CC BY
97
УДК 575.22:340.6
Снижение риска инфицирования ВИЧ и летальности у гетерозигот по делеционному аллелю CCR5del32 гена хемокинового рецептора: исследование случая фокусной нозокомиальной ВИЧ-инфекции и мета-анализ
С. А. Боринская1, Ж. М. Кожекбаева1#, А. В. Залесов12, Е. В. Ользеева3, А. Р. Максимов4,
С. И. Куцев5##, |М. М. Гараев | 6, А. В. Рубанович1, Н. К. Янковский 12,7*
1Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Москва, ул. Губкина, 3 2Московский физико-технический институт, 141700, Московская область, Долгопрудный, Институтский пер., 9
3 Министерство здравоохранения и социального развития Республики Калмыкия, 358000, Элиста, ул. Н. Очирова, 6
4 ГУ «Центр крови Республики Калмыкия», 358000, Элиста, ул. Пушкина, 52
5 Ростовский государственный медицинский университет, 344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29
6 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16 7Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119899, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
# В настоящее время Университет Майами, Флорида, США.
## В настоящее время Российский национальный исследовательский медицинский университет, Москва.
*E-mail: yankovsky@vigg.ru Поступила в редакцию 17.10.2011 г.
РЕФЕРАТ Делеционный аллель CCR5del32 гена хемокинового рецептора R5 в гомозиготном состоянии почти полностью предотвращает инфицирование его носителей вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Однако данные о влиянии гетерозиготного носительства этого аллеля на риск инфицирования противоречивы. Мы исследовали влияние гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 на риск инфицирования, сравнивая частоты этого аллеля в группе детей (27 калмыков, 50 русских) с нозокомиальной ВИЧ-инфекцией (G-подтип ВИЧ-1) и в популяционных контрольных группах. В группе ВИЧ-инфицированных частота аллеля CCR5del32 оказалась ниже, чем в контрольной группе, но полученные различия были незначимыми. Аналогичные результаты приведены и в ряде ранее опубликованных статей. Незначимость различий может быть обусловлена либо случайным варьированием частот аллеля в отсутствие протективного эффекта, тогда при увеличении размера выборки различия частот останутся незначимыми, либо недостаточным размером выборки при наличии протективного эффекта. Поэтому, чтобы различить эти две возможности, мы провели мета-анализ опубликованных результатов 25 исследований (всего 5963 ВИЧ-инфицированных и 5048 индивидов в контрольных группах), включая наши собственные экспериментальные данные. Анализ показал, что аллель CCR5del32 в гетерозиготном состоянии препятствует инфицированию его носителей ВИЧ-1 (OR = 1.22, CI95% = 1.10-1.36). Риск инфицирования гетерозигот CCR5wt/del32 не менее чем на 13% ниже по сравнению с гомозиготами CCR5wt/wt. Подобные оценки для европеоидных групп получены впервые. В исследованной нами группе уровень смертности у гетерозиготных носителей аллеля CCR5del32 через 15 лет после инфицирования был на 40.9% ниже, чем в группе лиц, не имеющих этого аллеля. Размер изученной выборки был небольшим, а различия в уровне смертности в зависимости от генотипа по полиморфизму CCR5del32 статистически незначимыми (OR = 2.0; p = 0.705), однако полученные нами
оценки качественно и количественно совпадают с ранее опубликованными данными. Обсуждаются особенности проведения мета-анализа, влияющие на пороговую величину выявляемых эффектов и их статистическую значимость. Оценено влияние частот аллеля CCR5del32 на межэтнические различия в инфицируемости ВИЧ и смертности от СПИДа.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ВИЧ-инфекция, нозокомиальная инфекция, риск смерти, риск инфицирования, ген хе-мокинового рецептора, аллель CCR5del32, мета-анализ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита; ПЦР - полимеразная цепная реакция.
ВВЕДЕНИЕ
Эпидемия СПИДа, начавшаяся с зарегистрированных в 1981 г. единичных случаев, в настоящее время представляет одну из важнейших проблем здравоохранения как в России, так и во всем мире [1]. Развитие эпидемического процесса в России характеризуется формированием нозокомиальных очагов инфекции в 1988-1989 гг. Вспышка инфекции началась с госпитализированного в детскую больницу г. Элисты ВИЧ-инфицированного ребенка и в результате несоблюдения противоэпидемических мероприятий распространилась в больницах Калмыкии, Ростовской, Волгоградской областей и Ставропольского края. Всего из одного источника (фокусная инфекция) было инфицировано более 260 детей и их матерей [2, 3], многие из которых к настоящему времени умерли (рис. 1).
У части ВИЧ-инфицированных наблюдается быстрое, за 2-3 года, развитие заболевания и появление симптомов СПИДа, тогда как у других носителей ВИЧ симптомы не проявляются на протяжении долгого времени. Различия в скорости прогрессии заболевания могут быть обусловлены как внешними факторами (условия инфицирования, сопутствующие заболевания, проводимое лечение), так и индивидуальными генетическими особенностями больного [4].
Год
Рис. 1. Динамика выживаемости лиц с нозокомиальной ВИЧ-инфекцией - русских (Ростов-на-Дону - 107, Элиста - 13 человек) и калмыков (Элиста - 57 человек).
Среди генов человека, влияющих на ход развития ВИЧ-инфекции, наибольшее значение имеет ген CCR5, кодирующий СС-хемокиновый рецептор 5, опосредующий связывание ВИЧ с клеточной мембраной и проникновение определенных штаммов вируса в клетку [4]. Делеция 32 п.н. в гене CCR5, обозначаемая CCR5del32 (rs333), приводит к синтезу нефункционального белка. У носителей делеции в гомозиготном состоянии функциональные рецепторы CCR5 отсутствуют, а в случае гетерозиготного носитель-ства их количество снижено.
Делеционный аллель CCR5del32 встречается преимущественно в популяциях европейского происхождения. Частота его наиболее высока в странах Северной Европы (до 15-18%), тогда как в большинстве азиатских популяций частота этого аллеля не превышает 3-5%. В популяциях африканского происхождения и у коренного населения Америки и Океании этот аллель практически отсутствует [5-7].
Индивиды, гомозиготные по CCR5del32, доля которых в европейских популяциях составляет 1-2%, обладают высокой, но не абсолютной устойчивостью к инфицированию. Среди ВИЧ-инфицированных гомозиготные носители CCR5del32 встречаются очень редко - описано всего 12 таких случаев из более 20 000 обследованных, и у большинства из них вирус обладал тропизмом к рецептору CXCR4, но не к CCR5 [8-13]. Протективный эффект гомозиготности по аллелю CCR5del32 подтвержден как в ряде эпидемиологических исследований (повышенная частота гомозигот среди ВИЧ-негативных индивидов, подвергавшихся риску инфицирования), так и при инфицировании in vitro клеток CD4+, полученных от индивидов с различными генотипами [14].
Протективный эффект гетерозиготного носитель-ства CCR5del32 проявлялся и в развитии симптомов СПИДа у ВИЧ-инфицированных. Не исключено, что возможность бессимптомного недиагносцирован-ного носительства ВИЧ гетерозиготами CCR5del32/+ может способствовать распространению инфекции. У ВИЧ-инфицированных гетерозиготных носителей CCR5del32 вирусная нагрузка ниже, медленнее падает количество CD4+ Т-клеток, и симптомы СПИДа развиваются медленнее как у взрослых [8, 11, 13-17], так и у детей (большая часть которых ин-
фицирована перинатально) [18]. Частота гетерозиготных носителей CCR5del32 значительно выше в группе лиц, инфицированных в 1980-х гг. и проживших более 10 лет после инфицирования [11].
Однако данные о том, что гетерозиготное носитель-ство аллеля CCR5del32 защищает от инфицирования ВИЧ, остаются противоречивыми. Так, в ряде работ частота гетерозигот среди инфицированных была ниже, чем среди неинфицированных, подвергавшихся риску инфицирования, или в общей выборке из той же популяции, что может указывать на частичную резистентность индивидов с генотипом CCR5wt/del32 к ВИЧ-1 [10, 12]. В других исследованиях такой эффект обнаружен не был - различия в частотах гетерозигот CCR5wt/del32 и/или аллеля del32 между группами ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных индивидов либо отсутствовали, либо были статистически незначимыми [8, 19-21]. В представленной работе мы проанализировали влияние гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 на выживаемость детей с фокусной нозокомиальной ВИЧ-инфекцией и риск инфицирования при инъекционном пути заражения, а также провели мета-анализ опубликованных данных с целью оценки возможного снижения риска инфицирования у гетерозиготных носителей аллеля CCR5del32.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалом послужили образцы крови из коллекции лаборатории биотехнологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, собранные в различные периоды между 1991 и 2007 гг. во время плановых медицинских обследований лиц с нозокомиальной ВИЧ-инфекцией. Получено согласие родителей обследованных детей на использование части образцов для научных исследований. Уникальность этой выборки ВИЧ-инфицированных заключается в том, что в ней отсутствует вариабельность в развитии инфекции, связанная с различиями штаммов вируса -все были инфицированы одним и тем же штаммом вируса ^-подтип ВИЧ-1), источником которого послужил единственный больной ребенок (фокусная нозокомиальная инфекция) [22, 23]. Кроме того, большинство больных принадлежали к двум этническим группам (русские и калмыки), что снижает возможное влияние генетической гетерогенности в каждой из когорт. Анонимные данные о дате рождения пациентов и смерти в случае летальных исходов получены для 107 ВИЧ-инфицированных Ростовской обл. (все русские) и 60 ВИЧ-инфицированных из г. Элисты (47 калмыков и 13 русских). Для исследования были доступны образцы крови ВИЧ-инфицированных детей - 50 русских и 27 калмыков (возраст детей -от менее 1 года до 16 лет, в среднем 2.7 года). Контролем служили образцы крови здоровых доноров.
Первую группу составили студенты медицинского университета г. Ростова-на-Дону (большинство 1986-1990 года рождения), по данным опроса русские в двух поколениях, родившиеся в Ростовской обл. Вторую контрольную группу составили калмыки, проживающие в г. Элисте (этническую принадлежность устанавливали по данным опроса). Образцы крови собирали с соблюдением процедуры информированного согласия. Проект генетического исследования одобрен Этической комиссией ИОГен РАН.
Геномную ДНК выделяли из образцов венозной крови (объем до 50 мкл) с помощью коммерческого набора DNAPrep («Изоген», Москва) в соответствии с инструкцией производителя, в лаборатории биотехнологии НИИ вирусологии РАМН, оборудованной для работы с инфицированными образцами.
Генотипирование проводили с помощью ПЦР-амплификации образцов ДНК. Праймеры и условия амплификации описаны ранее [24]. Продукты ПЦР-амплификации подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле для определения размера фрагментов.
Оценка величины протективного эффекта аллеля CCR5del32 в гетерозиготном состоянии
Во всех выборках наблюдаемые эффекты единообразно характеризовали величиной отношения шансов (OR), которую рассчитывали как отношение шансов носительства генотипа wt/wt у ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных индивидов:
_ P(wt/wt\BM4+) . P(wt / wt | ВИЧ-')
UK =-------------------/-------------------=
1 - P(wt / wt IВИЧ+) 1 - P(wt / wt IВИЧ-) _ P(wt / wt IBM4+)P(wt / del IВИЧ-) ~ P{wt / del \BH4+)P(wt / wt | ВИЧ-) ’
где P(* | ВИЧ+) и P(* | ВИЧ-) - частоты генотипов в выборках инфицированных и здоровых соответственно. Отношение рисков (RR), которое определяется как отношение заболеваемости при различных генотипах, оценивали по формуле:
Р(ВИЧ+\ wt/ wt) Se 1 - P(wt / wt)
KK =-----------------=------■------------,
P(BM4+\wt / del) 1 -Se P(wt/wt)
где Se - чувствительность тестирования на предрасположенность, т.е. частота рискового генотипа wt/wt у больных, и P(wt/wt) - популяционная частота рискового генотипа.
Статистическую значимость частотных различий оценивали с использованием двустороннего точного критерия Фишера.
Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей по гену CCR5 у ВИЧ-инфицированных детей и в контрольных выборках
Группа N Число индивидов (частоты генотипов, %) Частота аллелей и стат. ошибка (±SE) Сравнение ВИЧ+ и контрольной группы
wt/wt wt/del del/del wt del
ВИЧ, дети калмыки 27 27 0 0 1 0 OR = 2.85 р=0.558
Контроль, калмыки Элисты 70 67 (95.71) 3 (4.28) 0 0.979 + 0.012 0.021 + 0.012
ВИЧ, русские дети 50 39 (78.0) 11 (22.0) 0 0.890 + 0.031 0.110 + 0.031 OR = 1.21 р = 0.690
Контроль, русские Ростовской обл. 99 73 (73.7) 25 (25.3) 1 (1.0) 0.864 + 0.024 0.136 + 0.024
Таблица 2. Частоты аллеля CCR5del32 (^333) в группах русских и у калмыков
Популяция N Частота аллеля CCR5del32 CI 95% Источник
Русские: Ленинградск. обл 33 0.166 0.083-0.300 [27]
Кострома 54 0.157 0.091-0.252 [28]
СПб. 50 0.130 0.069-0.223 [29]
Москва 83 0.139 0.088-0.208 [30]
Москва 176 0.122 4 6 .1 0. 8 8 .0 0. [31]
Рязань 78 0.12 8 8 .1 0. 2 7 .0 0. [32]
Липецк 48 0.104 2 9 .1 0. 5 4 .0 0. [Гараев М.М., собственные данные]
Новосибирск 53 0.104 0.051-0.187 [33]
г. Лысьва 186 0.100 0.070-0.138 [34]
Москва, без указания национальности 171 0.091 9 2 .1 0. 2 6 .0 0. [35]
Ростов-на-Дону 99 0.136 8 9 .1 0. 9 8 .0 0. Данная работа
Русские дети, ВИЧ 50 0.110 8 9 .1 0. 4 5 .0 0.
Калмыки 70 0.021 0.004-0.063
Калмыки дети, ВИЧ 27 0 0-0.073
Мета-анализ проводили с использованием свободно распространяемой компьютерной программы для эпидемиологов WinPepi V. 10 (2010) [25]. Программа позволяет оценить среднее значение OR согласно модели с фиксированными эффектами (оценка Мантеля-Хензеля) и модели со случайными эффектами (оценка по DerSimoшan-Laird). Выбор между моделями производится на основе анализа гетерогенности совокупности данных ^-тест Кохрена).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Частота аллелей и генотипов у ВИЧ-инфицированных и в контрольных группах
У каждого ребенка из выборки детей с нозокомиальной ВИЧ-инфекцией и у индивидов из контрольных групп были определены генотипы по гену CCR5 и выявлены носители аллеля CCR5del32 (табл. 1). Рас-
пределение генотипов во всех группах не отличалось значимо от равновесного по Харди-Вайнбергу.
Частота аллеля CCR5del32, в популяции калмыков установленная впервые, составила 0.021 ± 0.012. Такая низкая частота этого аллеля в популяции калмыков соответствует его частоте в соседствующих популяциях Кавказа (3-5%) и низкой частоте в популяциях Центральной Азии, родственных калмыкам по происхождению (например, 1.1% у монголов Китая [26]). В выборке из 27 ВИЧ-инфицированных детей калмыков носители этого аллеля не выявлены (отличия от частоты в контрольной группе незначимы: р =0.558 по точному тесту Фишера).
У русских, согласно опубликованным данным, в различных географических группах частота аллеля CCR5del32 варьирует от 0.104 до 0.157 (табл. 2) (см. обзор [7]). Так как большинство инфицированных русских детей в исследованной нами выборке
ї ї 3 4 5 б 7 S 9 їй її и їЗ ї4 ї5 їб ї7 ї8 ї9 Ю И И їЗ ї4 ї5
Рис. 2. Частоты гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 среди ВИЧ-инфицированных (ВИЧ+) и здоровых лиц (ВИЧ-). 1 - бельгийцы и французы [10];
2 - швейцарцы (ВИЧ-инфицированные [36], контроль
[37]); 3 - евроамериканцы [38]; 4 - датчане [39];
5 - итальянцы, Милан [40]; 6 - австралийцы [41]; 7 -финны [42]; 8 - словенцы [43]; 9 - испанцы, Астурия [44]; 10 - жители Москвы [19]; 11 - русские (ВИЧ-инфицированные - москвичи, контроль - русские, Рязань) [20]; 12 - испанцы, Южная Испания [45]; 13 -испанцы [46]; 14 - венгры [47]; 15 - русские, Пермский край [34]; 16 - евроамериканки [48]; 17 - немцы, Мюнхен [49]; 18 - евроамериканцы, Сиэтл [50]; 19 -поляки [51]; 20 - итальянцы [52]; 21 - эстонцы [21];
22 - немцы [13]; 23 - словаки [53]; 24 - поляки, Щецин [54]; 25 - русские, Ростовская обл. (данная работа).
находились в больницах Ростова-на-Дону, а частота аллеля CCR5del32 у русских Ростовской обл. не была известна, контрольную группу сформировали из добровольцев - студентов медицинского института Ростова-на-Дону, русских в двух поколениях (согласно данным опроса), родившихся в Ростовской обл. Частота аллеля CCR5del32 в этой группе составила 0.136 ± 0.024, что находится в пределах диапазона вариабельности частот в различных географических группах русских. У ВИЧ-инфицированных русских детей частота аллеля CCR5del32 оказалась несколько ниже (0.110 ± 0.031), однако различия не достигали значимого уровня (OR = 1.21, р = 0.69).
При столь небольшом размере выборок более низкая частота аллеля CCR5del32 у ВИЧ-инфицированных по сравнению с контролем может быть как случайным эффектом, так и результатом протективного действия этого аллеля.
В ряде работ получены данные о более низкой частоте аллеля CCR5del32 и/или более низкой частоте гетерозигот wt/del32 среди ВИЧ-инфицированных по сравнению с популяционным контролем, причем во многих случаях эти различия также не достигают
значимого уровня, тогда как в других исследованиях выявлено обратное соотношение частот (рис. 2 и база данных частот аллелей (лаборатория анализа генома ИОГен РАН) http://vigg.ru/institute/podrazdelenija/ otdel-genomiki-i-genetiki-cheloveka/laboratorija-analiza-genoma/allefdb/ccr5-hiv/). Для оценки возможного протективного эффекта гетерозиготности по CCR5del32 мы провели мета-анализ опубликованных данных по частоте гетерозигот CCR5wt/del32 среди ВИЧ-инфицированных и в контрольных группах.
Мета-анализ: снижает ли гетерозиготность по CCR5del32 риск инфицирования?
Для проведения мета-анализа из более чем 360 статей, выявляемых в PubMed по запросу «CCR5 AND deletion AND HIV» (сентябрь 2011 г.), отобрали статьи, в которых сравниваются частоты аллелей и генотипов в выборках ВИЧ-инфицированных и в соответствующих контрольных выборках неин-фицированных индивидов. Публикации, в которых изучали азиатские, африканские и латиноамериканские популяции с частотой аллеля CCR5del32 1-3% или ниже, из анализа исключали.
Из-за различий частот аллеля CCR5del32 в популяциях европейского происхождения (от 5-8% на юге Европы до 15-18% на севере) [7] необходимо, чтобы этническая принадлежность индивидов контрольных групп (а в некоторых случаях и подгрупп внутри этнической группы) строго соответствовала принадлежности группы инфицированных. Поэтому публикации, в которых этническая принадлежность групп не указана или выборки не были этнически гомогенными, также исключили. В итоге для мета-анализа отобрали 25 групп европеоидов, включая нашу выборку, - всего 5967 ВИЧ-инфицированных и 5410 индивидов в контрольных группах (табл. 3).
Частота гомозиготных носителей делеции составила 4 из 5967 среди ВИЧ-инфицированных против 63 из 5410 в контроле. Такое соотношение соответствует OR = 17.6 при р = 4.4 х 10-16. В данном случае величина относительного риска приблизительно
Таблица 3. Уровень смертности к 2006 г. в исследованных выборках в зависимости от генотипа
Генотип Русские Калмыки
wt/wt 12 из 39 (30.8%) 11 из 27 (40.7%)
wt/del32 2 из 11 (18.2%) -
Всего 14 из 50 (28.0%) 11 из 27 (40.7%)
Рис. 3. Оценки отношений шансов (OR) и соответствующие 95% доверительные интервалы для 25 выборок европеоидов (перечислены в подписи к рис. 2). Вертикальная пунктирная линия соответствует OR = 1 (отсутствие эффектов). Точки справа от этой прямой указывают на протективный эффект генотипа wf/CCR5del32. Размеры маркеров-квадратиков условно пропорциональны объемам выборок. Нижний маркер-ромб соответствует усредненной оценке OR по Мантелю-Хензелю (МН-среднее).
Бельгийцы, французы [10]
Швейцарцы [36, 37]
Евроамериканцы 38]
Датчане 39]
Итальянцы 40]
Австралийцы 41]
Финны 42]
Словенцы 43]
Испанцы 44]
Москвичи 19]
Русские 20]
Испанцы 45]
Испанцы 46]
Венгры 47]
Русские 34]
Евроамериканки 48]
Немцы 49]
Евроамериканцы 50]
Поляки 51]
Итальянцы 52]
Эстонцы 21]
Немцы 13]
Словаки 53]
Поляки 54]
Русские, наст. работа МН-среднее
0 12 3 4 5
Ок
равна величине OR, т.е. вероятность инфицирования гомозиготных по делеции лиц в 17.6 раза меньше, чем носителей остальных генотипов. Близкие оценки протективного эффекта гомозиготного носитель-ства делеции получены в отдельных исследованиях евроамериканцев при сравнении групп серонегативных индивидов, подвергавшихся риску инфицирования, с серопозитивными и популяционным контролем [9, 38] и в других исследованиях [10, 11]. Поэтому гомозиготы CCR5del32/ CCR5del32 были исключены из дальнейшего анализа, и для оценки риска инфицирования рассматривали соотношение гетерозиготных носителей аллеля CCR5del32 и индивидов, у которых этот аллель отсутствовал, т.е. соотношение генотипов wt/CCR5del32 и wt/wt в группах ВИЧ-инфицированных и в популяционном контроле.
Сравнение частот генотипов показало, что только в 4 из 25 исследований, вошедших в метаанализ, частота гетерозигот wt/CCR5del32 у ВИЧ-инфицированных была выше, чем у здоровых лиц (рис. 2). При предположении о случайности эффекта вероятность события «из 25 работ не более чем в четырех частота гетерозигот у больных выше, чем у здоровых» и равна 4.7 х 10-7 (аналогично вероятности выпадения не более четырех «орлов» в 25 бросаниях монеты).
Для каждой выборки вычислено отношение шансов (OR) и проведено их усреднение с учетом численности выборок и степени однородности эффектов. Результаты представлены в графической форме (рис. 3).
Проведенный по результатам 25 исследований мета-анализ обнаружил, что частота гетеро-
зигот wt/CCR5del32 по отношению к гомозиготам wt/wt в выборках ВИЧ-инфицированных достоверно ниже, чем в контроле (р = 0.0002 по двустороннему точному тесту Фишера и р = 0.00018 по тесту х2). По Q-тесту Кохрена гетерогенность данных незначима: х2 = 25.29, р = 0.39. Доля изменчивости, обусловленная гетерогенностью значений OR, равна I2 =5.1% (С195% = 0-36.4%). Эта величина существенно меньше критического значения (50%), что позволяет принять «модель с фиксированными эффектами», а для усреднения значений OR использовать формулу Мантеля-Хензеля (МН-среднее). Итоговое значение эффекта достаточно низкое - OR = 1.22, CI95% = 1.10-1.36. Однако эти оценки имеют большой запас устойчивости: необходимо добавить 28 исследований, в которых частоты генотипов не различались бы между выборками больных и в контроле (OR = 1), чтобы итоговое значение эффекта снизилось до незначимого уровня OR = 1.1.
При проведении мета-анализа принято рассматривать возможность искажения представленности данных в публикациях (publication bias). Это связано с тем, что и авторы работ и редакции журналов охотнее публикуют положительные результаты, чем отрицательные или «нулевые». Кроме того, слишком часто публикуются работы с большими эффектами, полученными на малых выборках. Все это может привести к завышению оценки усредненного значения эффекта при мета-анализе (рис. 4А). Стандартный метод проверки симметричности данных состоит
А
в построении зависимости величины эффекта (OR) от объема выборки ^иппе1-рЫ - «график-воронка»). Сильная асимметрия этого графика может указывать на избирательную представленность данных в публикациях. В нашем случае асимметрия незначима (рис. 4Б): ранговая корреляция Кендалла между ОЯ и объемом выборки равна 0.21 при р = 0.187; асимметрия по регрессионному тесту [55] недостоверна (р = 0.148).
Таким образом при мета-анализе, в который вошли и наши собственные экспериментальные данные, выявлен статистически значимый, хотя и слабый протективный эффект гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 в отношении инфицирования ВИЧ: ОЯ = 1.22 при р = 2 х 10-4. Достаточно низкое значение ОЯ объясняет, почему в большинстве статей не обнаружены значимые различия в частоте гетерозигот по данному аллелю (и частот аллеля) между ВИЧ-инфицированными и контрольными группами. Вычисления показывают, что при частоте делецион-ного аллеля, равной 10%, и ОЯ = 1.22 значимый эффект (р = 0.05 при мощности 80%) может быть обнаружен лишь при общем объеме выборки 4500 (2250 больных и 2250 здоровых).
Полученная оценка ОЯ = 1.22 не означает, что риск инфицирования у носителей генотипа wt/wt на 22% выше, чем у гетерозиготных носителей аллеля CCR5del32. ОЯ - это отношение шансов, но не рисков инфицирования. Отношение рисков (ЯЯ), которое определяется как отношение заболеваемости
Б
OR
Рис. 4. Зависимость величины эффекта (OR) от состава выборок, вошедших в мета-анализ (funnel-plot - «график-воронка»). Сильная асимметрия этого графика может указывать на избирательную представленность данных в публикациях (publication bias). А — Гипотетическое распределение исследований по размеру изученных выборок и силе эффекта. При исключении менее охотно публикуемых результатов, полученных на малых выборках со слабыми эффектами (точки в пунктирном овале), значение OR оказывается завышенным (красная стрелка) относительно «реального» (черная стрелка). Б - Распределение исследований по размеру выборок и силе эффекта для 25 публикаций, включенных в мета-анализ в данной работе (асимметрия незначима).
при различных генотипах, невозможно непосредственно оценить в ассоциативных исследованиях типа «случай-контроль». Можно лишь предложить различные косвенные оценки RR на основе значений OR и популяционных частот аллелей, либо данных по заболеваемости [56]. Кроме того, всегда выполняется неравенство: OR > RR. По результатам настоящего мета-анализа соответствующие оценки равны: SE = 0.851 и P(wt/wt) = 0.835, откуда RR = 0.13. Таким образом, у гомозигот wt/wt вероятность инфицирования как минимум на 13% выше, чем у носителей аллеля CCR5del32.
Наша оценка основана на сравнении соотношения частот генотипов wt/ CCR5del32 и wt/wt у ВИЧ-инфицированных и в популяционном контроле. При этом очевидно, что ВИЧ-инфицированные контактировали с вирусом и были инфицированы, а в популяционном контроле индивиды с вирусом не контактировали (доля контактировавших и/или ВИЧ-инфицированных предполагается пренебрежимо малой в исследованных популяциях европейского происхождения). Более точно оценить протективный эффект гетерозиготности можно при использовании контрольной группы из индивидов, контактировавших с вирусом, но оставшихся ВИЧ-негативными. Однако в существующих группах высокого риска (больные гемофилией; половые партнеры ВИЧ-инфицированных; потребители инъекционных наркотиков; мужчины, практикующие незащищенные рецептивные анальные половые контакты с мужчинами (МБМ); лица, занимающиеся проституцией) доля индивидов, контактировавших с вирусом, сильно различается и не всегда может быть установлена. При проведении мета-анализа результатов таких исследований можно использовать модель со случайными эффектами. Однако из-за гетерогенности выборок оценки OR в различных исследованиях в значительной мере отражают не собственно протективный эффект аллеля в группе контактировавших с вирусом, а вероятность контакта с вирусом в различных группах риска.
Этот феномен можно проиллюстрировать, сравнивая частоты гомозигот по делеционному аллелю среди неинфицированных индивидов в двух группах риска - больных гемофилией [57] и мужчин MSM
[38]. У неинфицированных индивидов в группе MSM частота гомозигот CCR5del32/del32 составила 4.5% (5 из 111 человек), а среди неинфицированных больных гемофилией - 16.3% (7 из 43 человек), при том, что популяционная частота таких гомозигот в европеоидных популяциях не превышает 1-2%. Различия в частотах гомозиготных носителей делеции в двух группах риска статистически значимы (р = 0.038, двусторонний тест Фишера). Более высокая частота
гомозигот CCR5del32/del32 среди больных гемофилией объясняется более высоким риском заражения - у получавших интенсивное лечение препаратами крови в 1978-1985 гг. он составлял 94% [57]. Так как почти 100% больных, получавших препараты крови, контактировали с вирусом, можно полагать, что более высокая частота гомозигот по делецион-ному аллелю, т.е. более выраженный протективный эффект, не может быть достигнут из-за генетической гетерогенности признака устойчивости к заражению макрофаготропными штаммами ВИЧ [58], подобно тому, как в природных условиях в одной и той же популяции происходит отбор протективных аллелей различных генов, обеспечивающих устойчивость к инфекции (например, к малярии).
Влияние гетерозиготности по аллелю CCR5del32 на уровень выживаемости ВИЧ-инфицированных индивидов
Внутри обеих выборок (русских и калмыков) ранее наблюдали вариабельность в скорости перехода ВИЧ-инфекции к СПИДу и в уровне летальности, связанную с факторами негенетической природы (возрастом инфицирования, который составляет в этих выборках от нескольких месяцев до 14 лет, в среднем 2.5 года), интенсивностью парентеральных вмешательств, сопутствующими заболеваниями [3].
К 2006 г. уровень смертности в исследованной нами выборке составил 32.5% (25 из 77 человек). Среди инфицированных русских детей смертность составила 28.0% (14 из 50), среди детей-калмыков - 40.7% (11 из 27). Уровень смертности русских в изученной группе к 2006 г. был на 31.2% ниже, чем у калмыков, однако при данных объемах выборок эти различия не были значимыми (р = 0.311). Тем не менее регрессии, описывающие динамику смертности в целом, значимо отличаются: угловой коэффициент наклона регрессии для русских детей составляет -0.016 ± 0.004 против -0.025 ± 0.002 для детей-калмыков (р = 0.02, двусторонний Z-тест). Для совокупности данных, приведенных на рис. 1, соответствующие оценки равны: -0.025 ± 0.002 у русских против -0.033 ± 0.002 у калмыков (р = 0.005, двусторонний Z-тест).
Мы проверили, влияет ли носительство аллеля CCR5del32 на выживаемость инфицированных и могут ли различия в продолжительности жизни после инфицирования в двух этнических группах быть связаны с различием в частоте CCR5del32.
В исследованной нами выборке у ВИЧ-инфицированных детей-калмыков делеционный аллель не выявлен - все они имели генотип wt/wt. Среди инфицированных русских детей с генотипом wt/wt уровень смертности составил
30.8% (12 из 39), тогда как среди носителей аллеля CCR5del32 - 18.2% (2 из 11) (табл. 3). Таким образом, уровень смертности русских детей с генотипом wt/CCR5del32 через 15 лет после инфицирования на 40.9% ниже, чем у детей без делеционного аллеля, однако эти различия статистически незначимы (OR = 2.0; р = 0.705). Ограниченный размер выборок не позволяет принять или опровергнуть гипотезу о том, что различия в продолжительности жизни в двух этнических группах связаны с различием в частотах аллеля CCR5del32. Тем не менее следует отметить буквальное совпадение полученных нами незначимых оценок с опубликованными ранее данными. Согласно результатам мета-анализа 19 когорт ВИЧ-инфицированных (всего 1635 европеоидов), протективный эффект гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 проявляется 39-процентным снижением риска смерти [17]. При таком уровне эффекта (OR = 2) для достижения статистической значимости размер выборки инфицированных должен составлять не менее 550 человек при смертности 30% и 400 человек в момент, когда смертность достигает 60%.
Например, в исследовании 507 ВИЧ-инфицированных поляков, наблюдавшихся в течение 15 лет в период до внедрения антиретровирусной терапии, различия в уровне смертности между носителями генотипов wt/del32 и wt/wt составили 49% (при общей смертности 19%), и эти различия были статистически значимыми (р = 0.026), тогда как у лиц, получавших лечение (442 индивида), такие различия были незначимыми (р = 0.23) [59].
ОБСУЖДЕНИЕ
На основе мета-анализа опубликованных данных нами впервые оценено влияние гетерозиготного но-сительства делеционного аллеля CCR5del32 на риск ВИЧ-инфицирования в популяциях европейского происхождения (без учета пути заражения, серотипа вируса и различий в проведении антиретровирусной терапии). Выявленный нами протективный эффект невелик (OR = 1.22), но статистически значим, и соответствует, согласно расчетам, не менее чем 13-процентному снижению риска инфицирования у носителей генотипа CCR5wt/del32. Небольшая величина ОЯ объясняет, почему в большинстве статей обнаруживаемые различия в частотах генотипов и/или аллеля CCR5del32 между группами ВИЧ-инфицированных и популяционным контролем статистически незначимы.
Демонстрация достоверности данного феномена требует исследования выборок тем большего размера, чем ниже частота встречаемости аллеля в популяции. В частности, в популяциях Китая, где частота
встречаемости аллеля CCR5del32 ниже, чем у европейцев, мета-анализ (14 исследований, 1607 инфицированных и 1632 индивида в контрольных группах) не обнаружил значимого протективного эффекта гетерозиготного носительства wt/del32: OR = 1.156 (CI 95%= 0.808-1.654) [60].
Аллель CCR5del32 встречается преимущественно в популяциях европейского происхождения, при этом частота его в популяциях юга Европы (у испанцев, итальянцев, греков) составляет 5-8% и достигает 15-18% у более северных групп (финны, эстонцы, мордва, татары и др.) [7]. У русских частота аллеля CCR5del32 довольно высока (от 10 до 17% в разных регионах), тогда как в другой изученной нами группе -калмыки - частота этого аллеля равна 2%. Могут ли различия в частоте протективного аллеля CCR5del32 играть существенную роль в защите от ВИЧ-инфекции на популяционном уровне или объяснять различия в смертности ВИЧ-инфицированных?
Теоретически популяционные эффекты, обусловленные присутствием делеционного аллеля, можно оценить следующим образом. Пусть q - частота делеционного аллеля и S , S ,, S,, - выживаемость
ww7 wd аа
инфицированных носителей генотипов wt/wt, wt/CCR5del32, CCR5del32/CCR5del32 соответственно. Тогда средняя популяционная выживаемость Spop превышает выживаемость носителей генотипа wt/wt на величину
AS = S - S = (1 - q)2S +
pop ww V 1 S ww
+ 2q(1 - q)Swd + q2Sdd - Sm - 2(Swd - Sm)q.
В последнем равенстве мы пренебрегли членами порядка q2. Таким образом, протективный эффект гетерозиготного носительства аллеля CCR5del32 (40-процентное снижение смертности инфицированных) при частоте данного аллеля 10% дает 8-процентное снижение смертности в целом для ВИЧ-инфицированных по сравнению с группой, в которой носители аллеля отсутствуют. Аналогично рассчитывается снижение риска инфицирования за счет присутствия в популяции аллеля CCR5del32. Если вероятность инфицирования гетерозигот понижена на 13%, то в популяции в целом частота инфицирования снижена на 3.3%. При 15-процентной частоте аллеля снижение инфицируемости составило бы 5.6%, а смертности ВИЧ-инфицированных - 12%.
Таким образом, на популяционном уровне защита от инфицирования ВИЧ и снижение смертности ВИЧ-инфицированных даже в группах с высокой частотой CCR5del32 (15%) невелика. Помимо CCR5del32 имеются другие гены, которые влияют на восприимчивость к ВИЧ и ход развития ВИЧ-инфекции [61]
и могут вносить вклад в межпопуляционные различия. Например, русские и калмыки различаются по частотам протективного генотипа С/C по полиморфизму в регуляторном участке гена интерлейкина 10 7Ы0-592 А/С (49% у русских Ростовской обл. и 33% у калмыков Элисты) и по частотам протективного аллеля CCR2-64I (12% у русских Ростовской обл. и 23% у калмыков Элисты) (собств. неопубл. данные). Однако возможный вклад этих генов в межпопуля-
ционные различия развития ВИЧ-инфекции требует дальнейших исследований, в которых, как надеются авторы, выборки с нозокомиальными инфекциями более не будут доступны. •
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 07-04-01281а) и Подпрограммы «Генофонды и генетическое разнообразие» Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bridge J., Lazarus J.V., Atun R. // AIDS. 2010. V. 24. Suppl 3.
P. S86-S94.
2. Покровский В.В., Ерамова И.Ю., Деулина М.О., Липети-ков В.В., Слюсарева Л.А., Чемизова Н.М., Савченко С.П. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1990. № 4. С. 17-23.
3. Покровский В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИДа. М.: Медицина, 1996.
4. Restrepo С., Rallon N.I., Carrillo J., Soriano V., Blanco J., Benito J.M. // AIDS Rev. 2011. V. 13. № 1. P 30-40.
5. Martinson J.J., Chapman N.H., Rees D.C., Liu Y.T., Clegg J.B. // Nat. Genet. 1997. V. 16. № 1. P. 100-103.
6. Novembre J., Galvani A.P., Slatkin M. // PLoS Biol. 2005. V. 3. № 11. P. e339.
7. Balanovsky O., Pocheshkhova E., Pshenichnov A., Solovieva
D., Kuznetsova M., Voronko O., Churnosov M., Tegako
0., Atramentova L., Lavryashina M., et al. // J. Physiol. Anthropol. Appl. Human Sci. 2005. V. 24. № 4. P 375-382.
8. Huang Y., Paxton W.A., Wolinsky S.M., Neumann A.U., Zhang L., He T., Kang S., Ceradini D., Jin Z., et al. // Nat. Med. 1996.
V. 2. P. 1240-1243.
9. Liu R., Paxton W.A., Choe S., Ceradini D., Martin S.R. // Cell.
1996. V. 86. P 367-377.
10. Samson M., Libert F., Doranz B.J., Rucker J., Liesnard C., Farber C.M., Saragosti S., Lapoumeroulie C., Cognaux J., Forceille C. // Nature. 1996. V. 382. P. 722-725.
11. Dean M., Carrington M., Winkler C., Huttley G.A., Smith M.W., Allikmets R., Goedert J., Buchbinder S.P., Vittinghoff E., Gomperts E., et al. // Science. 1996. V. 273. P 1856-1862.
12. Marmor M., Sheppard H.W., Donnell D., Bozeman S., Celum C., Buchbinder S., Koblin B., Seage G.R., HIV Network for Prevention Trials Vaccine Preparedness Protocol Team. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2001. V. 27. № 5. P 472-481.
13. Agrawal L., Lu X., Qingwen J., VanHorn-Ali Z., Nicolescu
1.V., McDermott D.H., Murphy P.M., Alkhatib G. // J. Virol. 2004. V. 78. P 2277-2287.
13. Oh D.Y., Jessen H., Kflcherer C., Neumann K., Oh N., Pog-gensee G., Bartmeyer B., Jessen A., Pruss A., Schumann R.R., et al. // PloS One. 2008. V. 3. № 7. P. e2747.
14. Hendel H., Henon N., Lebuanec H., Lachgar A., Poncelet H., Caillat-Zucman S., Winkler C.A., Smith M.W., Kenefic L., O'Brien S., et al. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 1998. V. 19. P 381-386.
15. Misrahi M., Teglas J.P., N'Go N., Burgard M., Mayaux M.J., Rouzioux C., Delfraissy J.F., Blanche S. // JaMa. 1998. V. 279. P. 277-280.
16. Ioannidis J.P., Contopoulos-Ioannidis D.G., Rosenberg P.S., Goedert J.J., De Rossi A., Espanol T., Frenkel L., Mayaux M.J., Newell M.L., Pahwa S.G., et al. // AIDS. 2003. V. 17. P. 16311638.
17. Mulherin S.A., O'Brien T.R., Ioannidis J.P., Goedert J.J., Buchbinder S.P., Coutinho R.A., Jamieson B.D., Meyer L., Michael N.L., Pantaleo G., et al. // AIDS. 2003. V. 17. P. 377-387.
18. Barroga C.F., Raskino C., Fangon M.C., Palumbo P.E., Baker C.J., Englund J.A., Spector S.A. // J. Infect Dis. 2000. V. 182.
№ 2. P 413-419.
19. Казеннова Е.В., Ааpонс Э., Селимова Л.М., Ладная Н.Н., ^авченко А.В., Жемчугов В.Е., Чейнгсонг-Попов P., Вебеp Д., Поповский В.В., Бобков А.Ф. // Вопр. вирусологии. 1998. Т. 43. № 1. С. 30-32.
20. Шадрина М.И., Копылов В.М., Милосердова О.В., Сломин-ский П.А., Лимборская С.А. // Генетика. 2000. Т. 36. № 5.
С. 718-720.
21. Adojaan M., Molder T., Mannik A., Kivisild T., Villems R., Krispin T., Ustav M. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2007.
V. 23. № 2. P 193-197.
22. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Garaev M., Rzhanino-va A., Kaleebu P., Beddows S., Bachmann M.H., Mullins J.I., Louwagie J., Janssens W., et al. // AIDS. 1994. V. 8. № 12.
P 1649-1655.
23. Гафарова И.Э., Шидеева Ж.А., Санджиева Д.Б., Гараев М.М. // Вопр. вирусологии. 2010. Т. 55. № 1. С. 16-22.
24. Сломинский П.А., Шадрина М.И., Спицын В.А., Микулич
A.И., Хуснутдинова Э.К., Лимборская С.А. // Генетика. 1997. Т. 33. № 11. С. 1596-1598.
25. Abramson J.H. // Epidemiol. Perspectives & Innovations. 2004. V. 1. P. 6.
26. Du Q., Wang F., Hong W., Liu M., Jin L., Shi H., Lei Z., E E. // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2000. V. 6. P 413-416.
27. Magierowska M., Lepage V., Boubnova L., Carcassi C., de Juan D., Djoulah S., El Chenawi F., Grunnet N., Hallo L., Ivanova R., et al. // Immunogenetics. 1998. V. 48. P 417-419.
28. Кожекбаева Ж.М., Бородина Т. А., Боринская С.А., Гусар
B.А., Фещенко С.П., Ахметова В.Л., Хусаинова РИ., Гупало Е.Ю., Спицын В.А., Гречанина Е.Я., и др. // Генетика. 2004.
Т. 40. № 10. С. 1394-1401.
29. Асеев М.В., Шауи А., Дин М., Баранов В.С. // Генетика. 1997. Т. 33. № 12. С. 1724-1726.
30. Libert F., Cochaux P., Beckman G., Samson M., Aksenova M., Cao A., Czeizel A., Claustres M., de la Rua C., Ferrari M., et al. // Hum. Mol. Genet. 1998. V. 7. № 3. P. 399-406.
31. Voevodin A., Samilchuk E., Dashti S. // J. Med. Virol. 1998.
V. 55. P. 147-151.
32. Limborska S.A., Balanovsky O.P., Balanovskaya E.V., Slo-minsky P.A., Schadrina M.I., Livshits L.A., Kravchenko S.A., Pampuha V.M., Khusnutdinova E.K., Spitsyn V.A. // Hum. Hered. 2002. V. 53. № 1. P. 49-54.
33. Yudin N.S., Vinogradov S.V., Potapova T.A., Naykova T.M., Sitnikova V.V., Kulikov I.V., Khasnulin V.I., Konchuk C., Vlo-schinskii PE., Ivanov S.V., et al. // Hum. Genet. 1998. V. 102.
P. 695-698.
34. Рябов Г.С., Казеннова Е.В., Корепанова Л.Б., Мальцева
Е.А., Жалнин В.В., Красникова Л.А., Зверев С.Я., Покровский В.В., Бобков А.Ф., Вебер Дж.Н. // Вопр. вирусологии. 2002. Т. 42. № 4. С. 13-16.
35. Ryabov G.S., Kazennova E.V., Bobkova M.R., Bobkov A.F. // Genet. Test. 2004. V. 8. № 1. P 73-76.
36. Morawetz R.A., Rizzardi G.P, Glauser D., Rutschmann O., Hirschel B., Perrin L., Opravil M., Flepp M., von Overbeck J., Glauser M.P., et al. // Eur. J. Immunol. 1997. V. 27. № 12.
P. 3223-3227.
37. Lucotte G. // Hum. Immunol. 2001. V. 62. № 9. P. 933-936.
38. Zimmerman PA., Buckler-White A., Alkhatib G., Spalding T., Kubofcik J., Combadiere C., Weissman D., Cohen O., Rub-bert A., Lam G., et al. // Mol. Med. 1997. V. 3. P. 23-36.
39. Eugen-Olsen J., Iversen A.K., Garred P, Koppelhus U., Pedersen C., Benfield T.L., Sorensen A.M., Katzenstein T., Dickmeiss E., Gerstoft J., et al. // AIDS. 1997. V. 11. P. 305-310.
40. Balotta C., Bagnarelli P., Violin M., Ridolfo A.L., Zhou D., Berlusconi A., Corvasce S., Corbellino M., Clementi M., Clerici M., et al. // AIDS. 1997. V. 11. № 10. P 67-71.
41. Stewart G.J., Ashton L.J., Biti R.A., Ffrench R.A., Bennetts B.H., Newcombe N.R., Benson E.M., Carr A., Cooper D.A., Kal-dor J.M. // AIDS. 1997. V. 11. № 15. P 1833-1838.
42. Pastinen T., Liitsola K., Niini P, Salminen M., Syvanen A.C. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. V. 14. № 8. P 695-698.
43. Poljak M., Tomazic J., Seme K., Maticic M., Vidmar L. // Acta Virol. 1998. V. 42. № 1. P. 23-26.
44. Alvarez V., Lopez-Larrea C., Coto E. // Hum. Genet. 1998.
V. 102. № 4. P 483-486.
45. Ruiz A., Royo J.L., Rubio A., Borrego S., Leal M., Sanchez
B., Nunez-Roldan A., Antinolo G. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001. V. 17. № 2. P. 191-193.
46. Barber Y., Rubio C., Fernandez E., Rubio M., Fibla J. // J. Infect Dis. 2001. V. 184. № 10. P. 1279-1288.
47. Barabas E., Kemeny B., Gonzalez R., Varkonyi V., Nagy K., Horvath A. // Int. J. STD AIDS. 2002. V. 13. № 10. P. 691-697.
48. Philpott S., Burger H., Charbonneau T., Grimson R., Ver-mund S.H., Visosky A., Nachman S., Kovacs A., Tropper P., Frey H., et al. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 1999. V. 21.
№ 3. P. 189-193.
49. Bogner J.R., Lutz B., Klein H.G., Pollerer C., Troendle U., Goebel F.D. // HIV Med. 2004. V. 5. № 4. P 64-72.
50. Liu H., Hwangbo Y., Holte S., Lee J., Wang C., Kaupp N., Zhu H., Celum C., Corey L., McElrath M.J. // J. Infect. Dis. 2004.
V. 190. № 6. P. 1055-1058.
51. Wasik T.J., Smolen J., Kruszynski P., Bratosiewicz-Wasik J., Beniowski M. // Wiad Lek. 2005. V. 58. № 9-10. P. 500-507.
52. Trecarichi E.M., Tumbarello M., de Gaetano Donati K., Tamburrini E., Cauda R., Brahe C., Tiziano F.D. // AIDS Res Ther. 2006. V. 25. P. 3-22.
53. Takacova M., Nogova P, Habekova M., Stanekova D. // AIDS. 2008. V. 11. № 15. P. 1833-1838.
54. Parczewski M., Leszczyszyn-Pynka M., Kaczmarczyk M., Adler G., Binczak-Kuleta A., Loniewska B., Boron-Kaczmar-ska A., Ciechanowicz A. // J. Appl. Genet. 2009. V. 50. № 2.
P 159-166.
55. Egger M., Smith G.D., Schneider M., Minder C. // Br. Med. J.
1997. V. 315. P. 629-634.
56. Viera A.J. // South Med. J. 2008. V. 101. № 7. P. 730-734.
57. Salkowitz J.R., Purvis S.F., Meyerson H., Zimmerman P., O'Brien T.R., Aledort L., Eyster M.E., Hilgartner M., Kessler C., Konkle B.A., et al. // Clin. Immunol. 2001. V. 98. № 2. P. 200-211.
58. Lederman M.M., Alter G., Daskalakis D.C., Rodriguez B.,
Sieg S.F., Hardy G., Cho M., Anthony D., Harding C., Weinberg A., et al. // J. Infect. Dis. 2010. V. 202. Suppl. 3. P. S333-S338.
59. Parczewski M., Bander D., Leszczyszyn-Pynka M., Urbanska A., Kaczmarczyk M., Ciechanowicz A., Boron-Kaczmarska A. // PLoS One. 2011. V. 6. № 7. P. e22215 (1-11).
60. He X.F., Jia Y.J., Su J., Chen Q., Zhu W.C., Yu S.Y. // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2011. V. 31. № 5. P 791-795.
61. Piacentini L., Biasin M., Fenizia C., Clerici M. // J. Intern. Med. 2009. V. 265. № 1. P 110-124.
