-спектроскопии [24], а также методом сравнения с достоверными образцами.

Компонент А выделяли методами хроматографии на колонке с силикагелем и препаративной хроматографии на бумаге. УФ-спектр, спектры с ионизирующими добавками и комплексообразователями сняты на спектрофотометре Specord UV VIS.

Изменчивость состава агликонов флавонолов надземной части растений дикорастущего вида E. virgata изучали в 200б г. в фазах начала вегетации (29.05), бутонизации (0б.0б), цветения (2І.0б), плодоношения (08.07) и конца вегетации (І0.09); интродуцированного вида E. polychroma - в фазах начала вегетации (29.05), цветения (0б.0б), плодоношения (І5.08) и конца вегетации (22.09).

Обсуждение результатов

Содержание гликозидов флавоноидов в надземной части растений исследованных образцов Euphorbia составило 0,4б-3,б3% (рис. І). Максимальное содержание гликозидов флавоноидов обнаружено в надземной части E. chancoana, минимальное - в надземной части E. pachyrhiza.

В надземной части растений видов секции Esula содержание гликозидов флавоноидов составило 0,92-3,б3%, а видов секции Tulocarpa - 0,4-І,І2%. Таким образом, для видов секции Esula в целом характерно более высокое содержание гликозидов флавоноидов по сравнению с видами секции Tulocarpa.

Содержание агликонов флавоноидов в надземной части растений видов секции Esula составило: 0,04% (E. esula) - 0,34% (E. chancoana), а видов секции Tulocarpa: 0,04% (E. soongarica) - 0,45% (E. lutescens). Таким образом, для видов секций Esula и Tulocarpa были отмечены сопоставимые диапазоны содержания аг-ликонов флавоноидов. Значительное различие в содержании гликозидов и агликонов флавоноидов связано, вероятнее всего, с наличием гликозидов сложного состава (ди- и тригликозидов, галлатов) [І5, Іб].

Содержание агликонов флавоноидов в надземной части E. polychroma было сравнительно высоким

0,21%, при этом содержание гликозидов составило 1,29%.

В течение вегетации E. virgata отмечены два максимума общего содержания флавонолгликозидов в надземной части растений. Первый максимум приходился на фазу начала вегетации - 0,33%. После значительного уменьшения к фазе бутонизации до 0,22% - наблюдалось еще некоторое падение общего содержания флавонои-дов вплоть до фазы плодоношения (0,1б%). К концу вегетации следовало увеличение до 0,35% (рис. 2).

Основными агликоновыми компонентами E. virgata являются кверцетин, кемпферол, а также неиденти-фицированный агликон А (рис. 3). В процессе хроматографирования на ВЭЖХ-системе был зарегистрирован УФ-спектр агликона А: 259, 3б2 нм (метанол). На основании данных о положении максимумов УФ-

спектров в присутствии ионизирующих добавок и комплексообразователей этот агликон может быть отнесен к метилированным флавонолам (табл.).

Следует отметить, что ни один агликон не был преобладающим во всех фазах вегетации E. virgata. Наиболее значительно в процессе развития растений варьировало содержание гликозидов агликона А. С начала вегетации к фазе плодоношения оно уменьшалось с 0,13 до 0,03%, а затем снова увеличивалось до 0,Іб% к концу вегетации. Этот компонент преобладал в фазах начала и конца вегетации, характеризующихся и максимальным содержанием суммы флавонолгликозидов, а также в фазе бутонизации.

Содержание гликозидов кверцетина уменьшалось от 0,8% в начале вегетации до 0,5% в фазе бутонизации, далее оно несколько возрастало к фазе цветения до 0,9% и снова падало до 0,4% в фазе плодоношения, а к концу вегетации снова возрастало до 0,7%. Содержание гликозидов кемпферола падало от начала вегетации (0,12%) до бутонизации (0,5%) и цветения (0,5%), а затем возрастало к фазе плодоношения (0,09%) и далее к концу вегетации (0,i2%).

&

нЗ>

&

сР' *$

& V <•/ ^ ч«

■<Г

<Р" -о?

/ /■ ЯГ

.о^

v"

V </

ЛЭТ

■ Содержание гликозидов флавонолов, % Р Содержание агликонов флавонолов, % Рис. 1. Содержание гликозидов и агликонов флавоноидов в образцах Euphorbia

Начало

вегетации

Бутонизация Цветение Плодоношение Конец вегетации

—О—Кверцетин —□—Кемпферол

... д... Агликон А ^^^“Общее содержание

Рис. 2. Содержание флавонолгликозидов в надземной части Е. virgata в течение вегетационного периода

В фазе цветения доминировали гликозиды кверцетина, их содержание на 40% превосходило содержание гликозидов агликона А и на 80% - содержание гликозидов кемпферола. В фазе плодоношения, напротив, преобладали гликозиды кемпферола, содержание которых в 3 раза превышало содержание гликозидов агликона А и более чем в 2 раза - содержание гликозидов кверцетина.

Таким образом, при почти постоянном содержании суммы флавонолгликозидов на протяжении стадий бутонизации, цветения и плодоношения преобладающий агликон менялся от агликона А к кверцетину и далее к кемпферолу. При этом содержание гликозидов преобладающего агликона не превышало сумму гликозидов остальных двух агликонов практически во всех фазах, кроме фазы плодоношения, когда эти величины были практически равны.

В гидролизатах Е. ро1ускгоша обнаружены те же самые агликоновые компоненты, что и в гидролизатах Е. virgata: кверцетин, кемпферол и агликон А. Для динамики общего содержания флавонолгликозидов в надземной части Е. ро1ускгоша также были характерны основные максимумы в двух фазах: бутонизации (0,87%) и конца вегетации (0,92%) (рис. 4). При этом содержание суммы флавонолгликозидов, в отличие от Е. virgata, возрастало от начала вегетации (0,60%) к цветению (0,87%). Затем оно более чем в 2 раза уменьшалось к плодоношению (0,42%) и снова возрастало к концу вегетации (0,95%).

Хроматографическая и спектральная характеристика флавоноидного компонента А, выделенного из гидролизата Е. virgata

Группа показателей Показатель Значение

Максимумы ультрафиолетового спектра этанол 259 362

А1С13 271 408

А1С13-НС1 266, 305 360

ЫаОАс 259 362

КаОАс-Н3БО3 264 377

ЫаОН 263 388

Положение свободных ОН-групп 4'

Яг в системе бутанол - уксусная кислота -вода 40 : 12 : 28 65

Яг в системе уксусная кислота - муравьиная кислота - вода 10 : 2 :3 72

Цвет пятен на хроматограмме УФ зеленый флюоресцирующий

УФ + ЫН3 зеленый флюоресцирующий

---------,---------,--------,---------1--------,---------,---------,--------1--------,---------,---------,---------1--------,---------,--------,---------1---------■—

8 10 12 14 16 ггнп

Рис. 3. ВЭЖХ гидролизатов водно-спиртовых экстрактов Е. virgata (а) и Е. ро1ускгоша (Ь) в фазе плодоношения. Номера пиков: 1 - кверцетин, 2 - агликон А, 3 - кемпферол

ж

р

е

д

о

о

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

• -Д-.

Начало вегетации Цветение Плодоношение Конец вегетации

- — Кверцетин -----□----Кемпферол —Д--- Агликон А —X----------Общее содержание

Рис. 4. Содержание флавонолгликозидов в надземной части E. polychroma в течение вегетационного периода

В отличие от агликонового состава надземной части E. virgata, в агликоновом составе надземной части E. polychroma во всех фазах вегетации преобладал кверцетин. Агликон А не был обнаружен в фазах плодоношения и окончания вегетации. В фазе цветения содержание гликозидов кверцетина превосходило содержание гликозидов кемпферола более чем в 6 раз, а содержание гликозидов агликона А - более чем в 3 раза. То есть содержание гликозидов кверцетина превышало сумму остальных флавонолгликозидов более чем в 2 раза.

Выводы

Таким образом, в надземной части растений исследованных видов Euphorbia обнаружено значительное содержание флавоноидов (около 4%), а также относительно более высокое содержание гликозидов флаво-ноидов в надземной части видов секции Esula (0,92-3,63%) по сравнению с видами секции Tulocarpa (0,46-

1,12%). При этом содержание агликонов в видах секции Esula (0,04-0,34%) определенно не отличалось от их содержания в видах секции Tulocarpa (0,15-0,45%). Для интродуцированного вида E. polychroma характерны средние величины содержания агликонов (0,21%) и гликозидов (1,29%) флавоноидов.

Наиболее перспективными из исследованных видов в качестве источников флавоноидов являются E. chancoana, E. virgata и E. lutescens, которые содержат значительное количество агликонов флавоноидов (более 0,3%).

Таким образом, в течение вегетации в динамике общего содержания флавонолгликозидов в надземной части E. virgata и E. polychroma были отмечены два основных максимума. Для E. virgata первый максимум наблюдался в фазе начала вегетации, а для E. polychroma - в фазе бутонизации. Второй максимум содержания суммы флавонолгликозидов был отмечен в конце вегетации для обоих видов, несмотря на то, что растения дикорастущего вида находились в физиологическом состоянии вторичного роста, а растения ин-тродуцированного вида E. polychroma - в фазе отмирания.

В надземной части растений E. virgata ни один агликон не преобладал во всех фазах вегетации. Содержание гликозидов агликона А изменялось в течение вегетации более чем в 5 раз, а содержание гликозидов кверцетина и кемпферола - более чем в 2 раза.

В отличие от E. virgata, в агликоновом составе надземной части E. polychroma во всех фазах вегетации преобладал кверцетин.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в процессе вегетации в надземной части растений видов Euphorbia может наблюдаться не только изменение содержания отдельных флавонолгликозидов, но и различие их качественного состава. Отсутствие полного набора флавонолгликозидов именно в фазе плодоношения, когда преимущественно и производится сбор растительного материала для хемотаксономических исследований рода Euphorbia, необходимо учитывать в анализе качественного состава флавоноидов.

В соответствии с данными о сезонной изменчивости содержания флавонолгликозидов в надземной части растений E. virgata и E. polychromа заготовку лекарственного сырья целесообразно проводить в фазе цветения и конца вегетации, так как в этих фазах высокое содержание флавонолгликозидов в надземной части растений сопровождается их значительной массой.

Список литературы

1. Rizk A.-F. M. The chemical constituents of Euphorbiaceae // Bot. J. Linn. Soc. 1987. V. 94. P. 293-326.

2. Chen Y., Tang Z.-J., Zhang X.-X., Lao Ai-Na. Studies on the active principles of Ze-Qi (Euphorbia helioscopia L.), a drug used for chronic bronchitis // Yao Hsueh Pao. 1979. V. 14. №2. P. 91-95. (Chem. Abstr. 1980. V. 92. №72680).

3. Cateni F., Zilic J., Falsone G., Scialino G., Banfi E. New cerebrosides from Euphorbia peplis L.: antimicrobial activity evaluation // Bioorganic and Medicinal Chemistry Lett. 2003. V. 13. №24(15). Р. 4345-4350.

4. Лесников Е.П. Антифунгальная активность эфирных экстрактов // Антифунгальные свойства высших растений. Новосибирск, 1969. С. 7-194.

5. Kupchan S.M., Baxter R. L. Mezerein: antileukemic principle isolated from Daphne mezereum L. Science. 1975. V. 187. №3. P. 652-653.

6. Lee K.H., Hayashi N., Okano M., Hall I.H., Wu R.-Y., McPhail A. Lasiodiplodin, a potent antileukemic macrolide from Euphorbia splendens // Phytochemistry. 1982. №.21. P. 1119-1121.

7. Baslas R.K., Phytochemical studies of the plants of the genera Euphorbia // Herba Hungarica. 1982. №21. P. 115-126.

8. Барнаулов О.Д. Фармакологические свойства препаратов из корней E. fisherana Stend. // Раст. ресурсы. 1982. Т. 18. №3. С. 395-402.

9. Saraf S. Antihepatotoxic activity of E. antisyphilitica // Indian J. Pharm. Sci. 1996. V. 58. №4. P. 137-141.

10. Байков К. С. Род молочай Euphorbia L. (Euphorbiaceae) в Северной Азии: систематика, хорология, филогения: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Новосибирск, 2001. 16 с.

11. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств. СПб., 1995. 992 c.

12. Mueller R., Pohl R. Die Flavonolglycoside von Euphorbia amygdaloides und ihre Quantitative Bestimmung in Verchieden Entwicklungsstadien der Pflanze. 5. Mitteilung ueber die Flavonoide einheimisher Euphorbiaceen // Planta med. 1970. №18. P. 114-129.

13. Rizk A.M., Hammouda F.M., Seif El-Nasr M.M., Abou-Youssef A.A. Fytochemical investigation of Euphorbiapeplus // Fitoterapia. 1980. №51. P. 223-227.

14. Rizk A.M., El-Missiry M.M., Naturally Occuring Phorbol Esters. Non-diterpenoid constituents of Euphorbiaceae and Thymelaceae. In Naturally occuring Phorbol Esters. Boca Raton, 1986. P. 107-138.

15. Sahai R., Dube M.P., Rastogi R.P. Chemical and pharmacological study of Euphorbia maddeny // Indian J. Pharm. Sci. 1981. №43. P. 216-219.

16. Pohl R., Janistyn B., Nahrstedt A. Die Flavonolglycoside von Euphorbia helioscopia, E. stricta, E. verrucosa and E. dulcis. 9. Mitteilung ueber die Flavonoide eimheimisher Euphorbiaceen. Planta med., 1975. №27. 302-303.

17. Медведева Р.Г. Лекарственные растения Алма-Атинской области // Тр. Ин-та ботаники КазССР. Алма-Ата. 1972. №31. С. 3-54.

18. Блинова К.Ф., Стуккей К.Л. Качественное фитохимическое исследование некоторых растений тибетской медицины Забайкалья // Вопросы фармакогнозии. Л., 1961. С. 135-155.

19. Высочина Г.И. Фенольные соединения в систематике и филогении семейства гречишных. Новосибирск, 2004. 240 с.

20. Флора СССР. Т. XIV / под ред. В.Л. Комарова. М., Л., 1949.

21. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайса и К. Мацека, М., 1962.

22. Beek T.A. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts // J. of chromatography А. 2002. №967. P. 21-35.

23. Юрьев Д.В., Эллер К.И., Арзамасцев А.П. Анализ флавонолгликозидов в препаратах и БАД на основе экстрак-

та Ginkgo biloba // Фармация. 2003. №2. С. 7-9 .

24. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids, Berlin - Heidelberg - New-York, 1970. 345 p.

Поступило в редакцию 2 июля 2007 г.