Определение мутации в гене кальретикулина у пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 >ДК 616.155-006.04:577.21.8

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ КАЛЬРЕТИКУЛИНА У ПАЦИЕНТОВ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ХРОНИЧЕСКИЕ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ НЕОПЛАЗИИ

Ольховский И.А.1'2, Горбенко А.СЛ2, Столяр М.А.1,2,3, Субботина Т.Н.1'3, Васильев Е.В.4, Виноградова Е.Ю.4, Мартынова Е.В.4, Москов В.И.4, Азаренко Г.Н.4, Смелянская М.Г.4, ОльховикТ.И.5, Осадчая М.Г.5, Кисличенко О.Р.5, Михалев М.А.5, Фандо Ж.Г.5, Бахтина В.ИЛ4'6, Кузнецова Е.Ю.5(5, Рыкун Л.А.7, Шалькова И.В.8

красноярский филиал ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 660036, Красноярск, Россия; 2ФГБУН Красноярский научный центр СО РАН, 660036, Красноярск, Россия; 3ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, 660041, Красноярск, Россия; 4КГБУЗ Краевая клиническая больница, 660022, Красноярск, Россия; 5МБУЗ Городская клиническая больница № 7,660003, Красноярск, Россия;6ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, 660022, Красноярск, Россия; 7НМУ Дорожная больница на ст. КрасноярскОАО РЖД, 660058, Красноярск, Россия; 8ФГУЗ Клиническая больница №51 ФМБА РФ, 662970, Железногорск, Россия

Резюме. Проведен анализ результатов молекулярно-генетического исследования периферической крови 363 пациентов с подозрением на хроническое миелопролиферативное заболевание. Наличие мутаций в гене кальретикулина (CALR) определяли оригинальным методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией. Мутации в гене CALR выявлены у 30 из 58 пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) и миелофиброзом (МФ) и отсутствием мутаций в генах JAK2 (V617F) и MPL. Только у 1 пациента с ЭТ имелось одновременное сочетание двух разных мутаций в генах JAK2 (V617F) и CALR (del). Не выявлено мутаций в гене CALR среди пациентов с верифицированной истинной полицитемией, другими онкогематологическими заболеваниями, а также при вторичных тромбоэритроцитозах. Мутации CALR были примерно одинаково представлены как у мужчин, так и у женщин, с тенденцией к преобладанию у относительно молодых пациентов. Улиц с мутациями в гене CALR при ЭТ регистрировались меньшее количество эритроцитов и тенденция к более выраженному тромбоцитозу. Использование в диагностическом алгоритме дополнительного молекулярно-генетического тестирования на наличие мутаций в гене CALR в 2 раза увеличивает послетестовую вероятность выявления клонального характера заболевания, позволяет добиться 80% чувствительности тестирования при диагностике ЭТиМФ и исключить наличие истинной полицитемии. Тест выявления мутаций CALR может быть рекомендован для включения в стандартный протокол дифференциальной диагностики хронических миелопролиферативных неоплазий.

Ключевые слова: кальретикулин; соматические мутации; эссенциальная тромбоцитемия; мие-лофиброз; истинная полицитемия.

IDENTIFICATION OF MUTATION IN CALRETICULIN GENE IN PATIENTS WITH SUSPICION ON CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISEASES

Olkhovskyl.A.12, GorbenkoA.S.12, StolyarM.A.' 23, Subbotina T.N.' 3, VasilyevE.V.4, Vinogradova E.Yu.4, Martynova E.V.4, Moskov V.I.4, Azarenko G.N.4, Smelyanskaya M.G.4, Olkhovik T.I.5, OsadchayaM.G.S, Kislichenko O.R.s, MikhalyovM.A.5, Fando Zh.G.5, Bakhtina Vl''46, Kuznetsova E.Yu.5'6, Rykun L.A.7, Shalkova I.V."

'Krasnoyarsk Affiliated Department, Hematological Research Center, 660036, Krasnoyarsk, Russia; Krasnoyarsk Research Center, 660036, Krasnoyarsk, Russia; Siberian Federal University, 660041, Krasnoyarsk, Russia; territorial Clinical Hospital, 660022, Krasnoyarsk, Russia;5Municipal Clinical Hospital No 7,660003, Krasnoyarsk, Russia; 6V.F.Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, 660022, Krasnoyarsk, Russia;7Railroad Hospital, 660058, Krasnoyarsk, Russia;8Clinical Hospital No 51,662970, Zheleznogorsk, Russia

S u m m a ry. Molecular genetic analysis of the peripheral blood was carried out in 363 patients with suspicion on chronic myeloproliferative disease. Mutations in calreticulin (CALR) gene were detected by the original PCR method with electrophoretic detection. Mutations in the CALR gene were detected in 30 of 58 patients with essential thrombocythemia (FT) and myelofibrosis (MF) and without mutations in JAK2 (V617F) and MPL genes. Only one patient with FT had a combination of two different mutations in genes JAK2 (V617F) and CALR (del). No mutations in CALR gene were detected in patients with verified polycythemia vera, other oncohematological diseases, and with secondary thromboerythrocytosis. The CALR mutations were approximately equally incident in men and women, with a trend to predominance in younger patients. Patients with CALR mutations and EThad lower counts of erythrocytes and exhibited a trend to pronounced thrombocytosis. Use of additional molecular genetic testing for CALR mutations within frames of the diagnostic algorithm increased 2-fold the after-test probability of detection of the clonal pattern of the disease, helped to attain 80% sensitivity of testing in the diagnosis of FT and MFand to rule out polycythemia vera. Detection of CALR mutations could be recommended for adding to the standard protocol for the differential diagnosis of chronic myeloproliferative diseases.

Key words: calreticulin; somatic mutations; essential thrombocythemia; myelofibrosis;polycythemia vera.

Кальретикулин (Са1 retici.il ¡п, САЬЯ) является многофункциональным кальций-связывающим белком эндоплазматического ретикулума. Кроме регуляции внутриклеточной концентрации кальция, этот

белок принимает участие в формировании третичной структуры белков, обладая функциями шаперо-на. При его участии происходит образование полноценного антигенпрезентирующего макромолекуляр-

но го комплекса МНС1 [1]. Повышенная экспрессия CALR сопряжена с успешной иммунной цитотокси-ческой реакцией против опухолевых клеток и определяет благоприятный исход химиотерапии [1,2].

В декабре 2013 г. двумя научными группами [3, 4] независимо было продемонстрировано, что мутации в гене CALR обнаруживаются более чем в половине случаев среди пациентов с эссенциальной тромбо-цитемией (ЭТ) и первичным миелофиброзом (МФ), не имевших ранее описанных мутаций в генах JAK2 и MPL. До сих пор не обнаружено присутствие исследованной мутации гена CALR при лимфопроли-феративных заболеваниях или в солидных опухолях [4]. По данным литературы [5, 6], мутации CALR при ЭТ чаще встречаются у мужчин и у пациентов более молодого возраста. Наличие мутации CALR сочеталось с меньшим лейкоцитозом, более высоким уровнем тромбоцитов и пониженной концентрацией гемоглобина [4-6]. Среди больных первичным МФ носители мутации в гене CALR также отличались более молодым возрастом, более высоким лейкоцитозом и тромбоцитозом и меньшей вероятностью развития анемического синдрома. Наличие мутации CALR ассоциировано с более длительным периодом отсутствия тромбозов при ЭТ и более благоприятными показателями жизни больных первичным МФ [4-6]. Детальный анализ выявил, что благоприятный прогноз при первичном МФ, в основном, связан с мутацией CALR «1-го типа» - делецией 52-Ьр deletion (p.L367fs*46). Мутация CALR «2-го типа» -инсерция 5-bp TTGTC (p.K385fs*47) по влиянию на выживаемость больных ПМФ, как оказалось, существенно не отличается от влияния мутации JAK2 [7]. Авторы [8] предлагают включить тест определения мутаций CALR в международные рекомендации [9] диагностики миелоидных неоплазий ВОЗ.

Цель работы - провести оценку диагностической значимости молекулярно-генетического определения мутаций в гене CALR у пациентов с подозрением на хронические миелоидные неоплазии.

Материалы и методы

В настоящее исследование включены данные обследования 361 пациента с подозрением на хроническое миелопролиферативное заболевание, поступивших в период с 01.09.2012 по 25.05.2014 на консультативный прием врача-гематолога в амбулаторно-поликлинические учреждения Красноярска и в Красноярскую краевую клиническую больницу. Основанием для обследования служили клинические проявления эритроцитоза и тром-

Для корреспонденции:

Ольховский Игорь Алексеевич, кандидат мед. наук, доцент, директор Красноярского филиала ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, старший научный сотрудник ФГБУН Красноярский научный центр Сибирского отделения РАН. Адрес: 660036, Красноярск, Академгородок, 15а. E-mail: krashemcenter@mail.ru

Corresponding author:

Olkhovskiy Igor, MD, PhD, docent (krashemcenter@mail.ru).

боцитоза, высокие значения гемоглобина и гематокрита, а также подозрение на первичный МФ. Окончательный диагноз устанавливали на основании критериев ВОЗ [9]. Гистологическое исследование костного мозга проводили специалисты лаборатории КГУЗ Красноярское краевое патологоанатомическое бюро. Среди всех обследованных пациентов у 15 человек было подтверждено онкогематологическое заболевание, отличное от рассматриваемых нозологических единиц, в том числе у 5 человек - хронический миелолейкоз, у 2 - миелодиспластический синдром, у 3 - хронический лимфолейкоз, у 1 - неходжкин-ская лимфома, у 4 - острые лейкозы. Все эти больные, а также 13 человек, у которых на момент обработки данных оставался диагноз хронического миелопролиферативного заболевания неясной этиологии, были объединены в отдельную группу сравнения. Вторичный характер тромбо-цитоза и эритроцитоза был диагностирован у 17 и 121 человека соответственно. Группу пациентов с МФ ввиду их небольшой численности составили больные как первичным МФ, так и МФ, развившимся в результате прогрессии истинной полицитемии (ИП) и ЭТ.

Пробы крови для молекулярно-генетических исследований брали из локтевой вены утром натощак в ваку-тейнер с ЭДТА. Анализ параметров гемограммы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе XT-2000i ("Sysmex Corporation"). Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с использованием реагентов ДНК-сорб-В (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора dsDNA HS Assay Kit на флюориме-тре Qubit ("Invitrogen"). Для количественного выявления мутации V617F в гене JAK2 (rs77375493) использовали набор реагентов АмплиСенс® Пироскрин, Тромбо-скрин (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии», Москва), пиросеквенирование проводили на приборе PyroMark Q24 ("Qiagen"). Качественный анализ на наличие мутаций W515L/K в генеMPZ (rsl21913615 nrsl21913616 соответственно) проводили с использованием набора SNP-Скрин (НПО «Синтол») методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Наличие мутаций с. 1154_1155insTTGTC (p.K385fs*47) и с. 1092 1143del (p.L367fs*46) в гене CALR определяли электрофоретическим методом на агарозном геле. Для определения мутации c.ll54_1155insTTGTC (p.K385fs*47) после ПЦР продукты амплификации обрабатывали рестриктазой MFel (ООО «СибЭнзим», Новосибирск) в течение 1 ч при температуре 37°С в буфере, рекомендуемом фирмой-производителем («СибЭнзим»), Подбор праймеров был произведен с помощью программного продукта «Primer 3». Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 20 нг ДНК, ПЦР-буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы («Синтол», Москва), 0,25 мМ dNTP, 0,25 мМ MgCl2, 200 мМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы. Продукты амплификации после рестрикции для определения мутации с.11541155insTTGTC (p.K385fs*47) разделяли в 4% агарозном геле в трис-боратном буфере. Гели документировали после окрашивания этидиум бромидом. В качестве маркера молекулярной массы использовали O'GeneRuler® 25-700 пар нуклеотидов ("Thermo Scientific").

Для статистической обработки полученных данных использовали пакет прикладных программ Statistica 8.0.

Таблица 1

Результаты генетического обследования пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии

Диагноз ИП ЭТ МФ Прочие онкогемато- Вторичный эритро-

логические заболевания тромбоцитоз

Количество пациентов, всего

60 104 32 28 138

С мутацией:

JAK2 (V617F) 55(91,7%) 58 (55,8%)* 21(67,7%) 0 0

МРИ W515L) 0 5(4;8%) 0 0 0

CALR(Ae\) 0 17(16,3%)* 3(9,7%) 0 0

CALR (ins) 0 7 (6,7%) 3 (9,7%) 0 0

Мутации не обнаружено:_5(8,3%) 18(17,3%) 5(16,1%)_28(100%)_138(100%)_

Примечание. Представлены абсолютные значения и доля (в %) от общего числа пациентов в группе. * - у одного из пациентов сочетание двух мутаций в генах CALR и JAK2.

Значимость отличий вариационных радов в несвязанных выборках оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, описательная статистика представлена в виде значений медианы (Ме) и верхнего и нижнего квартилей (С25- С75). Различия оценивали как статистически значимые прир < 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты молекулярно-генетического тестирования пациентов с различными вариантами ХМН на предмет наличия соматических мутаций, а также их распределение по возрасту и полу представлены в табл. 1 и 2. Выявлено, что наиболее часто из анализируемых нами соматических мутаций среди всех обследованных пациентов (в 37% случаев) обнаруживалась мутация V617F в гене JAK2, которая характерна как для пациентов с ЭТ и первичным МФ, так и для пациентов с ИП. Мутацию в гене MPL имели только 5 человек из всей выборки, что составило 4,8%. При этом все 5 пациентов с ЭТ имели один из вариантов данной мутации W515L.

Таблица 2

Характеристика пациентов с эссенциальным тромбоцитозом и миелофиброзом в зависимости от наличия соматических мутаций в генах JAK2 и CALR

Показатель JAK2 (V617F) CALR (del) CALR (ins) Без мутаций*

Количество 79 20 10 26

пациентов

Доля муж- 34 45 60 31

чин, %

Возраст, 64 (51-71) 59 56,5 60

годы (52-67,5) (41-67) (47-65)

Ме(С2-С75)

Доля лиц 47 40 30 31

старше 65 лет, %

Примечание. * - отсутствие исследуемых мутаций в генах JAK2, CALR и MPL.

В нашем случае, доля пациентов с мутацией JAK2V617F составляла 92%, 56% и 68% среди лиц с диагнозом ИП, ЭТ и МФ соответственно. Следует отметить, что мы не проводили тестирование пациентов на наличие мутаций в 12-м экзоне гена JAK2, которые могут дополнительно определять до 10% случаев ИП [9]. Вместе с тем, ни один из пациентов с верифицированной ИП не имел мутаций в гене CALR. Полученные данные соответствует данным литературы о встречаемости данной мутации у пациентов при хроническим миелопролиферативных заболеванях [3-9].

Только 1 пациент с ЭТ имел сочетание двух разных мутаций JAK2 (V617F) и CALR (del), что описывается как чрезвычайно редкое явление [6]. У пациентов с ЭТ и МФ без мутаций в генах JAK2 (V617F) и MPL, мутация в гене CALR выявлялась в 82% и в 50% случаев соответственно. Таким образом, дополнительное к тесту на JAK2 исследование периферической крови пациентов на соматические мутации в гене CALR более чем в в 2 раза увеличивает послетестовую вероятность выявления клонального характера заболевания при ЭТ и МФ. Использование алгоритмов молекулярно-генетиче-ского обследования на три наиболее часто встречающиеся мутации - JAK2, MPL и CALR - позволяет добиться 80% чувствительности тестирования при диагностике ЭТ и МФ.

Специфичность теста выявления мутаций в гене CALR в нашей выборке была близка к 100%, поскольку ни в одном из 138 случаев вторичного тром-боцитоза и эритроцитоза, а также при других онкоге-матологических заболеваний (28 больных) мутации CALR не выявлялись.

Мутации в гене CALR были примерно одинаково представлены как у мужчин, так и у женщин, с тен-

Таблица 3

Результаты гематологического исследования пациентов с эссенциальным тромбоцитозом в зависимости от наличия мутаций

в генах JA 1(2 и CA LR, Ме (С2 - С?5)

Показатель CALR (del) CALR (ins) JAK2 (V617F) Без мутаций Р

Количество пациентов 17 7 58 18

Эритроциты, 1012/л:

мужчины 4,7 (4,5^1,8)' 4,8 (4,2-5,3)' 5,4 (5,1-5,б)2'3 4,9(4,1-5,7) р1 <0,01 Р2<0,01 р4<0,01 р1 = 0,03

женщины 4,1 (4-4,2)1 3,9 (3,7-4,1 У 4,9 (4,5-5,5)2,3 4,6 (4,5^1,8)2'3 р2<0,01 р4<0,01 Р5 = 0,01

Тромбоциты, ■ 109/л 785(595-956) 978(801,5-1327) 704,5 (624-898,3) 573 (422-712,5)' ООО о" о" о" V V V =С

Примечание. Статистически значимые различия между группами больных: pl - CALR (del) и без мутаций; р2 - CALR (del) и JAK2 (V617F); ръ - CALR (ins) и без мутаций; p.-JAK2(V617F) и без мутаций; р, - CALR (ins) и JAK2(V617F).

денцией к преобладанию у относительно молодых пациентов (см. табл. 2). Случаи ЭТ и МФ с мутацией JAK2 (V617F), превалировали у женщин.

Данные гематологического исследования продемонстрировали относительно меньшее количество эритроцитов и тенденцию к более выраженному тромбоцитозу у лиц с мутациями в гене CALR (табл. 3). У пациентов без выявленных мутаций наблюдались минимальные значения тромбоцитоза.

В группе пациентов с МФ ввиду малой выборки и гетерогенности пациентов статистически значимого отличия гематологических показателей у носителей мутаций в гене CALR мы не обнаружили. Что касается недавно описанных [6] особенностей влияния отдельных мутаций в гене CALR на патогенез и клинические проявления хронических миелопролифе-ративных неоплазий, то этот вопрос требует дополнительного изучения.

Таким образом, использование в диагностическом алгоритме дополнительного молекулярно-генети-ческого тестирования на выявление мутаций в гене кальретикулина позволяет подтвердить клональный характер заболевания и при этом исключить наличие ИП. Тест выявления мутаций CALR может быть рекомендован для включения в стандартный протокол дифференциальной диагностики хронических мие-лопролиферативных неоплазий.

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]

1. Howe С., Garstka М., Al-Balushi М.А., Ghanem Е., Antoni-ou A.N., Fritzsche S., et al. Calreticulin-dependent recycling in the early secretory pathway mediates optimal peptide loading of MHC class I molecules. EMBO J. 2009; 28(23): 3730^14. doi: 10.1038/emboj .2009.296.

2. Hodge J.W., Garnett C.T., Farsaci В., Palena C., Tsang K., Fer-rone S., et al. Chemotherapy-induced immunogenic modulation of tumor cells enhances killing by cytotoxic T lymphocytes and is distinct from immunogenic cell death. International J. Cancer. 2013; 133(3): 624-36.

3. Klampfl T., Gisslinger H, Harutyunyan A.S., Nivarthi H, Rumi E., Milosevic J.D., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2379-90.

4. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J., Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2391^105.

5. Andrikovics H., Krailling T., Balassa К., Halm G., Bors A., Ko-szarska M., et al. Distinct clinical characteristics of myeloproliferative neoplasms with calreticulin mutations. Haematologica. 2014 Jul; 99(7): 1184-90.

6. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M., Knudson R.A., Ketterling R., Hanson C.H. CALR vs JAK2 vs MPL - mutated or triple-nega-tive myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia. 2014. http://www.nature.com/leu/journal/vaop/ ncurrent/full/leu20143a. html

7. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C., Belachew A.A., Wassie E.A., Ketterling R.P, et al. Type 1 vs type 2 calreticulin mutations in primary myelofibrosis: differences in phenotype and prognostic impact. Leukemia. 2014. http://www.nature.com/leu/journal/ vaop/ncurrent/full/leu201483a. html

8. Tefferi A., Pardanani A. Nat. Rev. CALR mutations and a new diagnostic algorithm forMPN. Clin. Oncol. 2014; 11(3): 125-6.

9. Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A., Brunning R.D., Borow-itz M.J., Porwit A., et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood. 2009; 114(5): 937-51.

Поступила 05.06.14 Received 05.06.14