CC BY
44
У*
ж
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
© Е. п. демина1, В. В. мирошникова1, н. В. майоров 2, В. В. давыденко 2, А. л. шварцман 1' 3
1 ФГБУ Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова;
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова;
3 ФГБУ НИИ экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург
С ядерные рецепторы LXRa/p и PPARy играют важную роль в регуляции липидного обмена и обратного транспорта холестерина. однако влияние уровней экспрессии генов LXRa/p и РРАМу в макрофагах при развитии атеросклероза остается практически неизученным. методом полимеразной цепной реакции в реальном времени определяли содержания LXRa мрнк, мрнк LXRP и РРЛЯу мрнк в макрофагах, культивированных в течение 5 суток с колониестимулирующим фактором макрофагов M-CSF. уровень LXRP мрнк и РРЛМу мрнк у пациентов со стенозом коронарных артерий был понижен по сравнению с контрольной группой, p < 0,001. уровень мрнк LXRa в макрофагах в исследуемых группах не отличался ф = 0,17). мы предполагаем, что уровни экспрессии генов LXRP и РРЛМу в макрофагах могут быть значимыми факторами, ассоциированными с развитием атеросклероза.
С ключевые слова: атеросклероз; стеноз коронарных артерий; макрофаги; гены 1Ща/в, ген РРАЯу.
Поступила в редакцию 03.06.2013 Принята к публикации 30.12.2013
УДК 577.218
СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ LXRß мРНК И PPARy мРНК В МАКРОФАГАХ, СТИМУЛИРОВАННЫХ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИМ ФАКТОРОМ М-CSF У БОЛЬНЫХ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ
Принятые сокращения: ОТХ — обратный транспорт холестерина, LXR — печеночный Х рецептор, M-CSF — колониестимулирующий фактор макрофагов, PPAR — рецептор активации пролиферации пероксисом.
ВВЕДЕНИЕ
В понимании механизмов развития атеросклероза важное значение имеют печеночные Х рецепторы (LXR), LXRa и LXRß относящиеся к семейству ядерных рецепторов, которые регулируют гомеостаз и обратный транспорт холестерина (ОТХ), усиливают экспрессию аполипопротеина Е и транспортеров ABCA1 и ABCG1 (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010).
Значительный интерес в атерогенезе представляет и рецептор активации пролиферации пероксисом (PPAR) у, который также относится к семейству ядерных рецепторов и играет ключевую роль в регуляции энергообмена и ли-пидного обмена (Wahli et al., 2012). Было показано, что PPARy экспрессируется в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротических поражений (Apostoli et al., 2012), и его экспрессия может критически влиять на функции макрофагов, включая их активацию, продукцию цитокинов и их преобразование в пенистые клетки, что, в свою очередь, влияет на развитие атеросклероза.
Таким образом, можно предположить, что изменение уровня экспрессии ядерных рецепторов LXRa, LXRß и PPARy может оказывать влияние на эффективность ОТХ и, как следствие, на предрасположенность к развитию атеросклероза у человека.
Цель данной работы заключалась в оценке уровня мРНК генов LXRa, LXRß и PPARy в макрофагах у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Проведение данной работы одобрено этическим комитетом Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова.
Группу пациентов составили 11 человек с атеросклерозом, подтвержденным при ангиографическом исследовании. Ангиографическая диагностика атеросклероза проводилась на кафедре госпитальной хирургии № 2 ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Группа больных была гетерогенной по степени локального (% окклюзии артерии атерогенной бляшкой) и диффузного (общее количество артерий, пораженных атеросклерозом) атеросклероза. Однако у всех больных, в как минимум, в одной артерии коронарного бассейна выявлен стеноз более 50 %. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств. Контрольная группа состояла из 11 человек без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе. Группа соответствовала группе пациентов по полу и возрасту. Характеристики исследованных групп представлены в таблице 1.
Таблица 1
Характеристики исследованных групп
Показатели Пациенты (N = 11) Контроль (N=11) р
Средний возраст 54,2 ± 2,1 49,8 ± 3,5 0,22
Пол мужской 11 11
женский 0 0
Общий холестерин, ммоль/л 4,85 ± 1,31 5,33 ± 1,18 0,37
Х-ЛПВП, ммоль/л 1,22 ± 0,25 1,49 ± 0,33 0,09
Х-ЛПНП, ммоль/л 2,60 ± 1,06 3,09 ± 0,90 0,26
Х-ЛПОНП, ммоль/л 1,02 ± 0,55 0,75 ± 0,47 0,26
Триглицериды, ммоль/л 2,26 ± 1,21 1,66 ± 1,03 0,34
Коэффициент атерогенности 2,96 ± 0,62 2,73 ± 1,18 0,34
Средний стеноз 2,20 ± 0,81
Кол-во артерий 5,87 ± 3,83
Курение 4 3
Диабет 1 0
При постановке диагноза у всех пациентов и представителей контрольной группы измеряли энзиматическим колориметрическим методом с использованием наборов ByoSystems (Испания) концентрацию общего холестерина и холестерина в составе липопротеинов высокой плотности в плазме крови.
Для получения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равном соотношении с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Смесь наслаивали на фи-колл-верографин, центрифугировали (1500 об/мин, 30 мин), мононуклеары промывали в PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин). Затем клетки ресуспендиро-вали в культуральной среде (альфаМЕМ, 10 % эмбриональная сыворотка, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин), 15 нг/мл M—CSF) и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 2 ч. После чего прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали в присутствии фактора макрофагов M—CSF 15 нг/мл (R&D Systems, США) в течение 5 суток с ежедневной заменой питательной среды. Клетки отмывали в PBS, центрифугировали, хранили при температуре —86 °С.
праймеры и зонды, использованные в работе
Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратной транскрипции были использованы наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) и cDNA synthesis kit (Fermentas, Литва). Чистоту РНК оценивали по отношению поглощения при длинах волн 260 и 280 нм (критерий чистоты 1.8). Уровень мРНК генов LXRa, LXRfl, PPARy определяли методом ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 (BioRad, США). Последовательности праймеров и зондов, использованные в данной работе (Бигль, Санкт-Петербург), представлены в таблице 2. После денатурации при 95 °С в течение 10 мин проводили 45 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: плавление 95 °С — 30 с, отжиг-синтез 60 °С — 30 с. Измерения для каждой пробы повторяли в трех экземплярах. Относительное содержание мРНК LXRa, мРНК LXRfl, мРНК PPARу рассчитывали методом стандартных кривых. Количество мРНК LXRa, мРНК LXRfl, мРНК PPARу нормировали по отношению к мРНК эндогенного гена ACTB, т. е. делили количество мРНК LXRa, мРНК LXRfl, мРНК PPARy, рассчитанное с использованием CFX96 (BioRad,
Таблица 2
Ген Последовательности праймеров и зондов
LXRa 5'-CTTGCTCATTGCTATCAGCATCTT-3' 5'-ACATATGTGTGCTGCAGCCTCT-3' 5'-FAM-TCTGCAGACCGGCCCAACGTG-RTQ1-3'
LXRß 5'- CTTCGCTAAGCAAGTGCCTG-3' 5'- GCAGCATGATCTCGATAGTGG-3' 5'- CGGGAGGACCAGATCGCCCT- RTQ1-3'
PPARy 5'-GATGTCTCATAATGCCATCAGGTT-3' 5'- GGATTCAGCTGGTCGATATCACT-3' 5' -FAM-CCAACAGCTTCTCCTTCTCGGCCTG-RTQ1-3'
ACTB 5'-CGTGCTGCTGACCGAGG-3' 5'-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3' 5'-R6G-CCAACCGCGAGAAGATGACCCAGAT-BHQ1-3'
рис. 1. Относительные уровни LXRв мРНК в макрофагах для группы пациентов и контрольной группы, * — р < 0,001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена _^-актина. Ось абсцисс — исследуемые группы; ось ординат — относительный уровень мРНК (отн. ед.)
рис. 2. Относительные уровни PPARy мРНК в макрофагах для группы пациентов и контрольной группы, * — p < 0,001. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс — исследуемые группы; ось ординат — относительный уровень мРНК (отн. ед.)
США), на количество мРНК ACTB с последующим усреднением данных, расчетом отклонений и вычислением погрешности.
Статистическую обработку данных провели при помощи пакета программ Statistica 6.0. Показатели, полученные в различных группах, сравнивали с помощью непараметрического метода U-теста Манна—Уитни (p < 0,05 принимали за значимый уровень достоверности). Для анализа корреляции между количественными характеристиками использовался метод корреляции по Спирмену (Zar J. H. (1998) Biostatistical Analysis).
РЕЗУЛЬТАТЫ
макрофагам артериальной стенки, представляющих собой основной тип клеток, участвующих в метаболизме липидов при атеросклерозе (Rader et al., 2005).
ОТХ является основным процессом в снижении содержания холестерина в макрофагах и регресса атеро-склеротической бляшки (Meurs et al., 2010). Несмотря на наличие большого количества информации о роли LXRa, LXRß и PPARy как противовоспалительных и ан-тиатерогенных медиаторах, в настоящее время практически нет данных о роли экспрессии данных генов в развитии атеросклероза.
Наши эксперименты продемонстрировали достоверное снижение содержания мРНК LXRß (p < 0,001) и мРНК PPARy (p < 0,001) в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (рис. 1-2).
Уровень мРНК LXRa в макрофагах в исследуемых группах не отличался (p = 0,17) (рис. 3).
Корреляции уровня экспрессии генов LXRa, LXRß, PPARy с показателями липидного спектра крови и со степенью атеросклеротических повреждений не выявлено (данные не приведены).
ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение молекулярных механизмов атеросклероза артерий и возможности его коррекции в настоящее время приобрели особую значимость в связи с ростом заболевания практически во всех исследуемых популяциях. При этом особое внимание в исследованиях уделяется
рис. 3. Относительные уровни LXRa мРНК в макрофагах для группы пациентов и контрольной группы. Нормирование результатов проведено с помощью измерений соответствующих показателей для гена ß-актина. Ось абсцисс — исследуемые группы; ось ординат — относительный уровень мРНК (отн. ед.)
Именно определение уровня экспрессии этих транскрипционных факторов в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF, предпринято в настоящем исследовании.
Наше исследование продемонстрировало отсутствие корреляции уровня экспрессии генов LXRa, LXRß, PPARy с показателями липидного спектра крови. Логично предположить, что только уровень мРНК генов ядерных рецепторов не определяет концентрацию липидов плазмы крови. Полученные данные свидетельствуют, что в липидный обмен вовлечены многие факторы, и нет прямой связи между показателями ли-пидного спектра крови с уровнем транскрипционных факторов.
Было показано статистически значимое снижение содержания PPAR,у мРНК в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные пилотные данные могут свидетельствовать о том, что уменьшение уровня PPARy мРНК может быть ассоциировано с развитием атеросклероза.
В литературе существуют значительные противоречия относительно роли PPARy в развитии атеросклероза. Наши данные согласуются с результатами, в которых было отмечено снижение уровня экспрессии PPARy в атеросклеротических бляшках (Soumian et al., 2005) и в макрофагах, коррелировавшее с прогрессией атеросклероза (Giaginis et al., 2011).
С другой стороны, было показано значительное повышение содержания PPARy в макрофагах человека при атеросклерозе (Amoruso et al., 2009). В работе Sueyoshi и др. (Sueyoshi et al., 2010) также было показано, что уровень PPARy мРНК в атероматозных бляшках был достоверно выше, чем содержание PPARy мРНК в интиме сосуда. Эти данные дают возможность предположить, что экспрессия PPARy может быть связана с формированием атеросклеротических бляшек и PPARy участвует в ранних стадиях развития атеросклероза у человека.
LXR играют ключевую роль в патогенезе атеросклероза, регулируя экспрессию важных генов, вовлеченных в липидный гомеостаз и воспалительную реакцию в макрофагах (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010). Более того установлено, что LXR-ингибируют атеросклероз in vitro и in vivo (Calkin et al., 2012). При этом было продемонстрировано, что LXR агонисты увеличивают ОТХ за счет усиления экспрессии транспортеров ABCA1 и ABCG1 в макрофагах, что является основным моментом механизма LXR-зависимой защиты от атеросклероза (Calkin et al., 2012).
В нашем исследовании установлено сниженное содержания LXRß мРНК в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой, в то время как в содержании LXRa мРНК разница не показана.
Таким образом, наше пилотное исследование показало, что уровни экспрессии генов LXRfl и PPARy в макрофагах могут быть значимыми факторами, ассоциированными с развитием атеросклероза.
Работа поддержана РФФИ (грант № 10-04-01151-а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Amoruso A., Bardelli C., Fresu L. G. et al. (2009) peroxisome proliferator-Activated Receptor-Expression in Monocyte/Macrophages from coronary artery Disease patients and possible Gender Differences.
J. Pharmacol. Exp Ther. V. 331 (2): P. 531-538.
2. Apostoli A. J., Nicol C. J. (2012) ppAR medicines and Human disease: The ABcs of It Ah. PPAR Res. 20/2:504918.
3. Bensinger S. J., Tontonoz P. (2008) Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors. Nature. V. 454: P. 470-477.
4. Calkin A. C., Tontonoz P. (2012) transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activat-ed receptors LXR and FXR. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 13 (4): P. 213-24.
5. Giaginis C., Klonaris C., Katsargyris A. et al. (2011) correlation of peroxisome proliferator-activated Receptor-gamma (ppaR-gamma) and Retinoid X Receptor-alpha (RXR-alpha) expression with clinical risk factors in patients with advanced carotid atherosclerosis. Med. Sci. Monit. V. 17 (7): P. 381391.
6. Li A. C., Binder C. J., Gutierrez A. et al. (2004) differential inhibition of macrophage foam-cell formation and atherosclerosis in mice by ppaRalpha, beta/ delta, and gamma. J Clin. Invest. V. 114 (11): P. 1564-1576.
7. Meurs I., Van Eck M., Van Berkel T. J. (2010) High-density lipoprotein: key molecule in cholesterol efflux and the prevention of atherosclerosis. Curr. Pharm. Des. V. 16: P. 1445-1467.
8. Oosterveer M. H., Grefhorst A., Groen A. K. et al. (2010) the liver X receptor: control of cellular lipid homeostasis and beyond: implications for drug design. Prog. Lipid. Res. V. 49: P. 343-352.
9. Rader D. J., Pure E. (2005) lipoproteins, macrophage function, and atherosclerosis: beyond the foam cell? Cell metabolism. V. 1: P. 223-230.
10. Soumian S., Gibbs R., Davies A. et al. (2005) mRNa expression of genes involved in lipid efflux and matrix degradation in occlusive and ectatic atherosclerotic disease. J. Clin. Pathol. V. 58: P. 1255-1260.
11. Sueyoshi S., Mitsumata M., Kusumi Y. et al. (2010) Increased expression of peroxisome proliferator-ac-tivated receptor (ppaR)-alpha and ppaR-gamma in human atherosclerosis. Pathol. Res. Pract. V. 206 (7): P. 429-438.
12. Wahli W., Michalik L. (2012) PPARs at the crossroads of lipid signaling and inflammation. Trends Endocrinol. Metab. V. 23 (7): P. 351-363.
13. Zar J. H. (1998) Biostatistical Analysis. 4th edition. Prentice Hall.
REDUCING OF LXRß AND PPARy MRNA IN M-CSF STIMULATED MACROPHAGES IN PATIENTS WITH LEVELS ATHEROSCLEROSIS
Demina Ye. P., Miroshnikova V. V., Mayorov N. V., Davydenko V. V., Schvartzman A. L.
C SUMMARY: Nuclear receptors LXRa/ß and PPARy play tant role in lipid metabolism and reverse cholesterol transport. However, the influence of LXRa/ß and PPARy mRNA levels in macrophages on atherosclerosis remains unexplored. Using real time PCR, we determined LXRa mRNA, LXRß mRNA and PPARy mRNA levels in macrophages cultured for 5 days with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Levels of LXRß mRNA and PPARy mRNA in patients with arterial stenosis were reduced when compared with the control group, p < 0.001. LXRa gene mRNA level in macrophages was not changed in the study groups, (p = 0.17). Thus, our study shows that the LXRß and PPARy genes expression levels in macrophages may be significant factors associated with the development of atherosclerosis.
C KEY WORDS: artery stenosis; atherosclerosis; LXRa/ß genes; macrophages; PPARy gene.
C Информация об авторах
Демина Екатерина Петровна — научный сотрудник. Отдел молекулярной и радиационной биофизики, лаборатория молекулярной генетики человека. ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова. . Россия, 188300, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орлова роща. E-mail: [email protected].
Мирошникова Валентина Вадимовна — младший научный сотрудник. Отдел молекулярной и радиационной биофизики, лаборатория молекулярной генетики человека. ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова. Россия, 188300, Ленинградская обл., г.Гатчина, Орлова роща. E-mail: [email protected].
Майоров Николай Владимирович — аспирант. Кафедра госпитальной хирургии № 2. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова. 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8. E-mail: [email protected].
Давыденко Владимир Валентинович — профессор. Кафедра госпитальной хирургии № 2. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова. 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8. E-mail: [email protected].
Шварцман Александр Львович — д. б. н., зав. лаб. Отдел молекулярной и радиационной биофизики, лаборатория молекулярной генетики человека. ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова. 188300, Гатчина. Отдел молекулярной генетики. ФГБУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН. 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12. E-mail: [email protected].
Demina Yekaterina Petrovna — Molecular and Radiation Biophysics Department. B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg. 188300, Leningrad Region, Gatchina, Orlova rosha. E-mail: [email protected].
Miroshnikova Valentina Vadimovna — Molecular and Radiation Biophysics Department. B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg. Russia, 188300, Leningrad Region, Gatchina, Orlova rosha. E-mail: [email protected].
Mayorov Nikolay Vladimirovich — Hospital Surgery Department N 2. Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University. 197089, Saint-Petersburg, Lva Tolstogo St., 6/8. Russia. E-mail: [email protected].
Davydenko Vladimir Valentinovich — Hospital Surgery Department N 2. Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University. 197089, Saint-Petersburg, Lva Tolstogo St., 6/8. Russia. E-mail: [email protected].
Schwarzman Alexander Lvovich — Molecular and Radiation Biophysics Department. B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg. 188300, Gatchina. Russia. Molecular genetics Department. Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences. 197376, Saint-Petersburg, academica Pavlova St., 12. Russia. E-mail: [email protected].
