ПАРАМЕТРЫ ПРАЙМЕРОВ, КОРРЕЛИРУЮЩИЕ С КОЭФФИЦИЕНТОМ ДЕТЕРМИНАЦИИ И ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

мплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний

13

УДК 57.088.1

DOI 10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20

ПАРАМЕТРЫ ПРАЙМЕРОВ, КОРРЕЛИРУЮЩИЕ С КОЭФФИЦИЕНТОМ

ДЕТЕРМИНАЦИИ И ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Л.А. Богданов, Д.К. Шишкова, М.Ю. Синицкий, А.Г. Кутихин

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Сосновый бульвар, 6, Кемерово, Российская Федерация, 650002

Основные положения

• Проведен корреляционный анализ параметров праймеров и эффективности и коэффициента детерминации кПЦР на двух независимых массивах экспериментальных данных.

• При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Материалы и методы

Выявить, существует ли корреляция между параметрами праймеров, эффек-Цель тивностью и коэффициентом детерминации количественной полимеразной

цепной реакции (кПЦР).

Выделение РНК производили из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии с последующим синтезом одноцепочечной комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Методом кПЦР с детекцией результата в режиме реального времени (флуоресцентный краситель SYBR Green I) определяли экспрессию следующих генов: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Праймеры разработаны в программе Primer-BLAST. Корреляционный анализ по Спирмену выполнен в программе GraphPad Prism.

Коэффициент детерминации коррелировал с количественной оценкой качества праймеров, разработанных в программе Beacon Designer, температурой плавления ампликона и содержанием гуанина - цитозина в обратном праймере. Эффективность кПЦР, напротив, не коррелировала с количественной оценкой качества созданных в Beacon Designer праймеров, но коррелировала с длиной, а также процентным содержанием GC в обратных праймерах. Все указанные коэффициенты корреляции находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, отражая корреляционную связь средней силы. В то же время остальные параметры (как для пар, так и отдельно прямого и обратного праймеров) не влияли на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Результаты

Заключение

Ключевые слова

При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

кПЦР • Ампликон • Дизайн праймеров • Эффективность кПЦР • Коэффициент детерминации

Поступила вредакцию: 10.04.2020; поступила после доработки: 07.05.2020; принята к печати: 30.05.2020

PRIMER PARAMETERS DEFINING EFFICIENCY AND COEFFICIENT OF

DETERMINATION IN QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION

L.A. Bogdanov, D.K. Shishkova, M.Yu. Sinitsky, A.G. Kutikhin

Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, Russian Federation, 650002

Highlights

• We performed a correlation analysis between primer parameters and qPCR efficiency/coefficient

Для корреспонденции: Лев Александрович Богданов, bogdanovleone@gmail.com; адрес: Сосновый бульвар, 6, Кемерово, Россия, 650002

Corresponding author: Leo A. Bogdanov, e-mail:bogdanovleone@gmail.com; address: 6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, Russian Federation, 650002

14 Параметры праймеров и результат кПЦР

of determination in two independent samples from in vitro functional experiments.

• Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings.

Aim To find the correlation between the primer parameters, efficiency, and coefficient of determination (R2) in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) conditions.

Methods Upon RNA isolation from primary human coronary artery endothelial cells, we performed reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) utilising SYBR Green chemistry to measure the expression of the following genes: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Primers were designed employing Primer-BLAST software using optimised settings. For the correlation analysis, Spearman's rank correlation coefficient was applied (GraphPad Prism).

Results Coefficient of determination correlated with the primer pair rating by Beacon Designer, amplicon melting temperature, and GC content in the reverse primer. Reaction efficiency did not correlate with the Beacon Designer rating, yet being associated with length and GC content of the reverse primer. Abovementioned correlation coefficients ranged from 0.4 to 0.5 or from -0.4 to -0.5 indicative of moderate positive or negative correlation. Other parameters did not affect reaction efficiency and coefficient of determination.

Conclusion Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings.

Keywords qPCR • Amplicon • Primer design • Efficiency • Coefficient of determination

Received: 10.04.2020; received in revised form: 07.05.2020; accepted: 30.05.2020

Список сокращений

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая Е

кислота GC

кПЦР - количественная полимеразная цепная реакция R2

эффективность гуанин и цитозин коэффициент детерминации

Введение

Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) - это молекулярный метод, который используют в биомедицине [1, 2] и активно применяют для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний, стратификации риска развития неинфекционных заболеваний, а также нужд криминалистики [3-7]. Данный метод является «золотым стандартом» при анализе генной экспрессии, однако имеет многочисленные технические нюансы в выполнении [8-10].

Стандартной процедурой для максимизации специфичности праймеров и выхода продукта при кПЦР является оптимизация дизайна праймеров [5, 6, 10]. Неправильно или неоптимально сконструированные праймеры могут образовывать диме-ры или шпильки, гибридизоваться только в узком диапазоне температур и выдавать неспецифичные продукты амплификации [9, 11, 12]. Кроме того, такие праймеры крайне чувствительны к незначительным изменениям условий амплификации, что приводит к снижению специфичности и эффектив-

ности кПЦР и потере времени, израсходованного на оптимизацию протокола [9]. Дополнительную сложность оптимизации протокола при кПЦР придает то, что производители мастер-миксов используют разные концентрации Mg2+ и компоненты буферных растворов, поэтому применение одной пары праймеров с разными мастер-миксами с большой долей вероятности приведет к различным результатам [9, 13]. Эффективность кПЦР отражает качество разработанных праймеров и оптимизации протокола, и при правильно созданных праймерах показатель должен составлять 90-105% [9, 13].

На первый взгляд может показаться, что удобнее использовать коммерческие праймеры. Как правило, такие праймеры проверены производителем, а протокол - заранее оптимизирован. Однако данные праймеры характеризуются высокой стоимостью и длительным сроком доставки. Наиболее распространенными программами для самостоятельного конструирования праймеров, находящимися в бесплатном или ограниченно свободном доступе, являются Ргтег3Р!ш, Primer-BLAST, PrimerQuest

Л.А. Богданов и др.

15

и Beacon Designer [7, 9, 14, 15]. Также доступны программы для контроля качества разработанных праймеров, включая их склонность к образованию димеров и шпилек (например, PCR Primer Stats и Multiple Primer Analyzer) [7, 9, 11, 14].

Цель исследования - оценить, какие параметры праймеров внутри оптимизированных настроек разработки и в какой степени влияют на эффективность и линейность кПЦР.

Материалы и методы

Рибонуклеиновую кислоту для использованных в данном исследовании массивов данных выделяли из коммерческой линии первичных эндотелиаль-ных клеток коронарной артерии, поврежденных в ходе эксперимента магний-фосфатными и кальций-фосфатными бионами (время экспозиции для первого массива данных составило 4 ч, для второго - 24 ч). При помощи обратной транскрипции синтезировали одноцепочечную комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК) согласно протоколу набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США).

Разработку праймеров для определения экспрессии генов (IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3 и PXDN) осуществляли в программе Primer-BLAST (National Institutes of Health, США). При разработке прайме-ров использовали следующие параметры: длина ам-пликона - от 100 до 200 пар оснований, температура плавления праймеров - от 59 до 70 °C с различием между праймерами не более 3 °С, включение ин-трона с длиной не менее 200 пар оснований - обязательно, длина праймера - от 18 до 22 нуклеотидов, содержание гуанина (G) и цитозина (C) в праймерах - от 40 до 60%, максимальная длина повтора одного и того же нуклеотида подряд - 4, максимальное содержание GC на З'-конце - не более 3 (60%), максимальная комплементарность праймеров - не более 5 условных единиц. Остальные параметры разработки праймеров соответствовали настройкам по умолчанию. Проверяли сконструированные праймеры в программах PCR Primer Stats (Sequence Manipulation Suite, Канада) и Multiple Primer Analyzer (Thermo Scientific Web Tools, США).

Синтез праймеров осуществляло ЗАО «Ев-роген» (Россия). Готовили реакционную смесь общим объемом 10 мкл, содержащую 5 мкл ма-стер-микса PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, США), по 500 нмоль/л прямого и обратного праймеров и 10 нг кДНК. Реакцию проводили в стандартном 96-луночном оптическом планшете, содержащем помимо 26 анализируемых образцов 5 стандартов с двукратным разведением

и отрицательным контролем (реакционная смесь без кДНК). Амплификацию выполняли в течение 45 циклов с использованием следующих настроек: денатурация - 15 секунд при 95 °C, отжиг - 15 секунд при 62,4-70,4 °C (в зависимости от температуры плавления праймеров), элонгация - 1 мин при 72 °C. Использованные в эксперименте последовательности праймеров представлены в табл. 1.

Для оценки связи коэффициента детерминации и эффективности кПЦР с параметрами праймеров использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Корреляционный анализ проводили в программе GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, США).

Результаты

По результатам анализа генной экспрессии эн-дотелиальных клеток, инкубированных с бионами в течение 4 ч, для большинства исследованных генов (исключая IL23A, PECAM1, FAPA и IL1R2) получены значения коэффициента детерминации (R2) и эффективности (E) (табл. 2). кПЦР считалась успешной при значениях R2 от 0,98 до 1 (с округлением до сотых долей единицы) и E от 85 до 105%. Большинство реакций оказались успешными, однако для следующих генов выявлены низкие значения: VCAM1 (R2 = 0,969, E = 68,3), SMTN (R2 = 0,984, E = 72,4), SNAI2 (R2 = 0,986, E = 71,9), TWIST1 (R2 = 0,996, E = 73,0), CD36 (R2 = 1, E = 76,7). Все показатели R2, за исключением 0,969 для гена VCAM1, находились в диапазоне приемлемых значений. Результаты корреляционного анализа первого массива данных показали обратную корреляцию между значением R2 и количественной оценкой в программе Beacon Designer (r = -0,36), обратную корреляцию E и длины обратного праймера (r = -0,43), а также прямую корреляционную зависимость между E и содержанием GC в обратном праймере (r = 0,41). Связи между R2 и E не наблюдали.

При анализе второго массива данных (табл. 3) получены приемлемые значения R2 и E для всех генов кроме CXCL8 (R2=0,931, E=72,3), MMP2 (R2=0,986, E = 84,5), SNAI1 (R2 = 0,993, E = 84,6), TWIST1 (R2 = 0,996, E = 68,2), VLDLR (R2 = 0,99, E = 69,9), IL1R2 (R2 = 0,988, E = 79,1) и TNFRSF1B (R2 = 0,970, E = 96,9). Отмечены прямая корреляция R2 и количественной оценки в программе Beacon Designer (r = 0,40), обратные корреляции с длиной амплико-на (r = -0,45) и содержанием GC в обратном прай-мере (r = -0,43).

По итогам корреляционного анализа первого и второго массивов данных выявлено, что вышеперечисленные зависимости находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, тем самым отражая корреляционную связь средней силы. Некоторые параметры коррелировали с E или R2, однако ни один из показателей не верифицирован на обоих массивах данных.

16 Primer parameters and qPCR results

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в эксперименте

Table 1. Primer sequences for the reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

№ Ген и идентификационный номер последовательности мРНК по базе данных RefSeq / Gene and RefSeq mRNA sequence number Последовательности праймеров / Primer sequences Температура плавления, °C / Melting temperature, °C

i IL1B (NM_000576.2) П (F): 5'-TGGCTTATTACAGTGGCAATG-3' О (R): 5'-GTGGTGGTCGGAGATTCG-3' 64

2 IL6 (NM_000600.4) П (F): 5'-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3' О (R): 5'-GCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3' 62,9

3 CXCL8 (NM_000584.3) П (F): 5'-CAGAGACAGCAGAGCACAC-3' О (R): 5'-AGTTCTTTAGCACTCCTTGGC-3' 64,5

4 IL23A (NM_016584.2) П (F): 5'-CTCAGGGACAACAGTCAGTTC-3' О (R): 5'-ACAGGGCTATCAGGGAGCA -3' 66,8

5 PECAM1 (NM_000442.4) П (F): 5'-AAGGAACAGGAGGGAGAGTATTA -3' О (R): 5'-GTATTTTGCTTCTGGGGACACT-3' 64,8

6 VWF (NM_000552.4) П (F): 5'-CCTTGACCTCGGACCCTTATG -3' О (R): 5'-GATGCCCGTTCACACCACT-3' 66,8

7 KDR (NM_002253.3) П (F): 5'-TGCCTACCTCACCTGTTTC-3' О (R): 5'-GGCTCTTTCGCTTACTGTTC -3' 63

S FAPA (NM_004460.4) П (F): 5'-TCAACTGTGATGGCAAGAGCA -3' О (R): 5'TAGGAAGTGGGTCATGTGGGT-3' 67

9 ACTA2 (NM_001613.3) П (F): 5'-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3' О (R): 5'-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3' 64,5

iG SMTN (NM_006932.4) П (F): 5'-GGGATCGTGTCCACAAGTTCA-3' О (R): 5'-GCTACTCCTCGTTGCTCCTT-3' 65,8

ii VIM (NM_003380.4) П (F): 5'-CGCCAGATGCGTGAAATGG-3' О (R): 5'-ACCAGAGGGAGTGAATCCAGA-3' 66,4

i2 MMP2 (NM_004530.5) П (F): 5'-CCGTGTTTGCCATCTGTTTTAG-3' О (R): 5'-AGGTTCTCTTGCTGTTTACTTTGGA-3' 66,6

i3 SNAI1 (NM_005985.3) П (F): 5'-CAGACCCACTCAGATGTCAAGAA-3' О (R): 5'-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3' 67,1

14 SNAI2 (NM_003068.4) П (F): 5'-ACTCCGAAGCCAAATGACAA-3' О (R): 5'-CTCTCTCTGTGGGTGTGTGT-3' 65,4

i5 TWIST1 (NM_000474.3) П (F): 5'-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3' О (R): 5'-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3' 66,8

i6 ZEB1 (NM_030751.5) П (F): 5'-GATGATGAATGCGAGTCAGATGC-3' О (R): 5'-ACAGCAGTGTCTTGTTGTTGT-3' 64,8

i7 SCARF1 (NM_003693.3) П (F): 5'-CCGATCAGACCTCAAGGACAG-3' О (R): 5'-CCCAGGGTAGCTTGTGGGA-3' 67,7

iS CD36 (NM_000072.3) П (F): 5'-GGCTGTGACCGGAACTGTG-3' О (R): 5'-AGGTCTCCAACTGGCATTAGAA-3' 65,4

i9 LDLR (NM_000527.4) П (F): 5'-ACGGCGTCTCTTCCTATGACA-3' О (R): 5'-CCCTTGGTATCCGCAACAGA-3' 66,2

2G VLDLR (NM_003383.4) П (F): 5'-AGAAAAGCCAAATGTGAACCCT-3' О (R): 5'-CACTGCCGTCAACACAGTCT-3' 66,8

2i VCAM1 (NM_001078.3) П (F): 5'-CGTCTTGGTCAGCCCTTCCT-3' О (R): 5'-ACATTCATATACTCCCGCATCCTTC-3' 66,5

22 ICAM1 (NM_000201.2) П (F): 5'-TTGGGCATAGAGACCCCGTT-3' О (R): 5'-GCACATTGCTCAGTTCATACACC-3' 66,4

23 SELE (NM_000450.2) П (F): 5'-GCACAGCCTTGTCCAACC-3' О (R): 5'-ACCTCACCAAACCCTTCG-3' 63,5

24 SELP (NM_003005.3) П (F): 5'-ATGGGTGGGAACCAAAAAGG-3' О (R): 5'-GGCTGACGGACTCTTGATGTAT-3' 66,1

25 CDH5 (NM_001795.4) П (F): 5'-AAGCGTGAGTCGCAAGAATG-3' О (R): 5'-TCTCCAGGTTTTCGCCAGTG-3' 66,6

26 IL1R1 (NM_000877.3) П (F): 5'-GGCTGAAAAGCATAGAGGGAAC-3' О (R): 5'-CTGGGCTCACAATCACAGG-3' 64,6

27 IL1R2 (NM_004633.3) П (F): 5'-TGGCACCTACGTCTGCACTACT-3' О (R): 5'-TTGCGGGTATGAGATGAACG-3' 64,3

2S TNFRSF1A (NM_001065.3) П (F): 5'-CCAGGAGAAACAGAACACCGT-3' О (R): 5'-AAACCAATGAAGAGGAGGGATAA-3' 63,4

29 TNFRSF1B (NM_001066.2) П (F): 5'-GTCCACACGATCCCAACAC-3' О (R): 5'-CACACCCACAATCAGTCCAA-3' 64,4

3G NOS3 (NM_000603.4) П (F): 5'-GTGATGGCGAAGCGAGTGAAG-3' О (R): 5'-CCGAGCCCGAACACACAGAAC-3' 69,9

3i PXDN (NM_012293.2) П (F): 5'-AGCCAGCCATCACCTGGAAC-3' О (R): 5'-TTCCGGGCCACACACTCATA-3' 67,7

Обсуждение

Несмотря на то что в некоторых случаях получены значимые корреляции, ни одна из них не ва-лидирована на обоих массивах данных. Таким образом, подтверждения, что диапазон какого-либо из параметров существенно влияет на эффективность или линейность кПЦР внутри оптимизированных настроек разработки, не обнаружено. Вероятно, это связано с тем, что для подавляющего большинства генов каждая разработанная пара праймеров была подобрана с учетом всех рекомендаций по дизайну, а отклонение от рекомендуемых параметров

Ь.Л. Bogdanov й а1. 17

наблюдалось только в случае невозможности разработать праймеры в рамках заданных параметров.

Согласно данным зарубежной литературы, соотношение GC в праймерах должно быть около 50%, в действительности при конструировании праймеров этот показатель варьирует от 40 до 60% [14]. Некоторые авторы утверждают, что оптимальная температура плавления праймеров составляет 59-68 °С, тогда как другие заявляют о предпочтительном диапазоне 60-65 °С [1]. В данной работе температура плавления праймеров находилась в диапазоне от 59 до 65 °С.

Таблица 2. Результаты, полученные во время кПЦР-анализа первого массива данных (экспозиция первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека бионами в течение 4 ч)

Table 2. Results of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in the first sample (exposure of primary human coronary artery endothelial cells to bions for 4 hours)

№ Ген и идентификационный номер последовательности мРНК по базе данных RefSeq / Gene and RefSeq mRNA sequence number Коэффициент детерминации (R2) / Coefficient of determination (R2) Эффективность / Efficiency

1 IL1B (NM_000576.2) 0,984 93,603

2 IL6 (NM_000600.4) 0,997 106,898

3 CXCL8 (NM_000584.3)

4 IL23A (NM_016584.2) Не определялся / Not defined

5 PECAM1 (NM_000442.4)

6 VWF (NM_000552.4) 0,984 100,252

7 KDR (NM_002253.3) 0,996 90,771

8 FAPA (NM_004460.4) Не определялся / Not defined

9 ACTA2 (NM_001613.3) 0,985 105,302

10 SMTN (NM_006932.4) 0,984 77,365

11 VIM (NM_003380.4) 0,99 100,471

12 MMP2 (NM_004530.5) 0,993 86,453

13 SNAI1 (NM_005985.3) 0,983 98,667

14 SNAI2 (NM_003068.4) 0,986 71,914

15 TWIST1 (NM_000474.3) 0,996 72,988

16 ZEB1 (NM_030751.5) 0,992 109,365

17 SCARF1 (NM_003693.3) 0,982 103,976

18 CD36 (NM_000072.3) 1 76,687

19 LDLR (NM_000527.4) 0,992 92,278

20 VLDLR (NM_003383.4) 0,992 96,219

21 VCAM1 (NM_001078.3) 0,969 68,283

22 ICAM1 (NM_000201.2) 0,994 94,976

23 SELE (NM_000450.2) 0,982 104,156

24 SELP (NM_003005.3) 0,992 80,727

25 CDH5 (NM_001795.4) 0,984 104,342

26 IL1R1 (NM_000877.3) 0,998 101,936

27 IL1R2 (NM_004633.3) Не определялся / Not defined

28 TNFRSF1A (NM_001065.3) 0,99 106,732

29 TNFRSF1B (NM_001066.2) 0,984 106,798

30 NOS3 (NM_000603.4) 0,985 85,156

31 PXDN (NM_012293.2) 0,988 94,574

VI

И

HH

О

&

H

in -J

< z

HH

о

HH

Pi

о

18 Параметры праймеров и результат кПЦР

Также, по данным мировой литературы, оптимальный диапазон размера ампликона колеблется от 100 до 200 нуклеотидов [10, 14]. В данном эксперименте длина одного из ампликонов составила 422 нуклеотида (по причине невозможности конструирования специфического праймера для ампликона меньшей длины), однако показатели R2 и E были удовлетворительными и составили 0,984 и 85,1 соответственно.

При конструировании праймеров стоит уделять должное внимание их проверке с помощью стандартных программ, таких как Beacon

Designer, PCR Primer Stats и Multiple Sequence Analyzer. Данные программы позволяют оценить качество праймеров, в частности вероятность образования шпилек и димеров; определить оптимальную температуру плавления; проверить длину праймеров и ампликона, отсутствие отклонения от рекомендуемого процентного содержания GC. В некоторых случаях при дизайне праймеров отсутствие димеров и шпилек имеет более важное значение в сравнении с такими параметрами, как содержание GC и рекомендуемая длина прай-мера или ампликона.

Таблица 3. Результаты, полученные во время кПЦР-анализа второго массива данных (экспозиция первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека бионами в течение 24 ч)

Table 3. Results of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in the second sample (exposure of primary human coronary artery endothelial cells to bions for 24 hours)

Ген и идентификационный номер Коэффициент детерминации Эффжтивность / № последовательности мРНК по базе данных RefSeq / (R2) / jffi • Gene and RefSeq mRNA sequence number Coefficient of determination (R2) ^

1 IL1B (NM_000576.2) 0,997 107,422

2 IL6 (NM_000600.4) 0,992 97,406

3 CXCL8 (NM_000584.3) 0,931 72,297

4 IL23A (NM_016584.2) 0,989 89,617

5 PECAM1 (NM_000442.4) 0,987 85,56

6 VWF (NM_000552.4) 0,996 107,88

7 KDR (NM_002253.3) 0,98 90,308

8 FAPA (NM_004460.4) 0,978 107,368

9 ACTA2 (NM_001613.3) 0,988 107,327

10 SMTN (NM_006932.4) 0,999 96,724

11 VIM (NM_003380.4) 0,989 88,249

12 MMP2 (NM_004530.5) 0,986 84,465

13 SNAI1 (NM_005985.3) 0,993 84,599

14 SNAI2 (NM_003068.4) 0,983 87,981

15 TWIST1 (NM_000474.3) 0,996 68,188

16 ZEB1 (NM_030751.5) 0,933 85,857

17 SCARF1 (NM_003693.3) 0,997 97,848

18 CD36 (NM_000072.3) 0,992 88,779

19 LDLR (NM_000527.4) 0,991 97,402

20 VLDLR (NM_003383.4) 0,99 69,926

21 VCAM1 (NM_001078.3) 0,967 76,482

22 ICAM1 (NM_000201.2) 0,993 107,375

23 SELE (NM_000450.2) 0,99 95,994

24 SELP (NM_003005.3) 0,989 94,008

25 CDH5 (NM_001795.4) 0,996 91,622

26 IL1R1 (NM_000877.3) 0,988 98,004

27 IL1R2 (NM_004633.3) 0,988 79,115

28 TNFRSF1A (NM_001065.3) 0,995 87,9

29 TNFRSF1B (NM_001066.2) 0,97 96,901

30 NOS3 (NM_000603.4) 0,992 90,406

31 PXDN (NM_012293.2) 0,987 91,478

Заключение

При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Конфликт интересов

Л.А. Богданов заявляет об отсутствии конфликта интересов. Д.К. Шишкова заявляет об отсутствии конфликта интересов. М.Ю. Синицкий заявляет об отсутствии конфликта интересов. А.Г. Кутихин заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Информация об авторах

Богданов Лев Александрович, младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0003-4124-2316

Шишкова Дарья Кирилловна, младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCГО 0000-0002-1518-3888

Синицкий Максим Юрьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCID 0000-0002-4824-2418

Кутихин Антон Геннадьевич, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация; ORCID 0000-0001-8679-4857

Л.А. Богданов и др. 19

Финансирование

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Author Information Form

Bogdanov Leo A., junior researcher at the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0003-4124-2316

Shishkova Daria K., junior researcher at the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-1518-3888

Sinitsky Maxim Yu., PhD, senior researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0002-4824-2418

Kutikhin Anton G., MD, PhD, Head of the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation; ORCID 0000-0001-8679-4857

Вклад авторов в статью

БЛА - вклад в дизайн исследования, написание статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

ШДК - получение данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

СМЮ - получение данных исследования, корректировка статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

КАГ - вклад в дизайн исследования, написание статьи, утверждение окончательной версии для публикации, полная ответственность за содержание

Author Contribution Statement

BLA - contribution to the design of the study, manuscript writing, approval of the final version, fully responsible for the content

ShDK - data collection, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

SMYu - data collection, editing, approval of the final version, fully responsible for the content

KAG - contribution to the design of the study, manuscript writing, approval of the final version, fully responsible for the content

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Chuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541-1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8

2. SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007;

402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1

3. Valones M.A., Guimaraes R.L., Brandao L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1-11

и w 3 s Я ffi

_Q

êSm

< S

я W

is

g и

о s

20 Primer parameters and qPCR results

4. Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y., Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5

5. Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0

6. Liu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-z

7. Meienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359-62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.

8. Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.

9. Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19-28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001

10. Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18

11. Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods

Mol. Biol. 1998; 98:121-154. doi: 10,1385 / 0-89603-443-7: 121

12. Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017; 6 (1): 92-101.

13. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3

14. Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461

15. Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518

16. Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277

17. Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292-297. doi: 10.1016/j.forsciint.2012.10.003

18. D'haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18-24.

REFERENCES

1. Chuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541-1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8

2. SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007; 402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1

3. Valones M.A., Guimaraes R.L., Brandao L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1-11

4. Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y, Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5

5. Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0

6. Liu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-z

7. Meienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359-62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.

8. Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.

9. Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19-28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001

10. Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18

11. Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods Mol. Biol. 1998; 98:121-154. doi: 10,1385 / 0-89603-443-7: 121

12. Kutikhin A.G., Sinitsky M.Y., Ponasenko A.V. The role of mutagenesis in atherosclerosis. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2017; 6 (1): 92-101. (In Russian)

13. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3

14. Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461

15. Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518

16. Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277

17. Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292-297. doi: 10.1016/j.forscünt2012.10.003

18. D'haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18-24.

Для цитирования: Л.А. Богданов, Д.К. Шишкова, М.Ю. Синицкий, А.Г. Кутихин. Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020; 9 (3): 13-20. DOI: 10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20 To cite: L.A. Bogdanov, D.K. Shishkova, M.Yu. Sinitsky, A.G. Kutihin. Primer parameters defining efficiency and coefficient of determination in quantitative polymerase chain reaction. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2020; 9 (3): 13-20. DOI: 10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20