Суточная динамика фосфолипазной активности Candida albicans Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.992

СУТОЧНАЯ ДИНАМИКА ФОСФОАИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ CANDIDA ALBICANS

Николенко М.В. (доцент)*

Тюменская государственная медицинская академия, Россия

© Николенко М.В. 2010

Экспериментально выявили суточную динамику фосфоли-пазной активности депонированного штамма и клинических изолятов Candida albicans. Установили изменение профиля ритма, среднесуточных показателей, амплитуды колебаний активности фермента грибов, выделенных от больных с диагнозом «кандидоз».

Ключевые слова: биоритм, Candida albicans, фосфолипаза

THE DAILY DYNAMICS OF CANDIDA ALBICANS PHOSPHOLIPASE ACTIVITY

Nikolenko M.V. (associated professor)

Tyumen Medical Academy, Russia

© Nikolenko M.V., 2010

Experimentallare found daily changes phospholipase activity depositedon strain and clinical isolates of Candida albicans. The change of profile of rhythm, a daily average, the amplitude of oscillations of the enzyme activity of fungi isolated from patients with candidosis.

Key word: biorhythm, Candida albicans, phospholipasa,

* Контактное лицо: Николенко Марина Викторовна

Тел.: (905)823-37-90

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время, в связи с ростом заболеваний, сопровождающихся различными иммунодефи-цитными состояниями, возрос интерес ученых всего мира к поражениям органов и тканей человека условно-патогенными микроорганизмами. К десяти наиболее часто выделяемым патогенам относят дрожжевые грибы, которые широко распространены в природе и относятся к уникальным микроорганизмам, демонстрирующим широкий диапазон адаптивных возможностей [1]. В различных экологических нишах организма человека грибы могут быть как уверенными комменсалами, так и «успешными» оппортунистами [2, 3]. В связи с двойственной природой Candida spp. (комменсалы и /или этиопатоге-ны), у клиницистов нередко возникают сложности в оценке результатов обследования [3, 4]. Среди представителей Candida spp. на долю Candida albicans приходится 50-80% случаев выделения со слизистых оболочек пищеварительного и урогенитального тракта [1]. С. albicans вызывает около 90% случаев локального и 50-70% — генерализованного кандидо-за [1, 4, 5].

Окончательно не выяснено, каковы причины и вклад Candida spp. при переключении поведения от «безобидного» сосуществования до агрессии. Одним из параметров, характеризующих трансформацию биологических свойств Candida spp., является способность вырабатывать ферменты агрессии и защиты. Одним из универсальных ферментов вирулентности считается фосфолипаза, гидролизирующая фосфолипиды клеточных мембран [3]. Изучение вклада фосфолипаз в арсенал патогенности грибов стало быстро развивающимся направлением в современной микологии. В данной работе мы изучали суточную динамику фосфолипазной активности С. albicans. Настоящее исследование открывает возможность определить внутренние механизмы адаптации дрожжеподобных грибов в различные периоды суток и, следовательно, прогнозировать их поведение.

Цель - изучить суточную динамику активности фосфолипазы А2 у С. albicans.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали музейный штамм С. albicans 24433 АТСС и клинические изоляты С. albicans 463, 147, выделенные из кишечника; 607, 641, 644 — из зева; 160, 162, 169 — из влагалищного отделяемого. Культуры были получены от здоровых людей в клинически не манифестируемой степени высеваемости - 102 КОЕ/мл; изоляты С. albicans 192, 597, 98, выделенные в 106 КОЕ/мл от больных с диагнозом «кандидоз», из кишечника, зева, влагалища соответственно. Данные культуры обладали типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Для биохимической диагностики применяли ассимиляционный колориметрический тест «Auxacolor 2» фирмы

Bio-Rad. Все тест-штаммы выращивали и хранили на жидкой среде Сабуро. Для данной работы использовали 24-часовую культуру, которая соответствовала начальному этапу фазы стационарного роста и покоя. Для получения исходной концентрации грибов (1,0 единицы по Мак Фарланду) микробную взвесь стандартизировали на приборе «Densi - La - Meter» фирмы «Lachema». Активность фосфолипазы А2 определяли титрометрическим способом [6] в модификации Суплотова С.Н, Журавлевой Т.Д., 2009 г.

17].

В две пробирки (опыт и контроль) вносили 1 мл исходной концентрации дрожжевых грибов и ставили на 15 минут в термостат при 60 °С. Затем в обе пробирки добавляли 0,3% раствор трипсина и помещали в холодильник на час при 0-4 “С. После этого в опытную пробирку вносили раствор лецитина, в обе пробы — 0,6% хлористый кальций и ставили в термостат при 37 °С па два часа. По истечении данного времени в контрольную пробу добавляли лецитин и в обе пробирки — 10% хлористый кальций для остановки реакции. В содержимое пробирок вносили

0,1% спиртовой раствор фенолфталеина и титровали свежеприготовленным раствором 0,002 М едкого натрия до слабо-розового окрашивания. Фиксировали объем раствора, используемого для титрования контрольной и опытной проб. Активность фермента рассчитывали по формуле: А= Vo-Vk, где Vo и Vl< - объемы щелочи, используемой для титрования опытной и контрольной проб соответственно; А — активность фермента выражали в млмоль/л. час.

Исследования проводили в течение суток с 4-часовым интервалом. Было проведено 486 измерений. Результаты статистически обработаны по Стьюденту [8] и методу наименьших квадратов [9]. Метод наименьших квадратов - математический анализ, выявляющий достоверные ритмы и оценивающий ритмометрические параметры: период ритма, мезора, амплитуды, акрофазы.

Период ритма (Т) - продолжительность одного полного цикла [10]. Биологические ритмы по частоте колебаний классифицируют на: ультрадианные (длина периода до 20 ч); циркадианные (околосуточные) (длина периода 20-28 ч), инфрадианные (28-72 ч); циркасептанные (длина периода 7+3 суток), циркан-нуальные (12+2 месяцев) [11].

Мезор - статистическая величина среднего значения показателей изучаемого процесса. Он дает более правильное представление о среднесуточной величине показателя, т. к. позволяет игнорировать случайные отклонения в виде резких подъемов и спадов величины.

Акрофаза - момент времени, соответствующий регистрации максимального значения показателя.

Батифаза - точка времени в периоде, когда отмечают минимальное значение исследуемого параметра.

Амплитуда - величина наибольшего отклонения полезного сигнала от мезора. Амплитуда ритма име-

ет важное биологическое значение, поскольку служит признаком мощности ритма [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментально выявили суточную динамику фосфолипазной активности всех изучаемых культур. У штамма 24433 АТСС установили достоверный циркадианный (околосуточный) ритм ферментативной активности с максимальным значением показателя в утренние часы - 8.00. Батифазу регистрировали в вечернее время - 16.00. Фосфолипазная активность дрожжевых грибов, выделенных из исследуемого материала здоровых людей, при степени высеваемости 102 КОЕ/мл не изменялась в течение суток в сравнении с депонированным штаммом (Рис.1).

t, часы

С. albicans (влагалище) “ - 1 С. albicans (зев)

С. albicans (кишечник) С. albicans АТСС

Рис.1. Ритмометрические параметры фосфолипазной активности изолятов С. albicans, выделенных из биотопов организма здоровых людей

Таблица 1

Ритмометрические параметры фосфолипазной активности грибов, выделенных из биотопов здоровых людей

Культура Вклад ультра-дианного ритма, % Вклад циркадианного ритма, % Мезор, млмоль/л. час Амплитуда, млмоль/л. час Акрофаза час

(.albicans 24433 АТСС 25,8 74,2* 8,7±0,03 7,2±0,14 7,8

C.albicans (кишечник) 19,1 81,1* 8,6 ±0,23 8,2±0,59 7,6

C.albicans (влагалище) 35,4 64,5* 7,2±0,94 8,3±0,66 4.1*

C.albicans (зев) 33,6 66,4* 8,16±0,23 7.07±0,04 8,2

* - р < 0,05

Данные представлены в виде графиков средних значений с доверительным интервалом (р < 0,05) с учетом критерия Стыодента.

Как показано в таблице 1, динамика активности фосфолипазы А2, независимо от биотопа выделения, сохраняла спектральный состав ритма, средние значения показателя, амплитуду колебаний. В биоритмах грибов, выделенных из влагалищного отделяемого, изменилось время максимального значения показателя. Смещение акрофазы приходилось на ранние утренние часы — 4.00.

Возможно, грибы при клинически не манифестируемой степени высеваемости, с одной стороны, обладают биологическим ритмом активности фермента достаточно устойчивым и, по возможности, независимым от многочисленных случайных воздействий. Вероятно, циркадианный ритм фосфоли-

Э I» F Щ Ц - Г лын І ІИ о р 11

пазной активности является эндогенным ритмом, контролируемым «биологическими часами» микроорганизма. Установили, что изоляты С. albicans у здоровых людей наиболее агрессивны в утреннее время (4.00-8.00). В этот период времени они активно секретируют фермент за пределы клетки, катализируют гидролитическое расщепление жирных кислот в фосфолипидах. Продукты гидролиза - лизофос-фатиды высокотоксичные и вызывают разрушение клеточных мембран макроорганизма [3, 4], способствуя пенетрации и инвазии. В остальное время суток активность фермента агрессии незначительна.

С другой стороны, у здоровых людей С. albicans является микросимбионтом в биоценозах зева, кишечника, влагалища. Микроорганизм вынужден адаптироваться к условиям существования внутри биоценоза «гриб - бактерия» и экосистемы «гриб - макроорганизм». Циркадианный период ритма и стабильно высокие значения амплитуды активности фосфолипазы указывают на вариабельность грибов к определенному биотопу макроорганизма в системе ассоциативного симбиоза. По всей видимости, данный механизм адаптации закономерен, является типовым признаком временных рядов ферментативной активности С. albicans.

Динамика суточной активности фосфолипазы изолятов грибов различных биотопов больных с диагнозом «кандидоз» представлен на рис. 2.

У всех изучаемых культур установили достоверные (р < 0,05) ультрадианные (12-часовые) ритмы ферментативной активности с максимальным значением показателя в дневное - 12.00 и ночное - 24.00 время. Минимум активности фермента регистрировали в 4.00 и 20.00 часов.

С. albicans АТСС -------С. albicans (кишечник)

С. albicans (влагалище) “ _ 'С. albicans (зев)

Рис. 2. Ритмометрические параметры фосфолипазной активности изолятов С. albicans, выделенных из биотопов организма больных кандидозом

Хронометрические параметры фосфолипазной активности грибов, выделенных из разных биотопов, достоверно отличались (таблица 2).

Таблица 2

Ритмометрические параметры фосфолипазной активности грибов, выделенных из биотопов больных кандидоз

Культура Вклад ультра-дианного ритма, % Вклад циркадианного ритма, % Мезор, млмоль/л. час Амплитуда, млмоль/л. час Акрофаза- час

С.albicans 24433 АТСС 25,8 74,2* 8,7±0,03 7,2±0,14 7,8

C.albicons (кишечник) 74,4* 23,1 5,9±0,71 6,7± 1,23 11,5; 24,0*

C.albicons (влагалище) 61,4* 47,1 5,8±0,43* 3,3±0,65* 11,7; 24,0*

C.albicons (зев) 73,3* 25,3 13,3±2,12* 12,2±0,78* 11,3; 24,0

* - р < 0,05

У микроорганизма, выделенного из зева, наблюдали повышение среднесуточного значения фермента в 1,5 раза и амплитуды колебаний показателя в 1,7 раз по сравнению с эталонным штаммом. В ночное время активность фосфолипазы достигала 20,0 ± 1,83 млмоль/л. час. У изолятов С. albicans из кишечника и влагалищного отделяемого мезор активность фермента снижаласьв 1,5 раза. У влагалищного штамма снизилась амплитуда в 2,2 раза.

У всех изолятов дрожжеподобных грибов - возбудителей кандидоза наблюдали рассогласование околосуточных ритмов фосфолипазной активности. Независимо от биотопа преобладал ультрадианный ритм. Данное явление, по всей видимости, можно рассматривать как перестройку физиологической активности, которая сопровождается напряжением механизмов адаптации, поиском адекватной реакции на изменение условий [12] - иммунодефицит макроорганизма, а установленное увеличение числа колебаний свидетельствует о функциональной экономии в условиях напряженного выброса фермента [12,13].

При кандидозе в микробном пейзаже зева, кишечника, влагалища доминирует С. albicans. Микро-боценоз - саморегулирующаяся система с различными типами взаимоотношений между микроорганизмами [14]. Микробный состав каждого биотопа специфичен. Вероятно, в условиях иммунодефицита макроорганизма, в зависимости от видового состава микросимбионтов, грибы из разных биотопов ведут себя по-разному. Выявили, что изоляты С. albicans в зеве и кишечнике у больных людей наиболее активно выделяют фосфолипазу А2 в ночное время. Культуры грибов, выделенные из влагалища, проявляют максимальную вирулентность в дневной период. Изменения среднесуточных значений фосфолипазной активности, вероятно, связаны с изменениями скорости биологических реакций. А вариабельность амплитуды колебаний изучаемого показателя указывает на адаптивные возможности грибов в каждом конкретном биотопе.

ВЫВОДЫ

1. Для музейного штамма и изолятов С. albicans, выделенных от здоровых людей, характерно преобладание циркадианного ритма фосфоли-

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2010. Т. 12. №2

пазной активности, что указывает на персистентные сти грибов.

способности. 3. Хронобиологический метод как возможный

2. Изменение динамики активности фермента вариант ранней идентификации носительства и кан-

в течение суток у С. albicans, выделенных от больных дидоза,

кандидозом, характеризует адаптивное возможно-

ЛИТЕРАТУРА

1. Короткова Т.Н. Диагностика и лечение локального и генерализованного кандидоза: Автореф. дисс. канд мед. Наук,- Чебоксары, 2006,- 17 с.

2. Зеленова Е.Г., Заславская М.И., Махрова Т.В. Кандиды: экология, морфофункциональные особенности и факторы патогенности // Нижегородский медицинский журнал.- 2002.- № 1,- С.73-83.

3. Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г. и др. Фосфолипаза оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов //Ж. Проблемы медицинской микологии.- 2006.- Т.8, № 4.- С.41-46.

4. Кубась В.Г., Данилова О.П., Чайка Н.А. Кандидозная инфекция. - СПб., 1996. - С.46.

5. Лесовой B.C., Аипницкий А.В., Очкурова О.М. Кандидоз ротовой полости// Ж. Проблемы медицинской микологии,- 2003,- Т.5, № 1,- С.21-24.

6. Тужилин С.А., Салуэнъя А.И. Метод определения активности фосфолипазы А2 в сыворотке крови // - Лаб. Дело.-1975,- № 6,- С. 334-336.

7. Суплотов С.Н., Журавлева Т.Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция. Методы лабораторной диагностики.- Тюмень: ООО «Печатник», 2009. - 104 с.

8. Fisher R.A. Statistical methods for research workers. - London, 1954.

9. Nelson W., Tong Y.L., Lee J.K., et al. Methods for cosinorrhymometry // Chronobiologia. - 1979. - Vol. 6, № 4. - P. 305-323.

10. Губин Д.Т., Губин Г.Д. Хроном сердечно-сосудистой системы на различных этапах онтогенеза человека. - Тюмень, 2000,- 176 с.

11. Ашофф Ю. Обзор биологических ритмов. Биологические ритмы. Пер. с англ.- М.: Мир, 1984. -Т.1.-С.12-21.

12. Хетагурова А.Г. Хронопатофизиология - новое направление классической патофизиологии // М-лы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. -Владикавказ, 2008. - С.47-55.

13. Маркина В.В., Кузин С.М. Роль механизмов саморегуляции в синхронизации клеток и формировании ритмов пролиферативной активности // М-лы Первого Российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ, 2008. - С.36-37.

14. Иванова Е.В. Биологические свойства бифидумбактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека: Автореф. дисс. канд мед. Наук.- Оренбург, 2010.- 15 с.

Поступила в редакцию журнала 12.04.2010

Рецензент: Н.П. Блинов