CC BY
16УДК 537.226.82:615.282:582.282.123.2:582.282.123.4
СОЧЕТАННОЕ ДЕЙСТВИЕ
ТЕМПЕРАТУРЫ И
АНТИМИКОТИКОВ НА
ФОСФОАИПАЗНУЮ
АКТИВНОСТЬ
ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ
МИКРОМИЦЕТОВ
Кузикова ИЛ. (с.н.с.)*, Сухаревич В.И. (г.н.с.)/ Медведева Н.Г. (зав. лаб.)
ФГБУН Санкт-Петербургский научноисследовательский центр экологической безопасности Российской академии наук (НИЦЭБ РАН), Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2013
Определен характер влияния температуры и температуры в комплексе с антифунгальными препаратами на активность фосфолипаз - одного из важнейших факторов патогенности грибов. Показано, что при снижении температуры культивирования с 25 °С до 16 °С и 10 °С фосфолипазная активность оппортунистических грибов родов Aspergillus и Penicillium возрастает на 25-68%. Под влиянием антифунгальных препаратов, в условиях пониженной температуры, происходит значительное увеличение фосфолипазной активности за счет аддитивного эффекта воздействия температуры и фунгицида. Повышенная температура (37 °С) в меньшей степени активирует фосфолипазную активность микромицетов. Сочетанное воздействие повышенной температуры 37°С и фунгицидов приводит к сложению эффектов только у Aspergillus spp., однако при этом фосфолипазная активность грибов остается ниже, по сравнению с более низкими температурами (16 °С и 10 °С).
Ключевые слова: оппортунистические грибы, температура, фосфолипазная активность, фунгициды
THE COMBINED EFFECT OF TEMPERATURE AND ANTIFUNGAL AGENTS AT PHOSPHOLIPASE ACTIVITY OF OPPORTUNISTIC FUNGI
Kuzikova I.L. (senior scientific collaborator), Sukharevich V.l. (chief scientific collaborator), Medvedeva N.G. (head of the laboratory)
St. Petersburg Scientific Research Center for Ecological Safety RAS, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2013
The character of the temperature effect and temperature in
* Контактное лицо: Кузикова Ирина Леонидовна
тел.: (812) 499-64-62
combination with antifungal agents on the activity of phospholipase -one of the most important factors in the pathogenicity of fungi - have been defined. At lower of temperature cultivation from 25 0 С to 16 0 С and 10° С the phospholipase activity of opportunistic fungi of the genera Aspergillus and Penicillium increase on 25-68%.
By the influence of antifungal agents at low temperatures there was a significant increase of the phospholipase activity additive effect due to temperature effects and fungicide. High temperature (37 0 C) to a lesser extent activates phospholipase activity of micromycetes. The combined effect of high temperature 37 0 С and fungicides results in effects only at Aspergillus spp., however, the phospholipase activity of fungi is below as compared with lower temperatures (16 0 С and 10 0 C).
Key words: fungicide, opportunistic fungi, phospholipase,
temperature
Температура культивирования микроорганизмов имеет важное значение как для роста культур, так и для регуляции их адаптационных факторов, относящихся к факторам патогенности, - ферментов, полисахаридов, пигментов и др. [1,2]. По данным Никольской Е.А., Синявской О.И. (1984), низкая температура культивирования (8-10 °С) псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotubercidosis, по сравнению с 37 °С, способствует активации в 2-8 раз такого фактора патогенности, как каталаза. При этом вирулентность штаммов Y. pseudotubercidosis, выращенных при температуре 6-8 °С, выше, чем выращенных при 36-37 °С [3].
При изучении влияния температуры на вирулентность Listeria monocytogenes, контаминирующих пищевые продукты, показано, что низкая температура способствует повышению адгезивных свойств бактерий и приводит к увеличению вирулентности штаммов [4]. В работе [5], выполненной с L. monocytogenes, установлено, что под действием температуры происходит изменение в экспрессии структурных вариантов липотейхоевой кислоты (ЛТК) - ЛТК и ЛТК2. При росте бактерий в условиях комнатной температуры преимущественно образуется ATKj а при 37 °С
- ЛТК2 По мнению авторов, такая модификация ЛТК может отражать адаптацию бактерий к эндотермическим условиям в клетках организма - хозяина и повышение их вирулентности.
Вирулентность Aeromonas salmonicida - бактериального патогена рыб также зависит от температуры. При 22 °С и ниже культура высоко вирулентна, в то время как при 25 °С и выше это свойство утрачивается [6, 7].
При использовании изолятов энтомопатогенных грибов - Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae также показано, что температура оказывает существенное воздействие на их вирулентность [8], но, в данном случае, характер влияния температуры на уровень вирулентности зависит и от свойств отдельных изолятов. Так, у одного из изолятов М. anisopliae заражение личинок возрастает с повышением температуры до 35 °С, у других - максимальную скорость инфицирования наблюдали при 15-20 °С.
Однако основная часть исследований по влиянию температуры на факторы патогенности микроорганизмов была выполнена с бактериальными патоге-
нами и значительно меньшая - с мицелиальными оппортунистическими грибами, внимание к которым в настоящее время возрастает в связи со значительным ростом заболеваемости микозами [9-12], количество которых ежегодно увеличивается на 5-10% и удваивается каждые 10 лет [13].
Наряду с температурой, на образование факторов патогенности грибов - пигментов, полисахаридов, гидролитических ферментов и др. существенное влияние оказывают различные антифунгальные средства [14, 15]. В связи с этим, возникает вопрос о характере и степени воздействия грибов антифун-гальных средств на факторы патогенности в условиях, различающихся по температуре.
Этому вопросу и посвящена настоящая работа. В качестве контролируемого фактора использовали активность грибных фосфолипаз как одного из важнейших факторов патогенности, обеспечивающего способность микромицета разрушать мембраны клеток тканей человека и активно их инвазировать.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили с использованием в качестве тест-культур оппортунистических мице-лиальных грибов: Aspergillus flavus Link 1809, А. terreus Thom 1025, A. niger Tiegh 1199, Penicillium funiculosum Thom 1115, P. ochrochloron Biourge 1702, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) РАН.
Культуры хранили и поддерживали на агаризо-ванной среде Чапека с 2% крахмала.
Фосфолипазную активность грибов определяли «чашечным методом», предложенным M.F. Price с соавторами (1982), с применением среды следующего состава: агар Сабуро, 1М NaCl, 5mM СаС12, 8% стерильного яичного желтка.
Метод основан на гидролизе липидов, содержащихся в яичном желтке, с последующим возникновением кальциевого комплекса с образующимися при этом жирными кислотами, освобождаемыми под действием секретируемого фермента. После инкубирования посевов при различной температуре (10±1 °С; 16±1 °С; 25±1 °С; 36±1 °С) измеряли диаметр колоний (Дк) и общий диаметр колоний с зоной преципитации (Дк+зп). Фосфолипазную активность определяли как отношение диаметра колоний с зоной преципитации к диаметру колонии (Дк+зп / Дк).
В работе использовали синтетические фунгициды
- катамин АБ (алкилбензилдиметиламмоний хлорид), метатин (смесь 2-метил-4-изотиазолин-3-ОН и 5-хлор-2-метил-3(2Н)-изотиазолин-3-ОН в соотношении 1: 3) и природный противогрибковый гекса-еновый антибиотик 30, образуемый актиномицетом из рода Streptomyces. Химические и биологические свойства антибиотика 30 представлены в работе [16].
Фунгициды и антибиотик 30 вносили в питательную среду в суббиоцидных концентрациях, которые варьировали в зависимости от чувствительности к ним грибов, и при которых достигали степени пода-
вления роста грибных колоний на 40-60%.
Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 5.5. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Активность фосфолипаз всех исследуемых ми-кромицетов выявляли при 16±1 °С, 25±1 °С и при повышенной температуре 36±1 °С. При биологически низкой температуре 10±1 °С определение активности фосфолипаз оказалось возможным только у P. ochrochloron, так как в этих условиях рост культур Aspergillus flavus, A. niger, A. terreus, Penicillium funiculosum отсутствовал. Учитывая, что при различных температурах культивирования рост грибов происходит с разной скоростью, фосфолипазную активность устанавливали в динамике роста культур. Согласно данным, представленным по фосфолипаз-ной активности (на рисунке и в таблице), выявили максимальный уровень образования ферментов.
В результате показано, что при снижении температуры культивирования с 25 °С до 16 °С у всех исследуемых грибов наблюдали активацию фосфоли-пазной активности (ФЛА) на 25-68% в зависимости от культуры (Рис.).
Таблица
Сочетанное влияние температуры и фунгицидов на
фосфолипазную активность грибов
Варианты культивирования Фосфолипазная % К КОНТ активность, ролю
№ п/п Т,°С Фунгицид P.ochrochloron P. funiculosum A.terreus А. niger А. flavus
1 25 - 100 100 100 100 100
2 25 катамин 128 119 110 112 112
3 25 метатин 116 110 96 112 105
4 25 антибиотик 30 127 164 130 150 135
5 37 - 93 84 122 104 121
6 37 катамин 99 104 125 136 134
7 37 метатин 93 107 121 112 113
8 37 антибиотик 30 100 98 150 150 150
9 16 - 125 168 138 127 140
10 16 катамин 165 250 134 136 150
11 16 метатин 134 201 134 127 140
12 16 антибиотик 30 152 274 167 209 153
13 10 - 125 н н н н
14 10 катамин 152 н н н н
15 10 метатин 135 н н н н
16 10 антибиотик 30 162 н н н н
н - нет роста
A Jim чи
ГсниіІІінпі V fimiculosuni ochrochloron
Рис. Уровень активности фосфолипаз при различной температуре роста грибов.
При последующем снижении температуры до 10 °С дальнейшего повышения уровня ФАА не происходит (показано на примере P. ochrochloron). Повышение температуры культивирования с 25 °С до 37 °С сопровождается повышением активности фосфолипаз в меньшей степени — на 22% только у Aspergillus flavus и A. terreus, у остальных культур она практически не изменяется.
'Гак как для защиты от грибов, обитающих при различных температурных условиях, применяют природные и синтетические фунгициды, представлял интерес вопрос о влиянии температуры на активность фосфолипаз у микромицетов, одновременно подвергаемых действию антифунгальных средств. В частности, при изучении действия катамина АБ, ме-татина и гексаенового антибиотика 30 на активность фосфолипаз установили, что все используемые фунгициды при 25 °С активируют ФАЛ микромицетов (варианты 2-4) (таблица). При этом величина эффекта зависит как от вида микромицета, так и от используемого фунгицида. Наибольшее увеличение фосфо-липазной активности — на 27-64%, в зависимости от культуры, наблюдали при внесении в питательную среду гексаенового антибиотика 30. Кагамин ЛБ и метатин способствуют значительно меньшей активации фосфолипаз. При их использовании самый высокий уровень повышения активности фосфолипаз обнаружили у P. ochrochloron - на 28% и 16% в присутствии катамина и метагина соответственно.
11ри анализе сочетанного действия температуры и антифунгальных средств на активность грибных фосфолипаз, в качестве контрольных вариантов были выбраны варианты культивирования при 25 °С на средах без фунгицидов - вариант 1.
Из представленных в таблице данных видно, что под влиянием антимикотиков при пониженной тем-
пературе (10 °С и 16 °С), происходит значительное возрастание ФАА у всех изученных микромицетов (варианты 10-12 и 14-16), при этом в большинстве случаев наблюдали аддитивный эффект воздействия низкой температуры и фунгицида.
Аналогичный аддитивный эффект отмечали у представителей рода Aspergillus при воздействии фунгицидов в условиях повышенной температуры (37 °С) (варианты 6-8). Отметим, что при наличии воздействия на ФАА только одного из двух факторов
- температуры (вариант 1, A. terreus) или фунгицида (варианты 7,8, A. niger) повышение значений фактора патогенности обусловлено именно этим фактором.
У Penicillium spp. выявили совершенно иную реакцию на воздействие фунгицидов в условиях повышенной температуры. Фосфолипазная активность P. ochrochloron и P. funiculosum при 37 °С остается на уровне контрольных вариантов (вариант 1), т.е. эффект увеличения ФАА исследуемых пенициллов под воздействием фунгицидов нивелируется.
выводы
1. Определен характер влияния температуры культивирования на образование Aspergillus spp. и Penicillium spp. такого фактора патогенности как фосфолипазы. Показано, что у всех изученных культур микромицетов при снижении температуры с 25 °С до 16 “С и 10 “С имеет место значительная активация ФАА.
2.11ри повышенной температуре (37 "С) микроми-цеты синтезируют меньшее количество фосфолипаз, являющихся важнейшими факторами патогенности, по сравнению с их образованием при более низких температурах (16 "С и 10 °С).
3. Впервые показано, что под влиянием антифунгальных препаратов в условиях пониженной температуры происходит возрастание ФАА, при этом в большинстве случаев отмечали аддитивный эффект воздействия температуры и фунгицида. Сочетанное воздействие повышенной температуры 37 ”С и фунгицидов приводит к сложению эффектов только на Aspergillus spp. Однако в этих температурных условиях фосфолипазная активность грибов остается существенно меньшей по сравнению с ее активностью при пониженных температурах.
4. Обработка объектов фунгицидами в условиях пониженных температур (16 “С и 10 °С) может способствовать возрастанию потенциально опасных для человека грибов в антропогенном сообществе.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. — Владивосток: ОАО Примнолиграфкомбинат, 2004 - 167 с.
Бузолева Л.С., Сомова Л.М., Кривошеева А.М. и др. Использование запасных веществ бактериями Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes при разной температуре //Ж. Микробиол. - 2006. - №3. - С. 16-19. Ценева Г.Я., Солодовникова Е.А., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний //Клин, микробиол и антимикроб, химиотерапия. - 2002. - Т. 4., №3. - С. 248-266.
Цветкова Н.Б., Бузолева Л.С., Обухова B.C. Влияние условий хранения на изменение биологических свойств Listeria monocytogenes, контаминирующих пищевые продукты //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2010. — №4. — С.
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013. Т.15. №3
36-39.
5. Dehus О., Pfitzenmaier М., Stuebs G., et al. Growth temperature-dependent expression of structure variants of Listeria monocytogenes lipoteichoic acid // Immunobiology. - 2011. - Vol. 216. - P. 24-31.
6. StuberK., Burr S.E., Braun М., etal. Type III secretion genes in Aeromonas salmonicida subsp salmonicida are located on a large thermolabile virulence plasmid II]. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41 - P. 3854-3856.
7. Daher R.K., Filion G., Tan S.G., et al. Alteration of virulence factors and rearrangement of pAsa5 plasmid caused by the growth of Aeromonas salmonicida in stressful conditions // Veterinary Microbiology. - 2011. - Vol. 152. - P. 353-360.
8. Garrido-Jurado I., Valverde-Garcia P., Quesada-Moraga E. Use of a multiple logistic regression model to determine the
effects of soil moisture and temperature on the virulence of entomopathogenic fungi against pre-imaginal Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata II Biological Control. - 2011. - Vol. 59. - №.3 - P. 366-372.
9. Блинов Н.П., Митрофанов В. С., Чернопятова P.M. Аспергиллезная инфекция; подходы к ее диагностике и лечению // Проблемы медицинской микологии. - 2002. - Т. 4, №1. - С.4-6.
10. Блинов Н.П. Медицинская микология - наука о болезнетворных для человека грибах; свершения и проблемы //
Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 10, №2. - С. 8-10.
11. Климко Н.Н., Богомолова Т.С., Васильева Н.В. и др. Микогенная аллергия у жителей помещений, пораженных ми-кромицетами // Проблемы медицинской микологии. - 2008. -Т. 10, №2. - С. 17-21.
12. Васильева Н.В., Блинов Н.П. Микроорганизмы-контаминанты - индукторы процессов старения больничных зданий и помещений медицинского назначения, а также возбудители некоторых заболеваний людей: (учебное пособие) /под ред. Н.П. Блинова. - СПб.: КОСТА, 2009. - 224 с.
13. Биоповреждения больничных зданий и их влияние на здоровье человека / под ред. А.П. Щербо и В.Б. Антонова. -СПб., 2008. - 230 с.
14. Сухаревич В.И., Кузикова И.Л., Медведева Н.Г. Защита от биоповреждений, вызываемых грибами. - 2009. - СПб.: ЭЛБИ-СПБ. - 207 с.
15. Кузикова И.Л., Медведева Н.Г., Сухаревич В.И. Влияние фунгицидов и поверхностно-активных веществ на факторы потенциальной патогенности у грибов - возбудителей микоповреждений // Микология и фитопатология. - 2010. - Т.44, Вып.5. - С. 441-447.
16. Кузикова И.Л., Сухаревич В.И., Шенин Ю.Д., Медведева Н.Г. Биологические свойства и идентификация полиенового противогрибкового антибиотика, перспективного для защиты от микоповреждений // Известия РАН. Серия биологическая. - 2010. - №2. - С. 238-247.
Поступила в редакцию журнала 28.06.2013
Рецензент: Н.П. Блинов
