CC BY
25
- DOI: 10.17650/1818-8346-2022-17-2-30-35
СМ СМ
с-)]
СМ СМ
CS
Случай выявления мутации в гене CALR у пациента с диагнозом истинной полицитемии 1 и ^&?-негативным статусом
Е
Т.Н. Субботина1' 2, И.Е. Маслюкова1, д.В. курочкин1, М.А. Михалёв3, М.Г. Осадчая4, В.А. Хоржевский5, о Т.А. Гаркуша5, Е.А. Дунаева6, К.О. Миронов6
^ ФГАОУВО «Сибирский федеральный университет»; Россия, 660041 Красноярск, проспект Свободный, 79;
_ 2ФГБУ«Федеральньш Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»;
г.. Россия, 660037Красноярск, ул. Коломенская, 26;
^ 3КГБУЗ «Краевая клиническая больница»; Россия, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3А; о 4КГБУЗ «Красноярская межрайонная поликлиника № 1»; Россия, 660003 Красноярск, ул. Академика Павлова, 4, стр. 7;
5КГБУЗ «Красноярское краевое патолого-анатомическое бюро»; Россия, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3Д; см 6ФБУН«Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере
см см
защиты прав потребителей и благополучия человека; Россия, 111123 Москва, ул. Новогиреевская, ЗА
Контакты: Татьяна Николаевна Субботина stn.25@mail.ru
Мутации JAK2 могут быть связаны с любой фенотипической формой хронических миелопролиферативных неоплазий, тогда как мутации MPL и CALR возникают, как правило, в случаях эссенциальной тромбоцитемии и первичного мие-лофиброза и не наблюдаются при истинной полицитемии. Представлен клинический случай наличия соматической мутации CALR (c.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46) у пациента в возрасте 36 лет с JAK2-отрицательным статусом с диагнозом истинной полицитемии. В январе 2018 г. впервые зафиксированы изменения в гемограмме пациента, в июне 2018 г. на основании диагностического исследования трепанобиоптата костного мозга был поставлен диагноз истинной полицитемии. При молекулярно-генетическом исследовании ДНК пациента не выявлено мутаций в экзонах 12 и 14 гена JAK2 и в гене MPL. Мутация в гене CALR обнаружена при скрининге методом гетеродуплекс-ного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле, затем подтверждена и идентифицирована методом Сэнгера как с.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46. Уровень аллельной нагрузки, определенный методом пи-росеквенирования, в образце от июня 2018 г. составил 20 %. Можно предположить, что выявленная мутация CALR с.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46 имеет значение в развитии фенотипа полицитемии у данного пациента.
Ключевые слова: миелопролиферативная неоплазия, истинная полицитемия, соматическая мутация, JAK2-отри-цательный статус, CALR
Для цитирования: Субботина Т.Н., Маслюкова И.Е., Курочкин Д.В. и др. Случай выявления мутации в гене CALR у пациента с диагнозом истинной полицитемии и JAK2-негативным статусом. Онкогематология 2022;17(2):30-5. DOI: 10.17650/1818-8346-2022-17-2-30-35.
BY 4.0
a case of CALR mutation in JAK2-negative patient with polycythemia
T.N. Subbotina1,2, I.E. Maslyukova1, D. V. Kurochkin1, M.A. Mikhalev3, M.G. Osadchaya4, V.A. Khorzhevskiy5, T.A. Garkusha5, E.A. Dunaeva6, K.O. Mironov6
1Siberian Federal University; 79 Svobodnyy Prospekt, Krasnoyarsk 660041, Russia;
2Federal Siberian Research and Clinical Center of the Federal Medical and Biological Agency; 26 Kolomenskaya St., Krasnoyarsk 660037, Russia;
3Regional Clinical Hospital; 3A Partizana Zheleznyaka St., Krasnoyarsk 660022, Russia;
4Krasnoyarsk Interdistrict Polyclinic No. 1; Build. 7, 4 Akademika Pavlova St., Krasnoyarsk 660003, Russia;
5Krasnoyarsk State Regional Bureau of Pathology; 3D Partizana Zheleznyaka St., Krasnoyarsk 660022, Russia;
6Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance;
3A Novogireevskaya St., Moscow 111123, Russia
Contacts: Tatiana Nikolaevna Subbotina stn.25@mail.ru
JAK2 mutations can be associated with any phenotypic form of chronic myeloproliferative neoplasia, while MPL and CALR mutations occur, as a rule, in cases of essential thrombocythemia and primary myelofibrosis and they are not observed in polycythemia vera. In this article we describe a clinical case of CALR mutation (c.1154_1155insGTGTC;
p.E386fs*46) presence in a JAK2-negative polycythemia vera patient at age 36. In January 2018 changes in his hemogramm were recorded for the first time. In June 2018, based on a diagnostic study of bone marrow trepanobiopsy, a diagnosis of polycythemia vera was made. Molecular genetic study of the patient's DNA didn't reveal mutations in the JAK2 (12 and 14 exons) and the MPL genes. CALR mutation was revealed during the screening by heteroduplex analysis with the electrophoresis in polyacrylamide gel. Then the mutation was identified by Sanger's DNA sequencing as c.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46. The allelic burden level as determined by pyrosequencing was 20 % (June 2018). In conclusion we can suppose that the revealed CALR mutation c.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46 plays its role in our patient's polycythemia phenotype.
Key words: myeloproliferative neoplasm, polycythemia vera, somatic mutations, JAK2-negative status, CALR
For citation: Subbotina T.N., Maslyukova I.E., Kurochkin D.V. et al. A case of CALR mutation in JAK2-negative patient with polycythemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2022;17(2):30-5. (In Russ.). DOI: 10.17650/1818-8346-202217-2-30-35.
cv cv
cv cv
ев
Введение
В основе патогенеза большинства случаев Р^не-гативных миелопролиферативных новообразований (МПН) лежат соматические мутации в генах 1ЛХ2, MPL и CALR, которые наблюдаются приблизительно у 90 % больных [1, 2]. При этом мутации в гене 1АК2 могут быть ассоциированы с любой из фенотипических форм Р^негативных МПН, тогда как мутации в генах MPL и CALR обнаруживают, как правило, при эссенциаль-ной тромбоцитемии и миелофиброзе и не выявляют при истинной полицитемии (ИП) [3, 4]. Однако в литературе встречаются единичные сообщения о случаях выявления мутаций в гене CALR при отсутствии мутаций в гене 1АК2 на момент постановки диагноза у пациентов с ИП, а также с идиопатическим эритроцитозом [5, 6]. Вследствие этого обсуждается вопрос о проведении анализа мутаций CALR таким пациентам.
Ген CALR кодирует кальцийсвязывающий белок, который локализуется в эндоплазматическом рети-кулуме и выполняет различные функции, связанные с шаперонной активностью и гомеостазом кальция. Мутации в гене CALR сосредоточены в экзоне 9 и представляют собой разнообразные делеции и вставки, а также их комбинации, которые приводят к сдвигу рамки считывания. Сдвиг рамки считывания изменяет С-конец белка, который становится основным, в то время как в «диком» типе он кислый. На сегодняшний день идентифицировано и классифицировано более 50 различных мутаций в гене CALR, ассоциированных с Р^негативными МПН [7]. Все мутации делят на 2 типа: к 1-му относятся делеции, ко 2-му — вставки. Мутации 1-го типа чаще встречаются при миелофиброзе, тогда как при эссенциальной тром-боцитемии мутации 1-го и 2-го типов встречаются с одинаковой частотой [8]. Как было отмечено ранее, случаи наличия мутаций CALR при ИП в литературе имеются, но остаются неясными клиническое значение таких мутаций и их вклад в развитие патогенеза ИП.
Представляем клинический случай из собственной практики. У пациента с диагнозом ИП при JAK2-отри-цательном мутационном статусе была выявлена мутация в гене CALR, в частности с.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46.
Клинический случай
У больного, 36 лет, впервые были зафиксированы изменения в гемограмме в январе 2018г.: уровень гемоглобина 146 г/л, умеренный тромбоцитоз до 673 х 109/л, количество эритроцитов 5,18 х 1012/л; количество лейкоцитов в норме (5,3 х 109/л). Спленомегалия не выявлялась. В июне 2018 г. у пациента наблюдались умеренный плеторический синдром (головная боль, периодический кожный зуд), гематологический синдром (уровень гемоглобина до 171 г/л, количество эритроцитов до 5,75 х Ш2/л, уровень гематокрита до 49 %, количество лейкоцитов до 8,06 х 109/л), а также выявлен значительный тромбоцитоз (1722 х 109/л). Селезенка не пальпировалась. Уровень сывороточного эритропоэтина не определялся.
Больному была выполнена диагностическая тре-панобиопсия костного мозга подвздошной кости с гистохимическими окрасками образца гематоксилином и эозином, по А.А. Максимову в модификации Ю.А. Кри-волапова, импрегнацией солями серебра по Гордону— Свитсу (рис. 1). При микроскопическом исследовании клеточность костного мозга составила 80 %, что несколько выше возрастной нормы (60—70 %). Определялись все ростки кроветворения. Эритроидный росток расширен, умеренно гиперплазирован за счет промежуточных форм, нормобластического типа с формированием островков и тенденцией к диссоциации, распространению к костным балкам. Гранулоцитарный росток определялся на всех стадиях созревания, превалировали зрелые формы. Количество мегакариоцитов увеличено; наблюдались атипичные формы с широким спектром размеров — от крупных мегакариоцитов с гиперсегментированным ядром до средних и мелких с гипосегментированным ядром. Встречались единичные «безъядерные» формы, а также паратрабекулярно расположенные мегакарио-циты. Формирования рыхлых и плотных кластеров не прослеживалось. При импрегнации солями серебра определялись единичные аргирофильные волокна: MF-0. По результату патоморфологического исследования было высказано мнение, что с учетом клинико-лабораторных данных наблюдаемая картина соответствует миело-пролиферативной неоплазии — ИП, MF-0.
Таким образом, с учетом плеторического синдрома, трехросткового панцитоза и заключения патолога
CV CV
CV CV
cv cv
cv cv
ев
Рис. 1. Микроскопическая картина костного мозга подвздошной кости пациента: а — гиперплазия мегакариоцитарного ростка, широкий спектр атипичных мегакариоцитов (окраска азуром 2 и эозином по А.А. Максимову в модификации Ю.А. Криволапова, шкала 50 мкм); б — гиперплазия и расширение эритроидного ростка (окраска гематоксилином и эозином, шкала 50 мкм)
Fig. 1. Microscopic image of the patient's bone marrow: а — megakaryocyte lineage hyperplasia, a wide range of abnormal megakaryocytes (A.A. Maksimov's azur-2 and eosin staining in Yu.A. Krivolapov modification, 50 micrometers scale); б — erythroid lineage hyperplasia and extension (hematoxylin and eosin staining, 50 micrometers scale)
cv cv
cv cv
Рис. 2. Результаты анализа соматической мутации с.1154_1155insGTGTC в гене CALR: а — гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле; б — секвенирование по Сэнгеру
Fig. 2. Results of somatic CALR mutation d154_1155insGTGTC analysis: а — heteroduplex analysis with the following electrophoresis in polyacrylamide gel; б — Sanger's DNA sequencing
согласно клиническим рекомендациям 2016 г. установлен окончательный клинический диагноз — миелопролифера-тивная неоплазия: ИП, MF-0.
По результатам обследования пациенту с июня 2018 г. была назначена цитостатическая и дезагрегант-ная терапия (гидроксикарбамид и ацетилсалициловая кислота соответственно).
На момент последнего осмотра (сентябрь 2021 г.) пациент чувствовал себя удовлетворительно, вел привычный образ жизни, получал ранее назначенное лечение. В гемограмме уровень гемоглобина 158 г/л, тромбоцитоз до 670 х 109/л, количество эритроцитов 4,7 х 1012/л, количество лейкоцитов 6,4 х 109/л. Спленомегалия не выявлена (размер селезенки 11,7 х 5,4 см).
Молекулярно-генетическое исследование ДНК пациента включало анализ всех драйверных мутаций, ассоциированных с Р^негативными МПН согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения. Анализ мутаций в экзоне 14 гена 1ЛК2 и в гене MPL проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (SNP-скрин, Синтол, Россия). Поиск мутаций в экзоне 12 гена JAK2 выполняли методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле [9]. Искомых мутаций не выявлено. Мутация в гене CALR у обследуемого пациента изначально была обнаружена также при скрининговом исследовании методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (рис. 2). Несмотря
а
на то что на электрофореграмме отсутствовала четкая полоса, соответствующая мутантному аллелю, все же наличие гетеродуплексов дало основание предполагать присутствие мутации в исследуемой области. Далее мутация была подтверждена и идентифицирована методом Сэнгера как инсерция e.1154_1155insGTGTC;p.E386fs*46 (см. рис. 2).
Для определения уровня аллельной нагрузки выявленной мутации e.1154_1155insGTGTC использовали метод пиросеквенирования. Результаты количественного анализа 2 образцов ДНК пациента по сравнению с образцом ДНК «дикого» типа приведены на рис. 3. Уровень аллельной нагрузки в образце от июня 2018 г. составил 20 %, в образце от ноября 2018 г. — 28 %.
Обсуждение
Информация о выявленной нами мутации присутствует в базе COSMIC [10], она встречалась у пациентов как с эссенциальной тромбоцитемией, так и с миелофиброзом [11, 12], но в целом описаны лишь несколько Ph-негативных МПН у пациентов с такой мутацией. Важно отметить, что обнаруженная мутация с.1154_1155insGTGTC; p.E386fs*46 очень схожа с наи-
более часто встречающейся мутацией CALR 2-го типа сЛ154_1155^ГШГС; p.K385fs*47 с той лишь разницей, что вместо первого нуклеотида Г находится нук-леотид G. В целом это также приводит к синтезу более длинного белка CALR с измененным С-концевым участком, который становится основным. В отличие от белковой последовательности CALR при мутации с.1154_1155^ТГСГС у нашего и других пациентов с мутацией с.1154_1155insGГGГC изменение аминокислотной последовательности белка начинается не с лизина 385, а с аспарагина 386.
Интересно отметить, что описанные в работе J. Bro-seus и соавт. оба пациента с JAO-негативным статусом с диагнозом ИП имели наиболее распространенную в гене CALR мутацию 1-го типа (делецию 52 нуклеоти-дов) [5].
В литературе неоднократно сообщалось о случаях сочетания мутации JAK2V617F и какой-либо мутации в гене CALR у пациентов с Ph-негативными МПН [13, 14], в частности с ИП [15]. Таким образом, в представленном случае мы не можем исключить возможность развития у пациента биклонального заболевания, обусловленного дополнительной неизвестной мутацией,
CV CV
CV CV
ев
cv cv
сч сч
75
50
25
..........................ft"
.........75 %
GACAC25 %
ЕЮ^ЖШШ
E S T C G A C A C T G T C
5 10
300 250 200 150 100 50 0
......... 67 %
GACAC 33 %
_I_L_Zi_i_L
T 10
Рис. 3. Результаты анализа соматической мутации сА154_1155т$ОТОТС в гене CALR методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 c использованием software version 2.0.6: а — результат от июня 2018 г.; б — результат от ноября 2018 г. Каждый раз в постановке параллельно с исследуемым образцом проводилось секвенирование образца без мутации для определения фоновых значений, которые составили 5 %, что совпадает с данными литературы о чувствительности методики пиросеквенировования. Количественный расчет соотношения интактнъа и му-тантнъа молекул ДНК в образце из венозной крови (аллельная нагрузка) выполняли с помощью программного обеспечения прибора. Для определения истинного уровня аллельной нагрузки из полученного значения уровня аллельной нагрузки в исследуемом образце вычитали соответствующее значение, полученное при анализе образца без мутации (5 %)
Fig. 3. Results of CALR somatic mutation с. 1154_1155insGTGTC analysis by pyrosequencing method at PyroMark Q24 using software version 2.0.6: а — result of the DNA sample analysis as of June 2018; б — result of the DNA sample analysis as of November 2018. Each time when the patient's sample was sequenced, a blank sample with no mutation was sequenced to determine the PSQ methodology baseline values. The baseline values were 5 %, which is consistent with the literature data about the pyrosequencing method sensitivity. The quantitative ratio between intact and mutant DNA molecules (allele burden) was calculated by the device software. To identify the true mutant allele burden the following formula was used: the allele burden level = % of sample containing mutant burden measured — % of blank sample (5 %)
а
0
б
E
S
T
C
G
A
A
C
T
G
C
cv cv
сч сч
es
произошедшей до или параллельно с мутацией CALR. Однако мы можем предполагать, что при отсутствии мутаций в гене 1АК2 мутации в гене CALR могут быть связаны с фенотипом ИП.
Заключение
Представлен клинический случай наличия соматической мутации CALR (c.1154_1155insGTGTC; р.Е386&*46)
у пациента с /АК2-отрицательным статусом с диагнозом ИП. Мутация очень схожа с наиболее часто встречающейся мутацией CALR 2-го типа с.П54_П55твТГОТС; p.K385fs*47 и также приводит к изменению С-конце-вого участка белка, который становится основным. Нельзя исключать биклональное заболевание у пациента, но также можно предполагать связь мутации в гене CALR с фенотипом ИП.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
CV CV
CV CV
1. Tefferi A., Thiele J., Vannucchi A.M., Barbui T. An overview on CALR
and CSF3R mutations and a proposal for revision of WHO diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2014;28(7):1407-13. DOI: 10.1038/leu.2014.35.
2. Luo W., Yu Z. Calreticulin (CALR) mutation in myeloproliferative neoplasms (MPNs). Stem Cell Invest 2015;2:16. DOI: 10.3978/j.issn.2306-9759.2015.08.01.
3. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic mutations of calreticulin
in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379-90. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347.
4. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR mutations
in myeloproliferative neoplasms
with nonmutated JAK2. N Engl J Med
2013;369(25):2391-405.
DOI: 10.1056/NEJMoa1312542.
5. Broseus J., Park J.H., Carillo S. et al. Presence of calreticulin mutations in JAK2-negative polycythemia vera. Blood 2014;124(26):3964-6.
DOI: 10.1182/blood-2014-06-583161.
6. Chauveau A., Nibourel O., Tondeur S. et al. Absence of CALR mutations
in JAK2-negative polycythemia. Haematologica 2017;102(1):e15-6. DOI: 10.3324/haematol.2016.154799.
7. Spivak J.L. Myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2017;376(22):2168-81. DOI: 10.1056/NEJMra1406186.
8. Arber D.A, Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391-405.
DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544.
9. Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А. и др. Использование гетеродуп-лексного анализа и пиросеквенирова-ния в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба 2017;6(1):29-33. [Subbotina T.N., Kharsekina A.E., Dunaeva E.A. et al. Heteroduplex analysis and pyrosequencing in the diagnostic algorithm of polycy-themia vera associated with JAK2 exon
12 mutations. Laboratornaya sluzhba = Laboratory Service 2017;6(1):29-33. (In Russ.)].
DOI: 10.17116/labs20176129-33.
10. Catalog of somatic mutations in cancer. Available at: http://cancer.sanger.ac.uk/ cosmic/.
11. Li N., Yao Q.M., Gale R.P. et al.
Frequency and allele burden of CALR mutations in Chinese with essential thrombocythemia and primary
myelofibrosis without JAK2(V617F) or MPL mutations. Leuk Res 2015;39(5):510-4. DOI: 10.1016/j.leukres.2015.02.006.
12. Panovska-Stavridis I., Eftimov A., Ivanovski M. et al. Diversities
of calreticulin gene mutations
in macedonian patients
with essential thrombocythemia.
Clin Lymphoma Myeloma Leuk
2016;16(8):477-81.
DOI: 10.1016/j.clml.2016.04.019.
13. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vi JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472-7.
DOI: 10.1038/leu.2014.3.
14. Xu N., Ding L., Yin C. et al. A report on the co-occurrence of JAK2V617F and CALR mutations in myeloproliferative neoplasm patients. Ann Hematol 2015;94(5):865-7.
DOI: 10.1007/s00277-014-2248-0.
15. Thompson E.R., Nguyen T., Kankanige Y. et al. Clonal independence of JAK2
and CALR or MPL mutations in comutated myeloproliferative neoplasms demonstrated by single cell DNA sequencing. Haematologica 2021;106(1):313-5. DOI: 10.3324/haematol.2020.260448.
Вклад авторов
Т.Н. Субботина: разработка дизайна исследования, научное редактирование, утверждение статьи;
И.Е. Маслюкова, Д.В. Курочкин, М.А. Михалёв, М.Г. Осадчая, Т.А. Гаркуша, Е.А. Дунаева: получение данных, анализ полученных данных; В.А. Хоржевский, К.О. Миронов: научное редактирование, утверждение статьи. Authors' contributions
T.N. Subbotina: research design development, article editing, article approval;
I.E. Maslyukova, D.V. Kurochkin, M.A. Mikhalev, M.G. Osadchaya, T.A. Garkusha, E.A. Dunaeva: obtaining data, analysis of the obtained data; V.A. Khorzhevskiy, K.O. Mironov: article editing, article approval.
ORcID авторов / ORcID of authors
Т.Н. Субботина / T.N. Subbotina: https://orcid.org/0000-0001-7790-5033 И.Е. Маслюкова / I.E. Maslyukova: https://orcid.org/0000-0003-1323-2612 Д.В. Курочкин / D.V. Kurochkin: https://orcid.org/0000-0003-1063-7702 М.А. Михалёв / M.A. Mikhalev: https://orcid.org/0000-0003-3769-3405 М.Г. Осадчая / M.G. Osadchaya: https://orcid.org/0000-0002-4942-4299 В.А. Хоржевский / V.A. Khorzhevskiy: https://orcid.org/0000-0002-9196-7246 Т.А. Гаркуша / T.A. Garkusha: https://orcid.org:/0000-0002-3343-6973 Е.А. Дунаева / E.A. Dunaeva: https://orcid.org/0000-0002-4477-8506 К.О. Миронов / K.O. Mironov: https://orcid.org/0000-0001-8207-9215
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. £
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. _j
о
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки. ^
Financing. The work was performed without external funding. CV
a cv
Соблюдение прав пациентов. Пациент подписал информированное согласие на публикацию своих данных. ^
Compliance with patient rights. The patient gave written informed consent to the publication of his data.
cs
cv cv
cv cv
Статья поступила: 10.12.2021. Принята к публикации: 24.02.2022. Article submitted: 10.12.2021. Accepted for publication: 24.02.2022.
