СЛУЧАЙ СПОНТАННОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА В КУЛЬТУРЕ ПЕРВИЧНЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОЙ ВЕНЫ ЧЕЛОВЕКА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

^^К^мплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний

97

УДК 57.085.23

DOI 10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114

СЛУЧАЙ СПОНТАННОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО

ПЕРЕХОДА В КУЛЬТУРЕ ПЕРВИЧНЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

ПУПОЧНОЙ ВЕНЫ ЧЕЛОВЕКА

Д.К. Шишкова, А.В. Синицкая, М.Ю. Синицкий, В.Г. Матвеева, Е.А. Великанова,

В.Е. Маркова, А.Г. Кутихин

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Сосновый бульвар, 6, Кемерово, Российская Федерация, 650002

Основные положения

• Спонтанный эндотелиально-мезенхимальный переход первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека характеризуется многократным повышением уровня экспрессии генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, полной потерей экспрессии маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG), ярко выраженной экспрессией генов маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-специфичного белка и альфа-актина гладких мышц) и выраженным синтезом основного компонента внеклеточного матрикса коллагена I типа. Оптимальным алгоритмом определения эндотелиально-мезенхимального перехода является определение транскрипции генов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, генов мезенхимальной дифференцировки (F4P S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) с последующей верификацией отрицательной экспрессии маркеров эндотелиального фенотипа и положительной экспрессии коллагена I типа внутри клеток посредством иммуно-флюоресцентного окрашивания.

На основании случая спонтанного эндотелиально-мезенхимального переЦель хода разработать алгоритм и предложить инструменты для его детекции in vitro.

В эксперимент включены две серии первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC): первая серия - классический эндоте-лиальный морфотип, вторая - спонтанно подвергшиеся эндотелиально-ме-зенхимальному переходу. В качестве отрицательного контроля (клетки с эндотелиальным морфотипом) также использованы первичные эндотели-альные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и первичные эндоте-лиальные клетки внутренней грудной артерии человека (HITAEC). Оценку молекулярного профиля клеток проводили методами количественной поли-меразной цепной реакции после обратной транскрипции, иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного окрашивания с последующей конфокальной микроскопией.

В отличие от HUVEC с физиологическим профилем молекулярной экспрессии, а также артериальных эндотелиальных клеток HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались потерей экспрессии генов маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), многократно повышенной экспрессией генов двух транскрипционных факторов перехода (SNAI2, TWIST1), приобретением экспрессии генов маркеров клеток мезенхимально-го ряда (F4P S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) при сохраненной экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1, NRP1). Отсутствие экспрессии генов специфичных сократительных маркеров (тяжелой цепи миозина гладких мышц (MYH11) и смузелина (SMTN)) в сочетании с приобретенной экспрессией гена менее специфичного сократительного маркера альфа-актина гладких мышц (ACTA2) свидетельствовало о фенотипической схожести

Материалы и методы

Для корреспонденции: Виктория Евгеньевна Маркова, marvika97@gmail.com; адрес: Сосновый бульвар, 6, Кемерово, Россия, 650002

Corresponding author: Victoria E. Markova, marvika97@gmail.com; address: 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, Russia, 650002

трансформированных клеток с миофибробластами, а не c сосудистыми гладкомышечными клетками сократительного фенотипа. Анализ белковой экспрессии методом иммуноблоттинга подтвердил потерю экспрессии эн-дотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерин/CDH5, ERG) и продемонстрировал сохранность экспрессии вышеуказанных общесосудистых маркеров. Отсутствие иммунофлюоресцентного свечения эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM-1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG) в сочетании с интенсивным внутриклеточным свечением основного синтезируемого белка межклеточного матрикса - коллагена I типа - также подтвердило реализацию транскрипционной программы эндотелиально-ме-зенхимального перехода.

Алгоритм оценки эндотелиально-мезенхимального перехода подразумевает измерение экспрессии генов PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1,

Заключение FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1 и COL1A2, комбинированное с иммунофлюо-

ресцентным окрашиванием на CD31/PECAM-1, VE-кадгерин и транскрипционный фактор ERG в сочетании с окрашиванием на коллаген I типа.

Эндотелиально-мезенхимальный переход • Эндотелиальная дифференцировка

Ключевые слова • Мезенхимальная дифференцировка • HUVEC • Сосудистые гладкомышечные клетки • Миофибробласты

Поступила в редакцию: 05.07.2022; поступила после доработки: 31.07.2022; принята к печати: 14.08.2022

SPONTANEOUS ENDOTHELIAL-TO-MESENCHYMAL TRANSITION IN HUMAN

PRIMARY UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS

D.K. Shishkova, A.V. Sinitskaya, M.Yu. Sinitsky, V.G. Matveeva, E.A. Velikanova,

V.E. Markova, A.G. Kutikhin

Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases ", 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, Russian Federation, 650002

Highlights

• Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is characterized by an acquired expression of SNAI2 and TWIST1 genes, loss of endothelial markers and transcription factors (CD31/PECAM1, VE-cadherin, and ERG transcription factor), pronounced expression of S100A4 and ACTA2 genes, and active production of type I collagen, a major component of the extracellular matrix.

An optimal algorithm to detect endothelial-to-mesenchymal transition includes gene expression profiling of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), SNAI2 and TWIST1 transcription factors, mesenchymal specification markers (F4P S100A4, ACTA2) and markers of extracellular matrix synthesis (COL1A1, COL1A2) along with the subsequent negative staining for CD31/PECAM1, VE-cadherin, or ERG and positive staining for intracellular type I collagen.

Aim To develop an algorithm and tools to determine endothelial-to-mesenchymal transition (EndoMT) in vitro.

Methods We examined two batches of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) where the first cell batch had a conventional endothelial morphology and the second cell batch underwent a spontaneous EndoMT. Human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and human internal thoracic artery endothelial cells (HITAEC) were used as the negative control for EndoMT. Molecular profile was assessed by means of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, Western blotting, and immunofluorescence staining with the further confocal microscopy.

Results In contrast to HUVEC with the physiological profile and arterial ECs, HUVEC undergoing EndoMT lost the expression of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG) and acquired the expression of EndoMT transcription factors (SNAI2, TWIST1), mesenchymal markers (F4P S100A4, ACTA2), and extracellular matrix components (COL1A1, COL1A2) while retaining expression of the common

vascular markers (HES1, NRP1). Western blotting analysis confirmed the loss of endothelial markers (CD31/PECAM1, VE-cadherin/CDH5, ERG) and demonstrated retained expression of abovementioned vascular markers. Negligible expression of MYH11 and SMTN genes encoding specific contractile markers (smooth muscle myosin heavy chain and smoothelin) in combination with the acquired expression of ACTA2 gene encoding less specific contractile marker alpha smooth muscle actin indicated the phenotypic identity of EndoMT-transformed HUVEC to myofibroblasts but not contractile vascular smooth muscle cells. Loss of immunofluorescence staining of endothelial markers (CD31/PECAM-1, VE-cadherin, and ERG transcription factor) and pronounced intracellular staining of type I collagen testified to the ongoing EndoMT.

Conclusion An algorithm to assess EndoMT implies measurement of the expression of PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST 1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1, and COL1A2 genes in combination with the respective immunofluorescence staining for CD31/PECAM-1, VE-cadherin, or ERG transcription factor and type I collagen.

Keywords Endothelial-to-mesenchymal transition • Endothelial differentiation • Mesenchymal differentiation • HUVEC • Vascular smooth muscle cells • Myofibroblasts

Received: 05.07.2022; received in revised form: 31.07.2022; accepted: 14.08.2022

Список сокращений

ОТ-кПЦР - количественная полимеразная цепная реакция ЭК - эндотелиальные клетки после обратной транскрипции

Введение

Эндотелиально-мезенхимальный переход

(endothelial-to-mesenchymal transition, endothelialmesenchymal transition), являясь одним из наиболее изучаемых феноменов эндотелиальной биологии, с одной стороны, играет незаменимую физиологическую роль в биологии индивидуального развития, с другой - обладает несомненной патофизиологической значимостью в развитии атеросклероза, рестеноза и фиброза миокарда [1-5]. Сущность данного процесса заключается в поэтапной транс-дифференцировке эндотелиальных клеток (ЭК) в мезенхимальные, что сопровождается постепенной утратой экспрессии маркеров эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, фактора фон Виллебранда (VWF), транскрипционного фактора ERG) и приобретением экспрессии маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-ассоциированного белка, фиброб-ласт-специфичного белка, альфа-актина гладких мышц), а также повышенной способностью к синтезу компонентов внеклеточного матрикса (в частности, коллагена I типа) [1-5]. Данная смена транскрипционных программ осуществляется под управлением ряда специфических транскрипционных факторов, к которым традиционно относят Snail, Slug, TWIST1, ZEB1 и GATA4 [1-5].

С целью детекции эндотелиально-мезенхималь-ного перехода используют ряд методов молекулярной и клеточной биологии, включая количественную полимеразную цепную реакцию после обратной транскрипции (ОТ-кПЦР), иммуноблоттинг и

иммунофлюоресцентное окрашивание, которые в совокупности позволяют оценить реализацию эндотелиальной и мезенхимальной транскрипционных и трансляционной программ, а также визуализировать данные изменения [1-6]. Патоморфологическим последствием перехода служит смена продолговатой (вытянутой, удлиненной) формы, характерной для ЭК в статических условиях и при воздействии ламинарного потока, на типичную для клеток мезенхи-мального ряда полиморфную [1-6]. In vitro изменение клеточной геометрии целесообразно детектировать при помощи фазово-контрастной микроскопии или иммунофлюоресцентного окрашивания (к примеру, сочетая окрашивание вышеуказанных эндо-телиальных или мезенхимальных маркеров с окрашиванием на F-актин) [7, 8], in vivo - посредством сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах после заливки цельных тканей в эпоксидную смолу (EM-BSEM) [9].

Несмотря на сотни публикаций, посвященных проблеме эндотелиально-мезенхимального перехода, в русскоязычной литературе практически отсутствуют рекомендации по методологии его детекции, следствием чего является несовершенный дизайн исследований в этом направлении в ряде открытых (научные статьи и доклады) и закрытых (про-ектно-сметная и отчетная документация научных коллективов) источников. Частично данная методология описана в одном из последних критических обзоров по проблеме эндотелиальной биологии [6], однако обзорная статья не позволяет описать все экспериментальные детали и их нюансы.

Цель данной работы - разработка алгоритма и анализ применимости конкретных инструментов для детекции эндотелиально-мезенхимального перехода in vitro на примере случая из лабораторной практики (спонтанного перехода первичных ЭК пупочной вены человека).

Материалы и методы

Для экспериментов использовали коммерческие культуры первичных ЭК пупочной вены человека (HUVEC, 200K-05f, Cell Applications, США). В качестве положительного контроля эндотелиальной дифференцировки использовали культуры первичных ЭК коронарной артерии человека (HCAEC, 300K-05a; Cell Applications) и первичных ЭК внутренней грудной артерии человека (HITAEC, 308K-05a; Cell Applications). Эксперименты на различных линиях ЭК проводили строго параллельно для повышения воспроизводимости и достоверности результатов. Согласно информации поставщика, все указанные линии первичных ЭК подвергнуты криоконсервации на втором пассаже (500,000 клеток в базальной среде Endothelial Cell Basal Medium (210-500, Cell Applications) или MesoEndo Cell Basal Medium (212K-500, Cell Applications), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 10% диме-тилсульфоксида. Для проведения экспериментов ЭК размораживали и культивировали во флаконах Т-75 (90076, Techno Plastic Products, Швейцария) согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток Human MesoEndo Growth Medium (212-500, Cell Applications). Визуальный анализ морфологических свойств и функционального состояния клеточных культур проводили при помощи фазово-контрастной микроскопии. Пересев производили по достижении 80% конфлюэнтности, после двух пассажей ожидали заполнения культу-рального пластика ЭК до конфлюэнтности, отмывали клетки в ледяном фосфатно-солевом буфере (pH 7,4, 10010023, Thermo Fisher Scientific, США)

и лизировали тризолом (15596018, Thermo Fisher Scientific) для выделения РНК либо RIPA-буфером (89901, Thermo Fisher Scientific) с коктейлем ингибиторов протеаз и фосфатаз (78444, Thermo Fisher Scientific) для выделения белка в соответствии с инструкциями производителя. Для флюоресцентного окрашивания ЭК дополнительно рассевали в 8-луночные культуральные камеры для конфокальной микроскопии (80841, Ibidi, Германия). Все эксперименты с ЭК проводили в стерильных условиях при 37 °C, поддержании атмосферы 95% воздуха: 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo, Япония).

Количественный анализ и контроль качества выделенной РНК проводили с использованием спектрофлюориметра Qubit 4 (Q33238, Thermo Fisher Scientific) и наборов Qubit RNA BR (Q10210, Thermo Fisher Scientific), Qubit RNA IQ (Q33222, Thermo Fisher Scientific), стандартов для калибровки Qubit RNA IQ (Q33235, Thermo Fisher Scientific) и пробирок Qubit (Q32856, Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами производителя. Количественный анализ общего белка проводили с использованием набора BCA Protein Assay Kit (23227, Thermo Fisher Scientific) и микропланшетного спектрофотометра Multiskan Sky (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколами производителя.

Обратную транскрипцию выделенной РНК выполняли с использованием набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (4368814, Thermo Fisher Scientific). Измерение генной экспрессии проводили при помощи ОТ-кПЦР с использованием самостоятельно разработанных праймеров (500 нмоль/л каждый, «Евроген», табл. 1), кДНК (20 нг) и мастер-микса PowerUp SYBR Green (A25778, Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя для Tm >60 °C (стандартные настройки амплификатора). Для каждой биологической повторности при измерении уровня генной

Таблица 1. Последовательности праймеров для ОТ-кПЦР

Table 1. Primer sequences for reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction

Ген / Gene Форвард-праймер / Forward primer Реверс-праймер / Reverse primer

Маркеры и транскрипционные факторы эндотелиальной дифференцировки /Markers and transcription factors of endothelial lineage

PECAMl 5'-TGGCGCATGCCTGTAGTA-3' 5'-TCCGTTTCCTGGGTTCAA-3'

CDH5 5'-AAGCGTGAGTCGCAAGAATG-3' 5'-TCTCCAGGTTTTCGCCAGTG-3'

VWF 5'-CCTTGACCTCGGACCCTTATG-3' 5'-GATGCCCGTTCACACCACT-3'

ERG 5'-CCCGAGGGACATGAGAGAAGAG-3' 5'-ACGGCTTTAGTTGCCCTTGG-3'

Маркеры и транскрипционные факторы общесосудистой дифференцировки /Markers and transcription factors of vascular specification

HESl 5'-AGATAGCTCGCGGCATTCCAAG-3' 5'-ACTTCCCCAGCACACTTGGGT-3'

HEYl 5'-GCCGACGAGACCGGATCAAT-3' 5'-GGCGTGCGCGTCAAAGTAA-3'

HEY2 5'-ACCTCCGAGAGCGACATGGA-3' 5'-CGATCCCGACGCCTTTTCTC-3'

NRPl 5'-ATTTGGAGGACAGAGACTGCAA-3' 5'-CAACAGGAGGAGGGGCTATC-3'

Маркеры и транскрипционные факторы венозно-лимфатической дифференцировки / Markers and transcription factors of venous and lymphatic commitment

NR2F2 5-AGAGCAAGTGGAGAAGCTCAAG-3' 5'-TACATCAGAGAGACCACAGGCA-3'

PROX1 5-CCCGTTATCCCAGCTCCAAT-3' 5'-GTTGATGGCTTGACGTGCGTA-3'

LYVE1 5-TGAAGGGGTAGGCACGATGG-3' 5'-GCATGACACCTGGATGGAAAGC-3'

FLT4 5-TGTGGTCCTTTGGGGTGCTT-3' 5'-CCCTCATCCTTGTGCCGTCT-3'

NRP2 5-CTCGGCTTTTGCAGGTGAGAAT-3' 5'-TGCTCCAGTCCACCTCGTAT-3'

Синтез монооксида азота (NO) / Nitric oxide synthesis

NOS3 5'-GTGATGGCGAAGCGAGTGAAG-3' 5'-CCGAGCCCGAACACACAGAAC-3'

Провоспалительная активация эндотелия /Endothelial activation

VCAM1 5'-CGTCTTGGTCAGCCCTTCCT-3' 5'-ACATTCATATACTCCCGCATCCTTC-3'

ICAM1 5'-TTGGGCATAGAGACCCCGTT-3' 5'-GCACATTGCTCAGTTCATACACC-3'

SELE 5'-GCACAGCCTTGTCCAACC-3' 5'-ACCTCACCAAACCCTTCG-3'

SELP 5-ATGGGTGGGAACCAAAAAGG-3' 5'-GGCTGACGGACTCTTGATGTAT-3'

IL6 5-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3' 5'-GCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3'

CXCL8 5'-CAGAGACAGCAGAGCACAC-3' 5'-AGTTCTTTAGCACTCCTTGGC-3'

CCL2 5-TTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3' 5'-AGGTGACTGGGGCATTGATTG-3'

CXCL1 5-GCTTGCCTCAATCCTGCATCC-3' 5'-ACAATCCAGGTGGCCTCTGC-3'

MIF 5-GGTGTCCGAGAAGTCAGGCA-3' 5'-GGGGCACGTTGGTGTTTACG-3'

Нарушения эндотелиальной механотрансдукции /Impairment of endothelial mechanotransduction

KLF2 5'-CAGCACTGGTCTGGTTGCTTG-3' 5'-ACCCACTGCACACGATGCTT-3'

KLF4 5'-GAAAAGGACCGCCACCCACA-3' 5'-AGCGGGCGAATTTCCATCCA-3'

NFE2L2 5'-GCACATCCAGTCAGAAACCAGT-3' 5'-ACTGAAACGTAGCCGAAGAAAC-3'

Развитие эндотелиально-мезенхимального перехода /Endothelial-to-mesenchymal transition

SNAI1 5'-CAGACCCACTCAGATGTCAAGAA-3' 5'-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3'

SNAI2 5'-ACTCCGAAGCCAAATGACAA-3' 5'-CTCTCTCTGTGGGTGTGTGT-3'

TWIST1 5'-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3' 5'-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3'

ZEB1 5'-GATGATGAATGCGAGTCAGATGC-3' 5'-ACAGCAGTGTCTTGTTGTTGT-3'

Эндотелиальное звено гемостаза /Endothelial haemostasis

SERPINE1 5'-CGCCGCCTCTTCCACAAATC-3' 5'-AGGGCAGTTCCAGGATGTCG-3'

PLAU 5'-CCTGGGTCGCTCAAGGCTTA-3' 5'-CACACCTGCCCTCCTTGGAA-3'

PLAT 5'-TGGAGCAGTCTTCGTTTCGC-3' 5'-CCATGACTGATGTTGCTGGTA-3'

Маркеры клеток мезенхимального ряда / Markers of mesenchymal specification

CDH2 5'-GCTTCTGGTGAAATCGCATTA-3' 5'-AGTCTCTCTTCTGCCTTTGTAG-3'

VIM 5'-CGCCAGATGCGTGAAATGG-3' 5'-ACCAGAGGGAGTGAATCCAGA-3'

FAP 5'-TCAACTGTGATGGCAAGAGCA-3' 5'-TAGGAAGTGGGTCATGTGGGT-3'

S100A4 5'-GCCCTGGATGTGATGGTGT-3' 5'-TCGTTGTCCCTGTTGCTGTC-3'

Маркеры сосудистой гладкомышечной дифференцировки / Markers of vascular smooth muscle cell lineage

ACTA2 5'-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3' 5'-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3'

SMTN 5'-GGGATCGTGTCCACAAGTTCA-3' 5'-GCTACTCCTCGTTGCTCCTT-3'

MYH11 5'-GGTCACGGTTGGGAAAGATGA-3' 5'-GGGCAGGTGTTTATAGGGGTT-3'

Компоненты внеклеточного матрикса /Extracellular matrix components

COL1A1 5'-GTCACCCACCGACCAAGAAACC-3' 5'-AAGTCCAGGCTGTCCAGGGATG-3'

COL1A2 5'-CCCCTGGTATGACTGGTTTCCC-3' 5'-GTCACCACGAGGACCACGAA-3'

Компоненты базальной мембраны /Basement membrane components

COL4A1 5'-GGACTACCTGGAACAAAAGGG-3' 5'-GCCAAGTATCTCACCTGGATCA-3'

COL4A2 5'-CAGGTTTTCCGGGACTCCGT-3' 5'-AAGGGTGTTGGCCTCTCCTG-3'

Гены «домашнего хозяйства» /Housekeeping genes

ACTB 5-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3' 5'-TAGCACAGCCTGGACAGCAAC-3'

GAPDH 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3' 5-GCCCAATACGACCAAATCC-3'

B2M 5'-TCCATCCGACATTGAAGTTG-3' 5'-CGGCAGGCATACTCATCTT-3'

и w 3 S Я ffi

_Q

3§

SB ^

я И

о s

экспрессии выполняли три технических повторно-сти. Реакцию считали успешно проведенной при эффективности 90-105% и R2 >0,98. Количественный анализ уровней мРНК в лизате ЭК (PECAM1, CDH5, VWF, NRP1, ERG, HES1, HEY1, HEY2, NR2F2, PROX1, LYVE1, FLT4, NRP2, NOS3, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, IL6, CXCL8, CCL2, CXCL1, MIF, KLF2, KLF4, NFE2L2, SNAI1, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SERPINE1, PLAU, PLAT, CDH2, VIM, FAP, S100A4, ACTA2, SMTN, MYH11, COL1A1, COL1A2, COL4A1, COL4A2) проводили посредством сравнения ACt. Относительные уровни транскриптов (ACt) пересчитывали относительно экспрессии ре-ференсных генов (ACTB, GAPDH, B2M).

Измерение экспрессии белковых молекул выполняли посредством иммуноблоттинга. Одинаковые количества белка (25 мкг на образец) смешивали с буфером на основе додецилсульфата лития NuPAGE (NP0007, Thermo Fisher Scientific) в соотношении 4:1 и восстановителем NuPAGE (NP0009, Thermo Fisher Scientific) в соотношении 10:1, денатурировали при 99 °C в течение 5 минут и далее загружали на 1,5 мм гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris ((NP0335B0X, Thermo Fisher Scientific). В качестве маркера молекулярных масс использовали смесь белковых стандартов Novex Sharp Pre-Stained (LC5800, Thermo Fisher Scientific) и MagicMark XP Western в соотношении 1:1 (LC5602, Thermo Fisher Scientific). Белки разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (SDS-PAGE) при напряжении 150 В в течение 2 ч с использованием буфера для разделения белков NuPAGE MES SDS (NP0002, Thermo Fisher Scientific), антиоксиданта NuPAGE (NP0005, Thermo Fisher Scientific) и камеры для вертикального электрофореза XCell SureLock Mini-Cell (EI0001, Thermo Fisher Scientific). Перенос белка выполняли с помощью мембран из поливинилидендифторида (PVDF) (IB24001, Thermo Fisher Scientific) и прибора для сухого переноса iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя в стандартном режиме для белков с молекулярной массой 30-150 кДа (P0 - 20 В в течение одной минуты, 23 В в течение 4 минут и 25 В в течение 2 минут). Мембраны далее инкубировали в растворе iBind Flex (SLF2020, Solution Kit Thermo Fisher Scientific) в течение часа для предотвращения неспецифического связывания.

Блоты анализировали с использованием: 1) антител кролика к маркерам эндотелиальной дифференцировки CD31 (ab182981, 1:2000, Abcam, Великобритания), VE-кадгерину (2500, 1:1000, Cell Signaling Technology, США) и NRP1 (ab81321, 1:200, Abcam), транскрипционным факторам эн-дотелиальной дифференцировки ERG (ab92513, 1:200, Abcam), HES1 (ab108937, 1:200, Abcam), HEY1 (ab154077, 1:200, Abcam) и HEY2 (ab221931,

1:200, Abcam), маркерам и транскрипционным факторам венозно-лимфатической дифференци-ровки PROX1 (ab199359, 1:200, Abcam), LYVE1 (ab14917, 1:200, Abcam), VEGFR3 (ab27278, 1:200, Abcam) и NRP2 (ab185710, 1:200, Abcam), молекулам адгезии лейкоцитов к ЭК VCAM1 (ab134047, 1:500, Abcam), ICAM1 (67836, 1:500, Abcam) и E-селектину (ab18981, 1:100, Abcam), механочув-ствительным транскрипционным факторам KLF4 (ab215036, 1:200, Abcam) и NRF2 (ab62352, 1:200, Abcam), транскрипционным факторам ЭндоМТ Snail и Slug (ab180714, 1:200, Abcam); 2) антител мыши к транскрипционному фактору венозно-лим-фатической дифференцировки NR2F2 (ab41859, 1:200, Abcam) и транскрипционному фактору эндо-телиально-мезенхимального перехода TWIST1 (sc-81417, 1:200, Santa Cruz Biotechnology, США); 3) антител козла к ядерному белку «домашнего хозяйства» YY1 (контроль загрузки, AF3784, 1:200, R&D Systems, США). Конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела козла против кролика (7074, Cell Signaling Technology), козла против мыши (AP130P, Sigma-Aldrich, США) и осла против козла (ab205723, Abcam) применяли в разведении 1:200, 1:1000 и 1:400 соответственно. Инкубирование с антителами выполняли с жидкостью iBind Flex (SLF2020, Solution Kit Thermo Fisher Scientific), карточек iBind Flex (SLF2010, Thermo Fisher Scientific) и прибора iBind Flex Western Device (SLF2000, Thermo Fisher Scientific) в течение 3 ч в соответствии с протоколами производителя. Хемилюминесцентную детекцию проводили с использованием субстрата SuperSignal West Pico PLUS (34580, Thermo Fisher Scientific) и цифрового сканера блотов C-DiGit (LI-COR Biosciences) в высокочувствительном режиме (12-минутное сканирование).

Для выполнения флюоресцентного окрашивания монослоя ЭК в 8-луночных культуральных камерах для конфокальной микроскопии (80841, Ibidi) клетки фиксировали 4% параформальде-гидом (P6148, Sigma-Aldrich), далее пермеаби-лизировали 0,1% раствором Triton X-100 (X100, Sigma-Aldrich) в течение 10 мин и производили блокировку неспецифического связывания в 1% солевом растворе бычьего сывороточного альбумина (A2153, Sigma-Aldrich) на фосфатно-солевом буфере (pH 7,4, P4417, Sigma), в течение часа. Затем клеточные культуры инкубировали c первичными антителами кролика и мыши при 4° С в течение 18 ч в сочетаниях, представленных в табл. 2. Сочетан-ную оценку эндотелиального и мезенхимального фенотипов проводили посредством параллельного окрашивания на: 1) CD31 (ab9498, 1:500, Abcam) и альфа-актин гладких мышц (a-SMA, ab5694, 1:250); 2) VE-кадгерин (2500, 1:250, Cell Signaling Technology) и тяжелые цепи миозина гладких мышц

(SM-MHC, ab683, 1:250, Abcam); 3) транскрипционный фактор ERG и смузелин (ab8969, 1:100, Abcam); 4) фактор фон Виллебранда (vWF, ab6994, 1:200, Abcam) и основной компонент межклеточного матрикса коллаген I типа (ab6308, Abcam, 1:100). Инкубацию с вторичными преадсорбированными антителами, конъюгированными с флюорофора-ми Alexa Fluor 488 (ab150061) и Alexa Fluor 555 (ab150110) и разведенными в соотношении 1:500, проводили в течение часа во влажном закрытом коробе при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали вторичные антитела без окрашивания первичными антителами. Между всеми этапами, за исключением промежутка между блокировкой неспецифического связывания и инкубацией с первичными антителами, трижды выполняли промывку фосфатно-солевым буфером. Ядра контрастировали 4',6-диамиди-но-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 30 мин при комнатной температуре (10 мкг/мл, D9542, Sigma-Aldrich). Покровные стекла монтировали с помощью среды ProLong Gold Antifade (P36934, Thermo Fisher Scientific). Визуализацию срезов и анализ результатов иммунофлюоресцентного окрашивания проводили методом конфокальной микроскопии (LSM 700, Carl Zeiss, Германия).

до веретеновидной (рис. 1, C), при этом одновременно культивируемые артериальные ЭК сохраняли вышеописанный эндотелиальный морфотип (рис. 1, D).

Было решено провести комплексный анализ данного феномена с использованием методов полуколичественной оценки генной и белковой экспрессии, а также иммунофенотипирование с конфокальной микроскопией. Измерение генной экспрессии методом ОТ-кПЦР (табл. 3) показало, что HUVEC из первой серии экспериментов (с эндоте-лиальным морфотипом) имели классический профиль экспрессии генов эндотелиальных маркеров (PECAM1, CDH5, VWF, ERG) и общесосудистых маркеров (HES1, HEY1, NRP1), сопоставимый с первичными ЭК коронарной и внутренней грудной артерии. Следует отметить распространенное в литературе мнение о том, что ассоциированные с сигнальным путем Notch транскрипционные факторы HES1 и HEY1 считаются специфичными маркерами артериальной дифференцировки, что не является верным для ЭК человека во взрослом возрасте. Кроме того, экспрессия генов транскрипционных факторов (NR2F2, PROX1) и маркеров (LYVE1, FLT4) венозно-лимфатической дифференцировки

Результаты

Всего проведено две серии экспериментов: первая серия в декабре 2020 г., вторая - в ноябре 2021 г. НЦУЕС, проанализированные в декабре 2020 г., имели характерную для ЭК вытянутую, продолговатую форму (так называемая картина «булыжной мостовой») и относительно небольшую размерность (рис. 1, А), сохраняя данные признаки на протяжении пассажирования и не обладая существенными отличиями в этом отношении от артериальных ЭК (рис. 1, В). По завершении соответствующих экспериментов (не относящихся к предмету данной статьи и поэтому не описанных в «Материалах и методах») ЭК заморожены и далее разморожены в ноябре 2021 г. В то же время после размораживания для другой серии экспериментов в ноябре 2021 г. в процессе культивирования при фазово-микроскопическом контроле обнаружена спонтанная и резкая смена вышеуказанного эндо-телиального морфотипа на мезенхимальный, характеризующаяся выраженным удлинением формы

ь а

e-g

-I

ш о

е-g

D j- -'.'г '„f Ч - . ».л. - " -

° : - v-vJi щущ-т - - ■ • : \ ■■ J1-- ■ 'Д ' : * ч: -- • • .. V V \ - V? л " ~ •■• « "'¿С Í.--V", T,;! ,"'-«,"' - % ■ ■ . ./-H ' •Ж'' 1 -J? ■

Рисунок 1. Фазово-контрастная микроскопия HUVEC и HCAEC в различных сериях экспериментов: A - HUVEC эн-дотелиального фенотипа (эксперимент 2020 г.); B - HCAEC эндотелиального фенотипа (эксперимент 2020 г.); C -HUVEC мезенхимального фенотипа (эксперимент 2021 г.); D - HCAEC эндотелиального фенотипа (эксперимент 2021 г.) Figure 1. Phase contrast microscopy of HUVEC and HCAEC in different experimental series: A - HUVEC, endothelial appearance (2020); B - HCAEC, endothelial appearance (2020). C - HUVEC, mesenchymal appearance (2021). D - HCAEC, endothelial appearance (2021)

Таблица 2. Схема иммунофлюоресцентного окрашивания для иммунофенотипирования эндотелиальных клеток Table 2. Immunofluorescence stainings for the immunophenotyping of endothelial cells

CD31 (ab9498) - Ms (1:500) a-SMA (ab5694) - Rb (1:250) ERG (ab92513) - Rb (1:50) Smoothelin (ab8969) - Ms (1:100) vWF (ab6994) - Rb (1:200) COL I (ab6308) - Ms (1:100)

VE-cadherin (2500) - Rb (1:250) SM-MHC (ab683) - Ms (1:250) Snail + Slug (ab180714) - Rb (1:100) Twist1 (sc-81417) - Ms (1:50) Dnk anti-Rb 488 (ab150061), 1:500 Dnk anti-Ms 555 (ab150110), 1:500

Примечание: каждая ячейка таблицы отражает одну лунку культурального планшета. Rb - антитела кроличьего происхождения (rabbit); Ms - антитела мышиного происхождения (mouse).

Note: each cell within the table reflects one well of cell culture plate. Rb and Ms - rabbit and mouse antibodies, respectively.

также существенно не отличалась между различными линиями ЭК (при этом высокие значения экспрессии демонстрировал лишь ген ключевого транскрипционного фактора венозной диффе-ренцировки NR2F2). Функциональное состояние венозных ЭК не демонстрировало существенных отличий от артериальных, хотя венозные ЭК и ха-растеризовались сниженной экспрессией нескольких провоспалительных генов (VCAM1, SELP, CXCL8, CXCL1), не имея при этом однозначно гиперэкспрессированных генов провоспалитель-ных молекул. Экспрессия транскрипционных факторов эндотелиально-мезенхимального перехода, маркеров клеток мезенхимального ряда, маркеров сосудистой гладкомышечной дифференцировки и компонентов внеклеточного матрикса в венозных ЭК находилась на чрезвычайно низком уровне (за исключением гена виментина и, возможно, гена транскрипционного фактора ZEB1) и также значимо не отличалась от артериальных ЭК. Полученные результаты свидетельствовали в пользу классического эндотелиального фенотипа HUVEC и их незначительных функциональных отличиях от первичных артериальных ЭК, без какого-либо специфичного маркера.

Оценка генной экспрессии HUVEC из второй серии экспериментов (с мезенхимальным морфо-типом) показала существенное отличие профиля их транскриптов как от параллельно культивируемых HCAEC и HITAEC, так и от HUVEC из первой серии экспериментов (с эндотелиальным морфо-типом). В частности, HUVEC с мезенхимальным морфотипом характеризовались практически полной потерей экспрессии генов маркеров эндотели-ального фенотипа PECAM1, CDH5 и VWF, а также гена эндотелиального транскрипционного фактора ERG на фоне многократного повышения экспрессии генов транскрипционных факторов эндотели-ально-мезенхимального перехода SNAI2 и TWIST1

в сравнении с артериальными ЭК и с HUVEC эн-дотелиального морфотипа. В соответствии с этим в HUVEC мезенхимального морфотипа наблюдалось выраженное повышение экспрессии генов мезен-химальных маркеров FAP и S100A4, а также гена сосудистого гладкомышечного маркера ACTA2 (ко-дирующего альфа-актин гладких мышц). Помимо этого, в данных клетках также зарегистрировано повышение экспрессии гена VIM, кодирующего ци-тоскелетный белок клеток мезенхимального ряда виментин, однако стоит отметить высокую базовую экспрессию этого гена в ЭК и обоснованные сомнения в отношении его специфичности как специфичного мезенхимального маркера. Необходимо подчеркнуть отсутствие повышения экспрессии в HUVEC мезенхимального морфотипа гена CDH2, кодирующего N-кадгерин, который зачастую упоминается в литературе как специфичный мезенхи-мальный белок и маркер эндотелиально-мезенхи-мального перехода, а также отсутствие повышения экспрессии генов иных маркеров сосудистого глад-комышечного фенотипа - SMTN и MYH11. Функциональная значимость эндотелиально-мезенхималь-ного перехода в HUVEC подтверждена повышением экспрессии генов COL1A1 и COL1A2, кодирующих различные субъединицы основного белка внеклеточного матрикса коллагена I типа, при этом экспрессии генов COL4A1 и COL4A2, кодирующих субъединицы основного белка базальной мембраны коллагена IV типа, не выявлено.

По аналогии с первой серией экспериментов экспрессия генов транскрипционных факторов и маркеров венозно-лимфатической дифференциров-ки также не различалась между различными линиями ЭК (а относительно высоким уровнем экспрессии все так же характеризовался лишь ген транскрипционного фактора венозной дифференциров-ки NR2F2). В то же время обнаружено существенное снижение активности транскрипции генов

Таблица 3. Измерение генной экспрессии в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) в различном функциональном состоянии по сравнению с положительным контролем (первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и внутренней грудной артерии человека (HITAEC)) методом ОТ-кПЦР. Значения ACt после нормализации на экспрессию генов «домашнего хозяйства» (ACTB, GAPDH, B2M)

Table 3. Measurement of the gene expression in primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) optionally undergoing EndoMT as compared to the positive control (primary human coronary artery endothelial cells and primary human internal thoracic artery endothelial cells) by means of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction. ACt values upon the normalisation by housekeeping genes (ACTB, GAPDH, B2M)

Класс молекул / Molecules Ген / Gene HCAEC HITAEC HUVEC HCAEC HITAEC HUVEC

Эксперимент № 1 (HUVEC в естественном эндотелиальном состоянии) / Experiment No. 1 (HUVEC of conventional phenotype) Эксперимент № 2 (HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода) / Experiment No. 2 (HUVEC undergoing EndoMT)

Маркеры и транскрипционные факторы эндотелиальной дифференцировки / Markers and transcription factors of endothelial lineage PECAM1 0,1220 0,1965 0,1292 1,2842 0,7204 0,0053 0,0020 0,0035 0,002

CDH5 0,4247 0,5115 0,3053 0,5351 0,6237

VWF 0,1397 0,4895 0,1756 0,1884 0,6831

ERG 0,3770 0,1966 0,2447 0,1811 0,3351

Маркеры и транскрипционные факторы общесосудистой дифференцировки / Markers and transcriptional factors of vascular specification HES1 0,0301 0,0295 0,0243 0,0112 0,0171 0,0005

HEY1 0,0021 0,0050 0,0016 0,0005 0,0356 -

HEY2 0,0053 0,0003 0,0001 0,0014 - -

NRP1 0,4580 0,4196 0,3691 0,3390 0,0848 0,6487

Маркеры и NR2F2 0,2462 0,1627 0,2752 0,0617 0,0328 0,0654

транскрипционные факторы венозно- PROX1 0,0007 0,0130 0,0036 0,0002 0,0031 0,0004

лимфатической дифференцировки / LYVE1 0,0016 0,0231 0,0166 0,0005 0,0527 0,0004

Markers and transcription factors of venous and lymphatic commitment FLT4 0,0025 0,0304 0,0099 0,0015 0,0342 0,0204

NRP2 0,0036 0,0086 0,0036 0,0014 0,0099 0,0085

Синтез монооксида азота (NO) / Nitric oxide synthesis NOS3 0,0066 0,0020 0,0015 0,0003 0,0082 0,0009

Рецепторы адгезии лейкоцитов к эндотелию / VCAM1 0,0015 0,0098 0,0002 0,0007 0,0004 0,0003

ICAM1 0,0050 0,0407 0,0115 0,0117 0,4316 0,0106

Endothelial receptors to leukocytes SELE 0,0011 0,0481 0,0038 0,0017 0,1006 0,0002

SELP 0,0025 0,0044 0,0001 0,0047 0,0003 0,0002

IL6 0,0029 0,0007 0,0031 0,0033 0,0016 0,0011

Эндотелиальные провоспалительные цитокины / CXCL8 0,0701 0,0557 0,0219 0,0499 0,3480 0,0541

CCL2 0,0279 0,2563 0,1098 0,1543 2,8119 0,0031

Endothelial pro-inflammatory cytokines CXCL1 0,0763 0,0651 0,0292 0,0925 0,1213 0,1106

MIF 0,2152 0,0812 0,2155 0,0980 0,1547 1,1136

Эндотелиальное звено гемостаза / SERPINE1 3,6637 2,1609 3,6921 1,5035 4,4012 4,1249

PLAU 0,0028 0,0010 0,0015 0,0047 0,0040 0,0005

Endothelial haemostasis PLAT 0,0120 0,0032 0,0041 0,0018 0,0025 0,1317

Транскрипционные факторы эндотелиальной KLF2 0,0018 0,0004 0,0032 0,0007 0,0012 0,0011

механотрансдукции / Transcription KLF4 0,0010 0,0005 0,0008 0,0014 0,0005 0,0167

factors of endothelial mechanotransduction NFE2L2 0,0866 0,0523 0,0860 0,0188 0,0193 0,1436

Транскрипционные факторы эндотелиально-мезенхимального перехода / Transcription factors of endothelial-to-mesenchymal transition SNAI1 0,0071 0,0121 0,0110 0,0190 0,0203 0,0055

SNAI2 0,0002 0,0001 0,0022 0,0225 0,0013 0,5898

TWIST1 0,0004 0,00001 0,0001 0,0001 0,0002 0,0883

ZEB1 0,0350 0,0343 0,0503 0,0224 0,0213 0,0420

Маркеры клеток мезенхимального ряда / CDH2 0,0108 0,0028 0,0289 0,0721 0,0010 0,0151

VIM 11,3684 2,9464 2,4013 2,8573 5,3552 15,1165

Markers of mesenchymal specification FAP 0,00018 0,000019 0,000022 0,0008 - 0,0260

S100A4 0,0005 0,00054 0,0006 0,00067 0,0027 0,0671

Маркеры гладкомышечной дифференцировки / Markers of vascular smooth muscle cell lineage ACTA2 0,0078 0,0016 0,0030 0,0028 0,0020 0,1090

SMTN 0,0035 0,0016 0,0015 0,00088 0,0032 0,0080

MYH11 0,00025 0,00013 0,000033 - - 0,000012

Компоненты внеклеточного матриксо COLI A1 0,0008 0,000041 0,00152 0,0001 0,0001 0,9703

/ Extracel lular matrix components COL1A2 0,0018 0,00034 0,00228 0,000082 0,0024 2,6371

Компоненты базальной мембраны / Basement membrane component s COL4A1 0,1 201 0,1460 0,0188 0,0243 0,3731 0,1190

COL4A2 0,0007 0,0072 0,0008 0,0001 0,0130 -

И Ö*

зн х 5

нд ^

Й -

iö

о s

общесосудистой дoфференцoровкo HES1 и HEY1 (при этом транскрoпцoя гена рецепторного убиквитарного белка сосудистых клеток NRP1 не снижалась). Не выявлено существенных различий в экспрессии гена эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) и генов, ответственных за провоспали-тельную активацию эндотелия, хотя в отношении экспрессии последних в HUVEC мезенхимального морфотипа наблюдался некоторый сдвиг, характеризовавшийся резким снижением экспрессии гена моноцитарного хемоаттрактантного белка CCL2 и выраженным повышением экспрессии гена фактора ингибирования миграции макрофагов MIF. Кроме того, в HUVEC мезенхимального морфотипа отмечено многократное повышение экспрессии гена тканевого активатора плазминогена PLAT (эндоте-лиальное звено гемостаза) и генов атеропротектив-ных транскрипционных факторов эндотелиальной механотрансдукции KLF4 и NFE2L2 - как в сравнении с артериальными ЭК, так и с первой серией экспериментов.

Результаты скрининга генной экспрессии (см. табл. 3) подтверждены при анализе экспрессии соответствующих белков методом иммуноблоттинга (рис. 2). 0 частности, в лизате HUVEC мезенхи-мального морфотипа не наблюдалось экспрессии эндотелиальных маркеров CD31/PECAM1 и VE-кадгерина, а также транскрипционного фактора эндотелиальной дифференцировки ERG. Вместе с тем в данных клетках выявлена сохранная экспрессия убиквитарного сосудистого транскрипционного фактора HES1 и убиквитарного сосудистого белка NRP1, являющегося корецептором к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF). 0 соответствии с результатами анализа генной экспрессии, экспрессия рецептора ЭК для лейкоцитов ICAM1 была значительно выше в HITAEC, что в совокупности с равной загрузкой (отсутствие различий в экспрессии убиквитарного ядерного белка YY1) подтверждает техническую валидность полученных результатов.

С целью визуализации различий между артериальными ЭК (среди культур которых не отмечено случаев эндотелиально-мезенхимального перехода за несколько лет активной работы) HUVEC эндо-телиального фенотипа и HUVEC мезенхимально-го морфотипа проведено иммунофлюоресцентное окрашивание на ряд специфичных маркеров и транскрипционных факторов эндотелиального и мезенхимального фенотипов, эндотелиально-ме-зенхимального перехода. Сочетанное окрашивание на эндотелиальный маркер CD31/PECAM1 и маркер сосудистых гладкомышечных клеток (также относящихся к клеткам мезенхимального ряда) альфа-актин гладких мышц (a-SMA) показало потерю экспрессии CD31/PECAM1 в HUVEC мезенхимального морфотипа, однако экспрессии

a-SMA также не отмечено (рис. 3, А). По результатам последующих окрашиваний на эндотелиальный белок межклеточных контактов VE-кадгерин (кодируемый геном CDH5) и транскрипционный фактор эндотелиальной дифференцировки ERG в сочетании со специфичными маркерами сосудистой гладкомышечной дифференцировки тяжелой цепью миозина гладких мышц (SM-MHC) и сму-зелина (smoothelin) не обнаружено данных молекул в HUVEC мезенхимального морфотипа (рис. 3, B, C), что подтверждает окончательную потерю ими эндотелиального фенотипа, при этом не свидетельствуя в пользу сосудистой гладкомышечной дифференцировки. Положительное окрашивание на коллаген I типа продемонстрировало мезенхи-мальный фенотип спонтанно трансформированных HUVEC и приобретение ими способности к синтезу компонентов внеклеточного матрикса (рис. 3, D). Окрашивание вторичными антителами в отсутствие каких-либо первичных антител подтвердило высокую специфичность иммунофлюоресцентного сигнала (рис. 3, E).

Таким образом, результаты анализа белковой экспрессии различными методами подтвердили результаты анализа генной экспрессии, в совокупности свидетельствуя о: 1) потере эндотелиального фенотипа на уровне как транскрипционных факторов, так и рецепторных маркеров; 2) приобретении основного функционального признака мезенхи-мального фенотипа - высокой активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса. Вероятнее всего, трансдифференцировка HUVEC в процессе эндотелиально-мезенхимального перехода постепенно шла в направлении миофибробластного фенотипа (что подтверждается отсутствием экспрессии

Рисунок 2. Определение экспрессии эндотелиальных маркеров (CD31 и VE-кадгерин), транскрипционного фактора эндотелиальной дифференцировки ERG, транскрипционного фактора (HES1) и убиквитарного рецепторного белка (NRP1) общесосудистой дифференцировки, рецепторов адгезии эндотелиальных клеток для лейкоцитов (VCAM1 и ICAM1) и ядерного белка «домашнего хозяйства» (YY1, контроль загрузки). Иммуноблоттинг Figure 2. Expression of endothelial markers (CD31 and VE-cadherin), ERG transcription factor (endothelial differentiation), HES1 transcription factor (vascular differentiation), NRP1 vascular ubiquitous protein, endothelial receptors for leukocytes (VCAM1 and ICAM1), and nuclear housekeeping protein (YY1, loading control). Western blotting

генов двух специфичных сократительных маркеров - SM-MHC и смузелина в сочетании с одновременной высокой экспрессией генов, кодирующих a-SMA и фибробласт-специфичный белок (S100A4), а также активным синтезом коллагена I типа). В дополнение к этому сохранность экспрессии убиквитарных сосудистых маркеров HES1 и NRP1 также позволяет говорить о схожести подвергшихся эндотелиально-мезенхимальному переходу HUVEC с миофибробластами или сосудистыми гладкомышечными клетками синтетического фенотипа внутри неоинтимы.

Обсуждение

В данной работе рассмотрен случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода неясной этиологии, произошедший с HUVEC в процессе рутинного культивирования. Одной из вероятных причин перехода в данном случае может быть прямое культивирование HUVEC на культу-ральном пластике в отсутствие адгезивного покрытия из коллагена IV типа, фибронектина или лами-нина, однако в то же время следует отметить, что первичные артериальные ЭК (HCAEC и HITAEC) ни разу не подвергались эндотелиально-мезенхи-мальному переходу в аналогичных условиях культивирования на протяжении нескольких лет рутинной работы, а в рекомендациях производителя (Cell Applications) по культивированию конкретно данного наименования HUVEC (200K-05f) о необ-

ходимости осуществлять их культивирование на белковой подложке ничего не сказано. Другой причиной может быть некоторое несоответствие рекомендуемой для культивирования данного наименования HUVEC культуральной среды (MesoEndo Growth Medium, 212-500, Cell Applications вместо Endothelial Cell Growth Medium, 211-500 или 213500, Cell Applications). К сожалению, точный состав данных эндотелиальных сред производитель не раскрывает, хотя с большой долей вероятности они приблизительно соответствуют аналогичным средам EGM-2 (Endothelial Growth Medium-2) и EGM-2MV (Endothelial Growth Medium-2 Microvascular) от компании Lonza, состав которых находится в открытом доступе. Тем не менее данные среды являются принципиально близкими. Среда MesoEndo Growth Medium рекомендована производителем для культивирования ЭК брахиоцефальной, сонной, коронарной, внутренней грудной, подключичной и пупочной артерий, среда Endothelial Cell Growth Medium - для культивирования ЭК аорты, бедренной и легочной артерий, пупочной вены (таким образом, обе среды могут быть использованы для культивирования клеток сосудов различного диаметра). Кроме того, эндотелиальные среды в целом характеризуются взаимозаменяемостью (к примеру, та же среда EGM-2MV рекомендована производителем Lonza для культивирования ЭК аорты, коронарной артерии и более мелких артерий, а личный опыт авторов статьи позволяет утверждать

CD31/ a-SMA SM-MHC / VE-cadherin Smoothelin I ERG COL11 vWF Dnk anti-Ms 555 / Dnk anti-Rb 488

Рисунок 3. Иммунофлюоресцентное окрашивание HCAEC и HUVEC на маркеры эндотелиального и мезенхималь-ного фенотипов: A - CD31 и альфа-актин гладких мышц (a-SMA); B - VE-кадгерин и тяжелые цепи миозина гладких мышц (SM-MHC); C - транскрипционный фактор ERG и смузелин (smoothelin); D - фактор фон Виллебранда (vWF) и основной компонент межклеточного матрикса коллаген I типа (COL1); E - отрицательный контроль Figure 3. Immunofluorescence staining of HCAEC and HUVEC for the markers of endothelial and mesenchymal phenotype: A, CD31 and alpha smooth muscle actin (a-SMA); B - VE-cadherin and smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC); C - ERG transcription factor and smoothelin; D - von Willebrand factor and major extracellular matrix component type I collagen; E - negative control

о возможности использовании среды ECM (Endothelial Cell Medium) от компании ScienCell для культивирования клеток от компании Cell Applications. Поэтому с уверенностью говорить о причинах эндотелиально-мезенхимального перехода в данной культуре HUVEC затруднительно.

В экспериментальных условиях эндотелиально-мезенхимальный переход индуцируют при помощи добавления трансформирующего фактора роста (TGF-P) [10-12], неселективного ингибитора NO-синтазы L-NAME в сочетании с ангио-тензином II [13, 14], активации сигнального пути Notch [15-17] или путем введения в эксперимент гипоксических условий [18, 19]. В данном случае в культуральную среду не добавляли никаких специфических активаторов или ингибиторов, а состав атмосферы внутри инкубатора поддерживали на стандартном уровне (95% воздуха: 5% CO2). Несмотря на активное изучение процесса эндотели-ально-мезенхимального перехода в англоязычной научной литературе [20-24], практические рекомендации по методологии его определения в культуре в русскоязычной печати до настоящего момента отсутствовали. Учитывая наличие случая явного и спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода, выявленного в процессе рутинного культивирования HUVEC, а также наличие различных линий артериальных ЭК в дополнение к HUVEC и биоматериала (РНК и общий белок) от этой же линии HUVEC на стадии эндотелиального фенотипа, авторы данной работы поставили перед собой задачу разработки алгоритма и анализа применимости конкретных инструментов (в первую очередь прай-меров и сочетаний маркеров для иммунофлюорес-центного окрашивания) для детекции эндотелиально-мезенхимального перехода in vitro.

Результаты анализа генной экспрессии позволили прийти к нескольким интересным с практической точки зрения выводам. Первым из них стало явное очерчивание набора эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, CDH5, VWF, ERG), включающих два рецептора (CD31/PECAM1 и VE-кадгерин/

CDH5), запасаемый в тельцах Вайбеля - Паладе ци-тозольный белок (фактор фон Виллебранда, VWF) и транскрипционный фактор эндотелиальной диф-ференцировки (ERG). При этом стоит подчеркнуть принципиальную важность дифференцировки специфичных эндотелиальных маркеров (CD31/ PECAM1, CDH5, VWF, ERG) от общесосудистых, к которым на основании данного исследования целесообразно отнести NRP1 (как убиквитарный рецеп-торный белок), а также HES1 и HEY1 (транскрипционные факторы сигнального пути Notch). Экспрессии гена транскрипционного фактора HEY2 при рутинном культивировании первичных артериальных и венозных ЭК не выявлено, что свидетельствует в пользу его преимущественной важности в биологии индивидуального развития в сравнении с физиологией во взрослом возрасте.

Вторым значимым выводом стало выдвинутое нами в параллельно опубликованной в этом номере журнала работе подтверждение отсутствия специфичности маркеров артериальной и венозно-лим-фатической дифференцировки во взрослом возрасте. Согласно данным литературы, к маркерам артериальной дифференцировки относят транскрипционные факторы сигнального пути Notch (HES1, HEY1, HEY2), транскрипционный фактор ERG (также регулирующий программу сигнального пути Notch) и NRP1, являющийся корецепто-ром к VEGF, а к маркерам венозно-лимфатической дифференцировки - транскрипционный фактор COUP-TFII (кодируемый геном NR2F2 и часто рассматриваемый как специфичный транскрипционный фактор венозной дифференцировки), корецеп-тор к фактору роста сосудистого эндотелия NRP2 (также считаемый более специфичным для вен), транскрипционный фактор PROX1 (рассматриваемый как специфичный транскрипционный фактор лимфатической дифференцировки), рецепторный белок VEGFR3 и мембранный белок LYVE1 (также считаемые более специфичными для лимфатических сосудов) [25-27]. Анализ генной экспрессии показал, что практически все гены, кодирующие

Таблица 4. Панель генов для определения эндотелиально-мезенхимального перехода Table 4. Minimum required markers of endothelial-to-mesenchymal transition

Класс молекул / Molecules Гены / Genes

Маркеры и транскрипционные факторы эндотелиальной дифференцировки / Markers and transcription factors of endothelial lineage PECAM1, CDH5, VWF, ERG

Транскрипционные факторы эндотелиально-мезенхимального перехода / Transcription factors of endothelial-to-mesenchymal transition SNAI2, TWIST1

Маркеры клеток мезенхимального ряда / Markers of mesenchymal lineage FAP, S100A4

Маркеры сосудистой гладкомышечной дифференцировки / Markers of vascular smooth muscle cell lineage ACTA2

Компоненты внеклеточного матрикса / Extracellular matrix components COL1A1, COL1A2

Примечание: АПФ - ангиотензинпревращающий фермент; ИБС - ишемическая болезнь сердца; ИКМП - ишемическая кардиомиопатия. Note: CHD - coronary heart disease; ICM - ischemic cardiomyopathy; АСЕ - angiotensin converting enzyme.

указанные молекулы (HES1, HEY1, ERG, NRP1, NRP2, NR2F2, PROX1, FLT4 и LYVE1), экспрес-сируются во всех линиях артериальных клеток без существенных различий в величине экспрессии. Возможно, что специфичные для отдельных направлений эндотелиальной дифференцировки маркеры во взрослом возрасте все же существуют, однако данный вопрос требует сравнительного анализа протеома как культур венозных и артериальных ЭК in vitro, так и лизата венозного и артериального эндотелия (что затруднено вследствие высокой вероятности контаминации белками сосудистых гладкомышечных клеток). Ранее нашей группой проведен сравнительный биоинформати-ческий анализ транскриптома HCAEC и HUVEC, однако количество молекул-кандидатов при транс-криптомном анализе кратно превышает таковое при анализе протеома. Кроме того, между транскриптами и белками лежит целый ряд этапов модуляции молекулярной экспрессии, включая: 1) регуляцию стабильности мРНК (скорости ее деградации), в том числе механизм микроРНК; 2) экспорт мРНК из ядра в цитоплазму; 3) посттранскрипционное редактирование РНК (замену одних нуклеозидов на другие) и эпитранскриптомные модификации РНК (функционально значимые модификации РНК без замены нуклеозидов); 4) регуляцию стадий самого процесса трансляции (инициации, элонгации и терминации) [28]. Такая многоэтапность (причем каждый этап также подвергается тщательному контролю) регуляции экспрессии молекул между транскриптами и белками неизбежно приводит к сокращению числа молекул-кандидатов и обогащению их патофизиологической значимости (поскольку в конечном счете центральной сигнальной молекулой является белок, а не РНК) при анализе протеома в сравнении с анализом транскриптома.

Третьим выводом стало отсутствие явно выраженной провоспалительной активации при эндоте-лиально-мезенхимальном переходе, которое часто описывается в литературе [1-5, 20-24]. Анализ рецепторов ЭК для лейкоцитов (в первую очередь VCAM1 и ICAM1) не выявил повышения их экспрессии как на генном, так и белковом уровнях при эндотелиально-мезенхимальном переходе в HUVEC. Аналогичные результаты получены при сравнении экспрессии генов основных эндоте-лиальных провоспалительных цитокинов (IL6, CXCL8, CCL2, CXCL1, MIF); хотя HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались сниженным уровнем экспрессии гена CCL2 и повышенным уровнем экспрессии гена MIF в сравнении как с HUVEC вне данного перехода, так и параллельно культивируемыми артериальными ЭК, такой сдвиг сложно однозначно назвать провоспалительным. Безусловно, эндоте-лиально-мезенхимальный переход имеет значимые

функциональные последствия (о которых пойдет речь ниже), однако данный эксперимент не позволяет отнести к ним провоспалительную активацию подвергшихся переходу клеток. Результаты в отношении эндотелиального звена гемостаза и транскрипционных факторов механотрансдукции не вполне однозначны (скорее, свидетельствуют об антитромботическом и антиатерогенном фенотипах подвергшихся эндотелиально-мезенхималь-ному переходу клеток), однако основаны исключительно на данных анализа генной экспрессии и поэтому не обладают достаточной доказательностью.

Более важным является идентификация конкретных транскрипционных факторов, ответственных за эндотелиально-мезенхимальный переход в ЭК. Всего в литературе выделяют пять основных транскрипционных факторов, вызывающих эндотелиаль-но-мезенхимальный переход: Snail (кодируемый геном SNAI1), Slug (кодируемый геном SNAI2), а также Twistl, Zebl и Gata4 (кодируемые одноименными генами) [1-5, 20-24]. Ранние исследования нашей группы показали, что транскрипционный фактор Gata4 не экспрессируется ЭК (данные не показаны), поэтому в молекулярную панель для профилирования генной экспрессии были включены лишь первые четыре транскрипционных фактора, из которых гиперэкспрессированы при переходе в HUVEC два - Slug (SNAI2) и Twistl (TWIST1). К сожалению, анализ белкового лизата ЭК методом иммуноблоттинга не показал присутствия Snail, Slug и Twistl независимо от линии ЭК, однако кратность различий при измерении генной экспрессии позволяет с уверенностью говорить об идентификации Slug и Twistl как ключевых транскрипционных факторов эндотели-ально-мезенхимального перехода.

В отношении маркеров клеток мезенхимально-го ряда следует отметить неспецифичность белка межклеточных контактов N-кадгерина, традиционно относимого к маркерам эндотелиально-ме-зенхимального перехода и противопоставляемого другому белку межклеточных контактов - VE-кад-герину. Не вполне однозначным маркером также является белок цитоскелета клеток мезенхималь-ного ряда виментин, который характеризуется высокой экспрессией во всех видах ЭК, хотя экспрессия кодирующего его гена и кратно повышалась при эндотелиально-мезенхимальном переходе. Оптимальными маркерами клеток мезенхимального ряда и конкретно эндотелиально-мезенхимального перехода следует считать фибробласт-ассоцииро-ванный белок (FAP) и фибробласт-специфичный белок (FSP-l), гены которых (FAP и S100A4) были гиперэкспрессированы при переходе в HUVEC и также являются, по данным литературы, наиболее специфичными маркерами клеток мезенхималь-ного ряда [29]. С позиции авторов большой интерес представляют различия в экспрессии маркеров

сосудистого гладкомышечного дифферона - a-SMA, ген которого (ACTA2) характеризовался выраженной гиперэкспрессией при эндотелиально-мезенхи-мальном переходе в HUVEC, и смузелина c тяжелой цепью миозина гладких мышц (SM-MHC), гены которых (SMTN и MYH11) не экспрессировались при переходе и являются, по данным литературы, специфическими маркерами сосудистых гладко-мышечных клеток сократительного фенотипа [30]. В сочетании с на порядки большей экспрессией генов компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1 и COL1A2) и сохранностью экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1 и NRP1) при эн-дотелиально-мезенхимальном переходе в HUVEC это указывает на принципиальную схожесть подвергшихся переходу HUVEC с миофибробласта-ми неоинтимы, которые также характеризуются сочетанной экспрессией a-SMA (ген ACTA2), FAP/ FSP-1 (гены FAP и S100A4), коллагена I типа (гены субъединиц COL1A1 и COL1A2) и общесосудистых маркеров (HES1 и NRP1) в сочетании с отсутствием экспрессии специфических сократительных белков смузелина (ген SMTN) и SM-MHC (ген MYH11), а также эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерина/CDH5, VWF и ERG).

С методологической стороны вопроса следует отметить высокую применимость профилирования генной экспрессии (ОТ-кПЦР) в сравнении с белковой (иммуноблоттинг) конкретно в случае задачи рутинной характеризации эндотелиально-мезенхи-мального перехода. Рекомендуемая схема профилирования (которое возможно осуществлять при помощи представленных в табл. 1 праймеров) приведена в табл. 4. Следует отметить, что при любых экспериментах с эндотелиально-мезенхимальным переходом независимо от их дизайна необходимо иметь отрицательный контроль - исследуемые клеточные культуры до перехода.

Кроме того, важно выделить схемы иммуно-флюоресцентного окрашивания, информативные и достаточные для определения эндотелиально-ме-зенхимального перехода. Надлежащую доказательную базу этого обеспечивает окрашивание на любой из эндотелиальных мембранных маркеров (CD31/PECAM-1 или VE-кадгерин) и транскрипционный фактор эндотелиальной дифференциров-ки (ERG) в сочетании с маркером синтетического фенотипа (к примеру, коллагеном I типа). Сутью такого варианта окрашивания является демонстрация потери эндотелиального фенотипа в сочетании с приобретением основного компонента мезенхи-мального фенотипа - способности к синтезу компонентов внеклеточного матрикса.

В заключение следует отметить, что предлагаемый алгоритм и инструменты для определения эндотелиально-мезенхимального перехода in vitro лишь частично подходят для детекции данного пе-

рехода in vivo. Выделение эндотелиального лизата при помощи промывки RIPA или T-PER-буфером с последующим измерением уровня генной экспрессии неминуемо сопряжено с контаминацией белками сосудистых гладкомышечных клеток даже у крыс (монослой ЭК которых отделен от мышечной оболочки внутренней эластической мембраной), что может привести к ложноположительным результатам вследствие попадания гладкомышечных транскриптов в эндотелиальный лизат. Вероятно, наиболее подходящим способом определения эндо-телиально-мезенхимального перехода in vivo является эксплантация сосудистых сегментов интереса с последующим иммунофлюоресцентным окрашиванием en face (цельные сегменты с монтированием на предметное стекло интимой вверх) и использованием тех же схем окрашивания, что и in vitro. В то же время, поскольку такой способ приводит к малоэффективному использованию экспериментального биоматериала (один сосудистый сегмент на одно окрашивание), вероятно, целесообразно сократить количество окрашиваний до одного - двух (CD31/ PECAM-1 или ERG в сочетании с коллагеном I типа). Преимущество данного способа состоит в высокой точности определения эндотелиально-мезенхималь-ного перехода, так как подавляющее большинство ЭК даже в патологических условиях организма сохраняют эндотелиальный фенотип.

Заключение

В данном исследовании при помощи различных методов молекулярной и клеточной биологии проанализирован случай спонтанного эндотелиаль-но-мезенхимального перехода при рутинном культивировании HUVEC, изучено функциональное состояние клеток до и после перехода, впервые в русскоязычной научной литературе продемонстрирован алгоритм и предложены инструменты (панель генов для оценки генной экспрессии и схемы имму-нофлюоресцентного окрашивания) для определения эндотелиально-мезенхимального перехода in vitro, спрогнозирована возможность их применения для характеризации перехода in vivo. При исследовании профилей генной экспрессии различных артериальных и венозных ЭК поставлен вопрос необходимости идентификации специфичных артериальных и венозных маркеров, предложена соответствующая методология (анализ протеома соответствующих клеточных линий in vitro и лизата ЭК in vivo). Маркеры эндотелиального фенотипа отделены от маркеров общесосудистого фенотипа, разграничены по специфичности маркеры сосудистого гладкомышеч-ного фенотипа и маркеры клеток мезенхимального ряда. Определены транскрипционные факторы, ответственные за управление транскрипционной программой эндотелиально-мезенхимального перехода конкретно в рассматриваемом клеточном сценарии.

Конфликт интересов

Д.К. Шишкова заявляет об отсутствии конфликта интересов. А.В. Синицкая заявляет об отсутствии конфликта интересов. М.Ю. Синицкий заявляет об отсутствии конфликта интересов. В.Г. Матвеева заявляет об отсутствии конфликта интересов. Е.А. Великанова заявляет об отсутствии конфликта интересов. В.Е. Маркова заявляет об отсутствии конфликта интересов. А.Г. Кутихин заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке комплексной

программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2021-001 «Разработка новых фармакологических подходов к экспериментальной терапии атеросклероза и комплексных цифровых решений на основе искусственного интеллекта для автоматизированной диагностики патологий системы кровообращения и определения риска летального исхода» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках национального проекта «Наука и университеты».

Информация об авторах

Шишкова Дарья Кирилловна, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0002-1518-3888

Синицкая Анна Викторовна, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0002-4467-8732

Синицкий Максим Юрьевич, кандидат биологических наук старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0002-4824-2418

Матвеева Вера Геннадьевна, кандидат медицинских наук старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCID 0000-0002-4146-3373

Великанова Елена Анатольевна, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCID 0000-0002-1079-1956

Маркова Виктория Евгеньевна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0002-6652-5745

Кутихин Антон Геннадьевич, кандидат медицинских наук заведующий лабораторией молекулярной, трансляционной и цифровой медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCID 0000-0001-8679-4857

Author Information Form

Shishkova Daria K., PhD, Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-1518-3888

Sinitskaya Anna V., PhD, Researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-00024467-8732

Sinitsky Maxim Yu., PhD, Senior Researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-4824-2418

Matveeva Vera G., MD, PhD, Senior Researcher at the Laboratory for Tissue Engineering, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-4146-3373

Velikanova Elena A., PhD, Researcher at the Laboratory for Tissue Engineering, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-00021079-1956

Markova Victoria E., PhD, Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-66525745

Kutikhin Anton G., MD, PhD, Head of the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0001-8679-4857

Вклад авторов в статью

ШДК - вклад в концепцию и дизайна исследования, получение данных исследования, написание статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

САВ - получение данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

СМЮ - анализ данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

МВГ - анализ данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

ВЕА - анализ данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

МВЕ - получение данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

КАГ - вклад в концепцию и дизайна исследования, получение данных исследования, написание статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

Author Contribution Statement

ShDK - contribution to the concept and design of the study, data collection, manuscript writing, approval of the final version, fully responsible for the content

SAV - data collection, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

SMYu - data analysis, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

MVG - data analysis, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

VEA - data analysis, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

MVE - data collection, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

KAG - contribution to the concept and design of the study, manuscript writing, approval of the final version, fully responsible for the content

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Li Y., Lui K.O., Zhou B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nat Rev Cardiol. 20l8;l5(8):445-456. doi: l0.l038/s4l569-0l8-0023-y.

2. Kovacic J.C., Dimmeler S., Harvey R.P., Finkel T., Aikawa E., Krenning G., Baker A.H. Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review. J Am Coll Cardiol. 20l9;73(2):l90-209. doi: l0.l0l6/j. jacc.2018.09.089.

3. Chen P.Y., Schwartz M.A., Simons M. Endothelial-to-Mesenchymal Transition, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis. Front Cardiovasc Med. 2020;7:53. doi: 10.3389/fcvm.2020.00053.

4. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 202l;4l(9):2357-2369. doi: l0.ll6l/ ATVBAHA.l2l.3l3788.

5. Peng Q., Shan D., Cui K., Li K., Zhu B., Wu H., Wang B., Wong S., Norton V., Dong Y., Lu Y.W., Zhou C., Chen H. The Role of Endothelial-to-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Cells. 2022;ll(ll):l834. doi: l0.3390/ cells11111834.

6. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):78l-806. doi: l0.ll34/ S0022093022030139.

7. Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020;9(4):876. doi: l0.3390/cells9040876.

8. Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Крив-кина Е.О., Глушкова Т.В., Севостьянова В.В., Кутихин А.Г., Антонова Л.В. Формирование монослоя эндотелиальных клеток на поверхности сосудистого протеза малого диаметра в условиях потока. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 202l. Т. 23. № 3. С. l0l-ll4. doi: 10.15825/1995-1191-2021-3-101-114.

9. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V.,

Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 202l;8:739549. doi: l0.3389/fcvm.202l.739549.

10. Ma J., Sanchez-Duffhues G., Goumans M.J., Ten Dijke P. TGF-ß-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition in Disease and Tissue Engineering. Front Cell Dev Biol. 2020;8:260. doi: l0.3389/fcell.2020.00260.

11. Ma J., van der Zon G., Gonçalves M.A.F.V., van Dinther M., Thorikay M., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-ß-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition Is Determined by a Balance Between SNAIL and ID Factors. Front Cell Dev Biol. 202l;9:6l66l0. doi: l0.3389/fcell.202l.6l66l0.

12. Ma J., van der Zon G., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-ß-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Vis Exp. 202l;(l68). doi: 10.3791/62198.

13. Krishnamoorthi M.K., Thandavarayan R.A., Youker K.A., Bhimaraj A. An In Vitro Platform to Study Reversible Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Front Pharmacol. 2022;l3:9l2660. doi: l0.3389/fphar.2022.9l2660.

14. Tang R., Li Q., Lv L., Dai H., Zheng M., Ma K., Liu B. Angiotensin II mediates the high-glucose-induced endothelial-to-mesenchymal transition in human aortic endothelial cells. Cardiovasc Diabetol. 20l0;9:3l. doi: l0.ll86/l475-2840-9-3l

15. Noseda M., McLean G., Niessen K., Chang L., Pollet I., Montpetit R., Shahidi R., Dorovini-Zis K., Li L., Beckstead B., Durand R.E., Hoodless P.A., Karsan A. Notch activation results in phenotypic and functional changes consistent with endothelial-to-mesenchymal transformation. Circ Res. 2004;94(7):9l0-7. doi: l0. ll6l/0l.RES.0000 l24300.76l7l.C9.

16. Chang A.C., Fu Y., Garside V.C., Niessen K., Chang L., Fuller M., Setiadi A., Smrz J., Kyle A., Minchinton A., Marra M., Hoodless P.A., Karsan A. Notch initiates the endothelial-to-mesenchymal transition in the atrioventricular canal through autocrine activation of soluble guanylyl cyclase. Dev Cell. 20ll;2l(2):288-300. doi: l0.l0l6/j.devcel.20ll.06.022.

17. Kostina A.S., Uspensky V.E., Irtyuga O.B., Ignatieva

E.V., Freylikhman O., Gavriliuk N.D., Moiseeva O.M., Zhuk S., Tomilin A., Kostareva A.A., Malashicheva A.B. Notch-dependent EMT is attenuated in patients with aortic aneurysm and bicuspid aortic valve. Biochim Biophys Acta. 2016;1862(4):733-740. doi: 10.1016/j.bbadis.2016.02.006.

18. Xu X., Tan X., Tampe B., Sanchez E., Zeisberg M., Zeisberg E.M. Snail Is a Direct Target of Hypoxia-inducible Factor 1a (HIFla) in Hypoxia-induced Endothelial to Mesenchymal Transition of Human Coronary Endothelial Cells. J Biol Chem. 2015;290(27):16653-64. doi: 10.1074/jbc. M115.636944.

19. Tang H., Babicheva A., McDermott K.M., Gu Y., Ayon R.J., Song S., Wang Z., Gupta A., Zhou T., Sun X., Dash S., Wang Z., Balistrieri A., Zheng Q., Cordery A.G., Desai A.A., Rischard

F., Khalpey Z., Wang J., Black S.M., Garcia J.G.N., Makino A., Yuan J.X. Endothelial HIF-2a contributes to severe pulmonary hypertension due to endothelial-to-mesenchymal transition. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018;314(2):L256-L275. doi: 10.1152/ajplung.00096.2017.

20. Dejana E., Hirschi K.K., Simons M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nat Commun. 2017;8:14361. doi: 10.1038/ncomms14361.

21. Piera-Velazquez S., Jimenez S.A. Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the Pathogenesis ofHuman Diseases. Physiol Rev. 2019;99(2):1281-1324. doi: 10.1152/physrev.00021.2018.

22. Gao Y., Galis Z.S. Exploring the Role of Endothelial Cell Resilience in Cardiovascular Health and Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):179-185. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314346.

23. Greenspan L.J., Weinstein B.M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease.

Angiogenesis. 2021;24(2):251-269. doi: 10.1007/s10456-020-09761-7.

24. Великанова Е.А., Кутихин А.Г., Матвеева В.Г., Тупи-кин А.Е., Кабилов М.Р., Антонова Л.В. Сравнение профиля генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток из периферической крови человека и эндотелиаль-ных клеток коронарной артерии. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020; 9(2): 74-81. doi: 10.17802/2306-1278-2020-9-2-74-81.

25. Niklason L., Dai G. Arterial Venous Differentiation for Vascular Bioengineering. Annu Rev Biomed Eng. 2018;20:431 -447. doi: 10.1146/annurev-bioeng-062117-121231.

26. Wolf K., Hu H., Isaji T., Dardik A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. J Vasc Surg. 2019;69(1):253-262. doi: 10.1016/j.jvs.2018.06.195.

27. Marziano C., Genet G., Hirschi K.K. Vascular endothelial cell specification in health and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):213-236. doi: 10.1007/s10456-021-09785-7.

28. Corbett A.H. Post-transcriptional regulation of gene expression and human disease. Curr Opin Cell Biol. 2018;52:96-104. doi: 10.1016/j.ceb.2018.02.011.

29. Evrard S.M., Lecce L., Michelis K.C., Nomura-Kitabayashi A., Pandey G., Purushothaman K.R., d'Escamard V., Li J.R., Hadri L., Fujitani K., Moreno P.R., Benard L., Rimmele P., Cohain A., Mecham B., Randolph G.J., Nabel E.G., Hajjar R., Fuster V., Boehm M., Kovacic J.C. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nat Commun. 2016;7:11853. doi: 10.1038/ncomms11853.

3 0. Yap C., Mieremet A., de Vries C.J.M., Micha D., de Waard V. Six Shades of Vascular Smooth Muscle Cells Illuminated by KLF4 (Krüppel-Like Factor 4). Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(11):2693-2707. doi: 10.1161/ATVBAHA121.316600.

REFERENCES

1. Li Y., Lui K.O., Zhou B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nat Rev Cardiol. 2018;15(8):445-456. doi: 10.1038/s41569-018-0023-y.

2. Kovacic J.C., Dimmeler S., Harvey R.P., Finkel T., Aikawa E., Krenning G., Baker A.H. Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review. J Am Coll Cardiol. 2019;73(2): 190-209. doi: 10.1016/j. jacc.2018.09.089.

3. Chen P.Y., Schwartz M.A., Simons M. Endothelial-to-Mesenchymal Transition, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis. Front Cardiovasc Med. 2020;7:53. doi: 10.3389/fcvm.2020.00053.

4. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(9):2357-2369. doi: 10.1161/ AT VBAHA.121.313788.

5. Peng Q., Shan D., Cui K., Li K., Zhu B., Wu H., Wang B., Wong S., Norton V., Dong Y., Lu Y.W., Zhou C., Chen H. The Role of Endothelial-to-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Cells. 2022;11(11): 1834. doi: 10.3390/ cells11111834.

6. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):781-806. doi: 10.1134/ S0022093022030139.

7. Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020;9(4):876. doi: 10.3390/cells9040876.

8. Khanova M.Yu., Velikanova E.A., Matveeva V.G., Krivkina E.O., Glushkova T.V., Sevostianova V.V., Kutikhin

A.G., Antonova L.V. Endothelial cell monolayer formation on a small-diameter vascular graft surface under pulsatile flow conditions. Bulletin of Transplantology and Artificial Organs. 2021;3(23): 101-114. doi: 10.15825/1995-1191-2021-3-101114.

9. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T. V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 2021;8:739549. doi: 10.3389/fcvm.2021.739549.

10. Ma J., Sanchez-Duffhues G., Goumans M.J., Ten Dijke P. TGF-ß-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition in Disease and Tissue Engineering. Front Cell Dev Biol. 2020;8:260. doi: 10.3389/fcell.2020.00260.

11. Ma J., van der Zon G., Gonfalves M.A.F.V., van Dinther M., Thorikay M., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-ß-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition Is Determined by a Balance Between SNAIL and ID Factors. Front Cell Dev Biol. 2021;9:616610. doi: 10.3389/fcell.2021.616610.

12. Ma J., van der Zon G., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-ß-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Vis Exp. 2021;(168). doi: 10.3791/62198.

13. Krishnamoorthi M.K., Thandavarayan R.A., Youker K.A., Bhimaraj A. An In Vitro Platform to Study Reversible Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Front Pharmacol. 2022;13:912660. doi: 10.3389/fphar.2022.912660.

14. Tang R., Li Q., Lv L., Dai H., Zheng M., Ma K., Liu B. Angiotensin II mediates the high-glucose-induced endothelial-to-mesenchymal transition in human aortic endothelial cells. Cardiovasc Diabetol. 2010;9:31. doi: 10.1186/1475-2840-9-31

15. Noseda M., McLean G., Niessen K., Chang L., Pollet I., Montpetit R., Shahidi R., Dorovini-Zis K., Li L., Beckstead B., Durand R.E., Hoodless P.A., Karsan A. Notch activation results in phenotypic and functional changes consistent with endothelial-to-mesenchymal transformation. Circ Res. 2004;94(7):9l0-7. doi: l0.ll6l/0l.RES.0000l24300.76l7l.C9.

16. Chang A.C., Fu Y., Garside V.C., Niessen K., Chang L., Fuller M., Setiadi A., Smrz J., Kyle A., Minchinton A., Marra M., Hoodless P.A., Karsan A. Notch initiates the endothelial-to-mesenchymal transition in the atrioventricular canal through autocrine activation of soluble guanylyl cyclase. Dev Cell. 20ll;2l(2):288-300. doi: l0.l0l6/j.devcel.20ll.06.022.

17. Kostina A.S., Uspensky V.E., Irtyuga O.B., Ignatieva

E.V., Freylikhman O., Gavriliuk N.D., Moiseeva O.M., Zhuk S., Tomilin A., Kostareva А.А., Malashicheva A.B. Notch-dependent EMT is attenuated in patients with aortic aneurysm and bicuspid aortic valve. Biochim Biophys Acta. 20l6;l862(4):733-740. doi: l0.l0l6/j.bbadis.20l6.02.006.

18. Xu X., Tan X., Tampe B., Sanchez E., Zeisberg M., Zeisberg E.M. Snail Is a Direct Target of Hypoxia-inducible Factor la (HIFla) in Hypoxia-induced Endothelial to Mesenchymal Transition of Human Coronary Endothelial Cells. J Biol Chem. 20l5;290(27):l6653-64. doi: l0.l074/jbc. Mll5.636944.

19. Tang H., Babicheva A., McDermott K.M., Gu Y., Ayon R.J., Song S., Wang Z., Gupta A., Zhou T., Sun X., Dash S., Wang Z., Balistrieri A., Zheng Q., Cordery A.G., Desai A.A., Rischard

F., Khalpey Z., Wang J., Black S.M., Garcia J.G.N., Makino A., Yuan J.X. Endothelial HIF-2a contributes to severe pulmonary hypertension due to endothelial-to-mesenchymal transition. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 20l8;3l4(2):L256-L275. doi: 10.1152/ajplung.00096.2017.

20. Dejana E., Hirschi K.K., Simons M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nat Commun. 20l7;8:l436l. doi: l0.l038/ncommsl436l.

21. Piera-Velazquez S., Jimenez S.A. Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the Pathogenesis ofHuman Diseases. Physiol Rev. 20l9;99(2):l28l-l324. doi: l0.ll52/physrev.0002l.20l8.

22. Gao Y., Galis Z.S. Exploring the Role of Endothelial Cell Resilience in Cardiovascular Health and Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):179-185. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314346.

23. Greenspan L.J., Weinstein B.M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):251-269. doi: 10.1007/s10456-020-09761-7.

24. Velikanova E.A., Kutikhin A.G., Matveeva V.G., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Antonova L.V. Comparison of gene expression profiles of human peripheral blood derived endothelial colony-forming cells and coronary artery endothelial cells. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2020;9(2):74-81. doi: 10.17802/2306-1278-2020-9-2-74-81.

25. Niklason L., Dai G. Arterial Venous Differentiation for Vascular Bioengineering. Annu Rev Biomed Eng. 2018;20:431 -447. doi: 10.1146/annurev-bioeng-062117-121231.

26. Wolf K., Hu H., Isaji T., Dardik A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. J Vasc Surg. 2019;69(1):253-262. doi: 10.1016/j .jvs.2018.06.195.

27. Marziano C., Genet G., Hirschi K.K. Vascular endothelial cell specification in health and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):213-236. doi: 10.1007/s10456-021-09785-7.

28. Corbett A.H. Post-transcriptional regulation of gene expression and human disease. Curr Opin Cell Biol. 2018;52:96-104. doi: 10.1016/j.ceb.2018.02.011.

29. Evrard S.M., Lecce L., Michelis K.C., Nomura-Kitabayashi A., Pandey G., Purushothaman K.R., d'Escamard V., Li J.R., Hadri L., Fujitani K., Moreno P.R., Benard L., Rimmele P., Cohain A., Mecham B., Randolph G.J., Nabel E.G., Hajjar R., Fuster V., Boehm M., Kovacic J.C. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nat Commun. 2016;7:11853. doi: 10.1038/ncomms11853.

3 0. Yap C., Mieremet A., de Vries C.J.M., Micha D., de Waard V. Six Shades of Vascular Smooth Muscle Cells Illuminated by KLF4 (Krüppel-Like Factor 4). Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(11):2693-2707. doi: 10.1161/ATVBAHA.121.316600.

Для цитирования: Шишкова Д.К., Синицкая А.В., Синицкий М.Ю., Матвеева В.Г., Великанова Е.А., Маркова В.Е., Кутихин А.Г. Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2022;11(3): 97-114. DOI: 10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114

To cite: Shishkova D.K., Sinitskaya A.V, Sinitsky M.Yu., Matveeva V.G., Velikanova E.A., Markova V.E., Kutikhin A.G. Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition in human primary umbilical vein endothelial cells. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2022;11(3): 97-114. DOI: 10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114