CC BY
14
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Курочкин Д.В.1, Маслюкова И.Е.1, Субботина Т.Н.12, Хазиева А.С.3, Васильев Е.В.3, Михалёв М.А.4, Дунаева Е.А.5, Миронов К.О.5
«РИНИНГ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ JAK2 И CALR МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ
1Сибирский федеральный университет, 660041, Красноярск, Россия;
2Федеральный Сибирский научно-клинический центр ФМБА России, 660037, Красноярск, Россия; 3КГБУЗ «Краевая клиническая больница», 660022, Красноярск, Россия; 4КГБУЗ «Городская клиническая больница №7», 660003, Красноярск, Россия;
5ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, Москва, Россия
Ассоциированные с онкологическими заболеваниями, в том числе с Ph-миелопролиферативными новообразованиями (Ph-МПН), соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки. Поэтому, на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур желательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых тестов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций. В ряде работ для анализа Ph-МПН-ассоциированных мутаций в генах JAK2 и CALR предлагается анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ, high resolution melting), который имеет высокую чувствительность и подходит для скрининга всех типов мутаций. В большинстве просмотренных нами литературных источниках авторы для анализа соматических мутаций используют амплификаторы «LightCycler» (Roche) и гораздо реже амплификатор «CFX96» (Bio-Rad), который в свою очередь чаще представлен в Российских научно-практических и медицинских организациях.
Цель работы - скрининг соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM-анализа при использовании ампли-фикатора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США) для пациентов с диагнозом Ph-МПН. В настоящем исследовании HRM-анализ проводился на образцах ДНК от пациентов с мутациями в гене JAK2 или в гене CALR. Программа «Precision Melt Analysis» выявила все варианты анализируемых мутаций, как однонуклеотидной замены в гене JAK2 (с уровнем аллельной нагрузки в диапазоне 5-40%), так и разнообразных indel мутаций в гене CALR (с уровнем аллельной нагрузки в диапазоне 40-50%).
Таким образом, HRM-анализ, выполненный на приборе «CFX96» позволяет проводить скрининг высокоспецифичных для диагноза Ph-МПН мутаций в 14 экзоне гена JAK2 и в 9 экзоне гена CALR. Включение данного скринингового исследования в алгоритм лабораторного тестирования позволяет повысить эффективность и доступность молекулярно-генетиче-ских технологий при диагностике Ph-МПН.
Ключевые слова: JAK2; CALR; Ph-миелопролиферативные новообразования; анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM high resolution melting); пиросеквенирование.
Для цитирования: Курочкин Д.В., МаслюковаИ.Е., Субботина Т.Н., ХазиеваА.С., Васильев Е.В., МихалёвМ.А., ДунаеваЕ.А., Миронов К.О. Скрининг соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом анализа кривых плавления с высоким разрешением. Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66 (5): 315-320. DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-5-315-320
KurochkinD.V.', MaslyukovaI.E.1, Subbotina T.N.1-2, KhazievaA.S.3, VasilievE.V.3, MikhalevM.A.4, DunaevaE.A.5, Mironov K.O.5
SCREENING OF SOMATIC MUTATIONS IN THE JAK2 AND CALR GENES BY HIGH-RESOLUTION MELTING CURVE ANALYSIS
Siberian Federal University, 660041, Krasnoyarsk, Russia;
2 The Federal Siberian Research Clinical Center under FMBA of Russia, 660037, Krasnoyarsk, Russia; 3Regional Clinical Hospital, 660022, Krasnoyarsk, Russia; 4City Clinical Hospital No. 7, 660003, Krasnoyarsk, Russia;
5Central Research Institute of Epidemiology Rospotrebnadzor, 111123, Moscow, Russia
Somatic mutations associated with oncological diseases, including Ph-myeloproliferative neoplasms (Ph-MPN), are very diverse, occur with different frequencies and different allelic burden levels. Therefore, at the initial stage of performing molecular-genetic diagnostic procedures, it is desirable to be able to conduct screening tests in the laboratory. This is especially important when analyzing rare and diverse mutations. Analysis of high resolution melting curves (HRM analysis), which has high sensitivity and is suitable for screening all types of mutations, in a number of studies is proposed for the analysis of Ph-MPN associated mutations in the JAK2 and CALR genes. For analysis ofsomatic mutations in the majority of literature sources that we reviewed, the authors use the LightCycler (Roche) thermocycler and much rarely the CFX96 (Bio-Rad), which is often presented in Russian scientific and practical and medical organizations.
Для корреспонденции: Субботина Татьяна Николаевна, канд.биол.наук, доц. каф. медицинской биологии СФУ, науч. сотр. ФСНКЦ ФМБА; е-mail: stn.25@mail.ru
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
The aim of the study was to .screen the .somatic JAK2 and CALR mutations by HRM analysis using the CFX96 thermocycler and the Precision Melt Analysis software (Bio-Rad, USA) for patients with Ph-MPN. In the present research, HRM analysis was conducted on the DNA samples from patients with mutations in the JAK2 or in the CALR gene. The Precision Melt Analysis software identified all variants of the analyzed mutations, both a single nucleotide substitution in the JAK2 gene (with allelic burden level in the range of 5-40%), and various indel mutations in the CALR gene (with allelic burden level in the range of40-50%) Therefore, the HRM analysis that was conducted on the CFX96 allows screening of highly specific mutation for the diagnosis of Ph-MPN in the exon 14 of the JAK2 gene and in the exon 9 of the CALR gene. The inclusion of this screening research in the laboratory testing algorithm improves the efficiency and accessibility of molecular genetic technologies in the diagnosis of Ph-MPN.
Key words: JAK2; CALR; Ph-myeloproliferative neoplasms; high-resolution melt curve analysis; pyrosequencing. For citation: Kurochkin D.V., Maslyukova I.E., Subbotina T.N., Khazieva A.S., Vasiliev E.V., Mikhalev M.A., Dunaeva E.A., Mironov K.O. Screening of somatic mutations in the JAK2 and CALR genes by high-resolution melting curve analysis. Klini-cheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66 (5): 315-320 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-5-315-320
For correspondence: Subbotina T.N., Ph. Sci. Biol., Associate Professor at the Department of Medical Biology SFU, Research Officer of FSFI FSRCC FMBA of Russia; e-mail: stn.25@mail.ru
Information about authors:
Subbotina T.N.: http://orcid.org/0000-0001-7790-5033; Kurochkin D.V.: http://orcid.org/0000-0003-1063-7702; Maslyukova I.E.: http://orcid.org/0000-0003-1323-2612; Khazieva A.S.: http://orcid.org/0000-0001-7525-6981; Vasiliev E.V.: http://orcid.org/ 0000-0003-3780-3758; Mikhalev M.A.: http://orcid.org/0000-0003-3769-3405; Dunaeva E.A.: http://orcid.org/0000-0002-4477-8506; Mironov K.O.: http://orcid.org/0000-0001-8207-9215. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 19.01.2021 Accepted 02.02.2021
Введение. Р^миелопролиферативные новообразования (Р^МПН) относят к клональным заболеваниям, характеризующимся аномальной пролиферацией одной или нескольких клеточных линий миелопоэза в костном мозге [1]. Соматические мутации в генах JAK2 и СЛЬЯ являются драйверными и выявляются практически у 90% больных с Р^МПН. Встречаемость мутации V617F в гене JAK2 среди пациентов с истинной полицитемией составляет 95%, с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) - 50-70%, с миелофиброзом (Мф) - 40-75%, распространенность мутаций в гене СЛЬЯ среди пациентов с МФ и ЭТ составляет 20-30% [2-4]. В соответствии с последними клиническими рекомендациями ВОЗ наличие указанных мутаций является одним из основных диагностических критериев при диагностике Р^МПН [5,6].
Продуктом экспрессии гена JAK2 является Янус-ки-наза 2 - тирозинкиназа, участвующая в JAK-STAT сигнальном пути, ответственном за пролиферацию клеток. В норме, в отсутствии цитокинового лиганда, псевдоки-назный домен фермента ингибирует активность киназ-ного домена. Однонуклеотидная соматическая замена G на Т в 1849 позиции 14 экзона в гене JAK2 приводит к нарушению аутоингибирования, что, в свою очередь, вызывает цитокин-независимую активацию самого JAK-STAT пути и, как следствие, активную пролиферацию клеток [7].
Многофункциональный белок кальретикулин выступает в роли транспортера ионов кальция внутрь клетки, поддерживая, таким образом, внутриклеточный гомео-стаз кальция, принимает участие в механизмах адгезии и апоптоза клеток, а также в передаче клеточного сигнала через JAK-STAT путь. В 2013 году две исследовательские группы одновременно обнаружили и описали наличие различных вариантов соматических мутаций в
гене CALR у JAK2- и MPL-негативных пациентов с ЭТ и МФ [8, 9]. Все обнаруженные варианты генетических перестроек представлены инсерциями и делециями в 9 экзоне гена, кодирующего кальретикулин. На протяжении всего 9 экзона выявлено более 50 разных мутаций, среди которых выделяют 2 основных типа [3]. При 1 типе происходит делеция 52 нуклеотидов, при 2 типе происходит инсерция 5 нуклеотидов. Встречаемость этих двух мутаций составляет 88% от всех мутаций в гене CALR.
В настоящее время для выявления соматических мутаций, используется большое количество разнообразных молекулярно-генетических методов. Среди наиболее распространенных можно отметить следующие: полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP) [10], высокопроизводительное секвениро-вание (NGS) [11], секвенирование по Сэнгеру (Sanger sequencing) [11], фрагментный анализ (fragment analysis) [12], аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR) [10] и анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ, high resolution melting) [13]. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки при выявлении соматических мутаций. Например, аллель-специфическая ПЦР, имеет ограниченные возможности в тех случаях, когда более одной мутации располагаются на исследуемом участке гена. Секвенирование по Сэнгеру и фрагментный анализ имеют ограниченную чувствительность в диапазоне 10-25% и 5-10%, соответственно [11]. Технология NGS обеспечивает наименьший порог обнаружения (1-1.5%), но все еще остается дорогостоящей и длительной процедурой [12].
Поскольку ассоциированные с онкологическими заболеваниями, соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем
аллельной нагрузки, то в начале проведения молеку-лярно-генетических диагностических процедур в лаборатории желательно иметь возможность проведения скрининговых исследований. HRM-анализ подходит для обнаружения всех типов мутаций на небольшом фрагменте ДНК, метод обладает высокой чувствительностью (от 2.5% мутантного аллеля), а также не требует больших временных затрат [13]. Подавляющее большинство исследований по поиску мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM проводились на амплификаторах линейки «LightCycler» (Roche) и прилагающейся к нему программе [14-16]. Публикаций об использовании «CFX96» (Bio-Rad) для обнаружения мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM значительно меньше [17].
Цель работы - скрининг соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM-анализа при использовании амплификатора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США) для пациентов с диагнозом Ph-МПН.
Материал и методы. Работа выполнена на базе научно-практической лаборатории молекулярно-генети-ческих методов исследований ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет» (Красноярск). Для проведения скринингового исследования соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM-анализа использовались образцы ДНК от 10 пациентов с диагнозом Ph-МПН и ранее выявленными методами пиросеквени-рования и ПЦР-РВ мутациями V617F (пациенты .№1-5) и с различными мутациями в гене CALR (пациенты J№6-10). [18, 19]. В качестве контролей использовали два образца ДНК без мутаций в анализируемых участках генов JAK2 и CALR. Отсутствие каких-либо мутаций и полиморфизмов в исследуемых областях было подтверждено секве-нированием по методу Сэнгера.
ДНК была выделена из лейкоцитов венозной крови с помощью набора реагентов «ДНК-Сорб-В» (Ампли-Сенс, Россия). HRM-анализ проводили с использованием набора реагентов «Precision Melt Supermix» в присутствии красителя Eva Green dye (Bio-Rad, США). Прай-меры для HRM-анализа были заимствованы из статей и представлены в табл. 1.
Количество реагентов, вносимых в одну пробу (общий объем - 10 мкл), составляло: Precision Melt
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Supermix - 5 мкл; праймеры forward, reverse - по 0.5 мкл (с начальной концентрацией 2 мкМ каждого); образец ДНК - 4 мкл (5 нг/мкл). ПЦР с дополнительным этапом плавления высокого разрешения проводилась на приборе «CFX96» (Bio-Rad, США) по следующей программе: денатурация при 95°С в течение 2 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 10 с, 57°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. Программа плавления с высоким разрешением включала денатурацию при 95°С в течение 30 с, ренатурацию при 60°С в течение 1 мин и плавление при температуре от 65° С до 95°С с градиентом 0.2°С в 10 с.
Результаты и обсуждение. Анализ падения уровня флуоресценции с повышением температуры на этапе плавления проводился с использованием программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США). Для облегчения визуальной идентификации кластеров программа генерирует так называемые «кривые различия» (они же дифференциальные графики) каждого анализируемого образца. Кривые указывают на различия флуоресценции между каждым исследуемым образцом и кластером референсных кривых, полученных от контрольных образцов без мутаций. Помимо этого, сигналы флуоресценции нормализуются до относительных значений 1 и 0, что способствует устранению различий фоновой флуоресценции и повышению способности детектирования незначительных профилей плавления.
Для анализа мутации JAK2 V617F были отобраны образцы ДНК от 5 пациентов (№1-5) с диагнозом Ph-МПН и ранее выявленной методами пиросеквенирования [21] и ПЦР-РВ соответствующей мутацией. Уровень аллельной нагрузки находился в диапазоне 5-40% (табл. 2).
Результаты анализа образцов с мутацией V617F в гене JAK2 после обработки в программе «Precision Melt Analysis» представлены на рис. 1.
Представленные на рис.1 кривые плавления продуктов амплификации образцов ДНК, полученных от пациентов с V617F мутацией, четко делятся на пять кластеров относительно образцов без мутаций. При этом можно отметить, что чем выше уровень аллельной нагрузки в исследуемом образце ДНК, тем более выражено отклонение дифференциального графика от кривых, соответствующих образцам без мутации. Дифференциальный
Таблица 1
Праймеры для амплификации участков генов JAK2 и CALR
npaHMep Последовательность (5'-3') Размер фрагмента Источник
JAK2 forward primer JAK2 reverse primer TTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGA CTGACACCTAGCTGTGATCC 179 bp [14]
CALR forward primer GGCAAGGCCCTGAGGTGT 265 bp [20]
CALR reverse primer GGCCTCAGTCCAGCCCTG
Таблица 2
Уровень аллельной нагрузки мутацией V617F в гене 1ЛК2, определенный методами пиросеквенирования и ПЦР-РВ
для 5 пациентов с Ph-МПН
№ пациента
Уровень аллельной нагрузки, % (пиросеквенирование)
Уровень аллельной нагрузки, %
(ПЦР-РВ)
7 20 20 22 40
5
15 20 28 35
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
Рис.1. Дифференциальные графики плавления фрагмента гена JЛK2. К - кластер, включающий дифференциальные графики, полученные при анализе контрольных образцов ДНК (без мутации); № 1-5 - дифференциальные графики (в данном случае они же отдельные кластеры) от образцов ДНК с мутацией V617F и разным уровнем аллельной нагрузки. ОЕФ - относительные единицы флуоресценции.
Рис. 2. Дифференциальные графики плавления фрагмента гена CALR. К - кластер, полученный при анализе контрольных образцов ДНК (без мутации); №6-10 - дифференциальные графики от образцов ДНК с CALR мутациями. ОЕФ - относительные единицы флуоресценции.
Таблица 3
Типы мутаций и уровень аллельной нагрузки CALR мутаций определенный методом пиросеквенирования
для 5 пациентов с диагнозом Ph-МПН.
№ пациента | Тип CALR мутации Уровень аллельной нагрузки, % (пиросеквенирование)
6 с.1128 1129insCTTTGCTT 40
c.1131 1133delAGA
7 c.1092_1143del (52) 48
8 c.1092_1143del (52) 50
9 c.1154 1155insTTGTC 46
10 c.1092_1143del (52) 45
график от образца №1 с наименьшим уровнем аллель-ной нагрузки имеет наименьшее отклонение, а график, полученный при анализе образца №5 - максимальное.
Для скрининга мутаций в гене CALR использовали образцы ДНК от других 5 пациентов с диагнозом Ph-МПН (№6-10) и ранее выявленными методом пиросек-венирования разными типами мутаций в гене CALR. Уровень аллельной нагрузки находился в диапазоне 4050% (табл. 3).
Результаты анализа образцов с CALR мутациями после обработки в программе «Precision Melt Analysis» представлены на рис. 2.
Согласно рис. 2, все кривые плавления продуктов амплификации образцов ДНК, полученные от пациен-
тов с CЛLR мутациями четко делятся на два кластера относительно образцов без мутаций. В первый кластер программа отнесла 2 образца, это образец №9 с классической мутацией типа 2 (инсерция 5 нуклеотидов), а также образец №6 с сочетанной мутацией (инсерция 8 и делеция 3 нуклеотидов). Во второй кластер программа отнесла образцы №7, №8 и №10, имеющие мутацию типа 1 - делецию 52 нуклеотидов.
Ассоциированные с онкологическими заболеваниями, в том числе с Р^МПН, соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки. Поэтому, на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур по выявлению мутаций, же-
лательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых методов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций, например, таких как мутации в гене CALR. HRM-анализ позиционируется как быстрый, надежный и высокочувствительный метод для скрининга как однонуклеотид-ных замен, так и инсерций и делеций. Кроме того, он не требует больших временных затрат. В настоящее время для скрининга мутаций в гене CALR в нашей лаборатории проводится гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ, который по сравнению с HRM-методом более трудоемок и длителен по времени [22, 23]. Для анализа мутации V617F в гене JAK2 кроме коммерческих наборов, позволяющих проводить анализ в количественном формате, также желательно иметь в арсенале предварительный скрининговый тест.
В соответствии с общими правилами для проведения HRM-анализа, точность результатов может варьировать в зависимости от конкретной исследуемой последовательности [24]. Для амплификации рекомендуется выбирать участок ДНК размером 50-200 пар оснований, так как с увеличением длины ампликона точность анализа падает [25]. По этой причине для анализа однону-клеотидных замен предпочтительнее выбирать прайме-ры, фланкирующие небольшой фрагмент ДНК. Так, для амплификации участка гена JAK2 с целью анализа мутации V617F в данной работе были использованы прай-меры, ограничивающие участок ДНК длиной 179 пар оснований, что входит в рекомендуемый диапазон. Для амплификации участка гена CALR были использованы праймеры, фланкирующие участок ДНК длиной 265 пар оснований, что превышает рекомендуемый диапазон, но полученный ампликон позволяет провести анализ всех возможных (известных из литературных источников) мутаций в 9 экзоне гена CALR.
В результате проведенной нами работы по скринингу соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM с использованием амплификатора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» были выявлены все варианты анализируемых мутаций, как одно-нуклеотидной замены в гене JAK2 (с уровнем аллель-ной нагрузки в диапазоне 5-40%), так и разнообразных инсерций и делеций мутаций в гене CALR (с уровнем аллельной нагрузки в диапазоне 40-50%). По результатам анализа мутации в гене JAK2 можно отметить, что даже образец с минимальным из исследуемых образцов уровнем аллельной нагрузки в 5% был выявлен программой и дифференцирован в отдельный кластер по сравнению с кластером образцов дикого типа и кластерами образцов с JAK2 V617F мутацией и отличными вариантами уровней аллельной нагрузки. При анализе CALR мутаций используемый подход позволил дифференцировать мутации таким образом, что в одном кластере оказались три образца (№7, №8, №10) с делецией 52 нуклеотидов, в другом кластере - два образца (№6 и №9) с разными мутациями. При этом образец №9 имеет классическую мутациию 2 типа - инсерцию 5 нуклео-тидов (c.1154_1155insTTGTC), а образец №6 - соче-танную мутацию, при которой происходит инсерция 8 и делеция 3 нуклеотидов (с.1128_1129^СТТТОСТТ; c.1131_1133delAGA). Объединение образцов №9 и №6 в единый кластер, вероятно, обусловлено тем, что суммарное количество встроенных пуриновых и пири-мидиновых нуклеотидов в обоих случаях одинаково (3 пуриновых и 2 пиримидиновых), соответственно GC со-
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
став ампликонов не меняется, что объясняет их сходные свойства плавления [11]. Этот случай подтверждает, что любая мутация, выявленная при использовании скри-нингового теста, обязательно должна быть идентифицирована и подтверждена с помощью секвенирования.
Таким образом, HRM-анализ, выполненный на приборе «CFX96», позволяет проводить скрининг высокоспецифичных для диагноза Ph-МПН мутаций в 14 экзоне гена JAK2 и в 9 экзоне гена CALR.
Заключение. В настоящем исследовании показана возможность использования HRM-анализа, выполняемого на приборе «CFX96» для выявления мутации V617F в 14 экзоне гена JAK2 и различных вариантов мутаций в 9 экзоне гена CALR. Включение данного подхода в качестве скринингового теста в алгоритм лабораторного тестирования позволяет повысить эффективность и доступность молекулярно-генетических технологий диагностики Ph-МПН. Но результаты HRM-анализа, как и других скрининговых тестов, должны быть обязательно подтверждены с помощью других молекулярно-гене-тических методов, основанных на секвенировании.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп.2-5, 7-17, 19-21 см . REFERENCES)
1. Меликян А.Л., Суборцева И.Н. Биология миелопролифератив-ных новообразований. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2016; 9(3): 314-25.
6. Меликян А.Л., Ковригина А.М., Суборцева И.Н., Шуваев В. А., Афанасьев Б. В., Агееваи Т. А. и др. Национальные клинические рекомендации но диагностике и терании Ph-негативных миело-пролиферативных заболеваний (истинная нолицитемия, эссен-циальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз) (редакция 2018 г.). Гематология и трансфузиология. 2018; 63(3): 275-315. 18. Дунаева Б.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П. Субботина Т. Н., Башмакова E.E., Ольховский И.А. и др. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквени-рования. Клиническая лабораторная диагностика; 2014; 59(11): 60-3.
22. Миронов К. О., Дунаева E. А., Дрибноходова О. П., Шипулин Г. А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016; 5: 33-43.
23. Субботина Т.Н., Харсекина А.Б., Дунаева Б.А., Миронов К.О., Васильев Б.В., Михалёв М.А. и др. Использование гетероду-плексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба. 2017; 6(1): 29-33. DOI: 10.17116/labs20176129-33.
REFERENCES
1. Melikyan A.L., Subortseva I.N. Biology of Myeloproliferative Malignancies. Clinical Onkogematologiya. Fundamental'nye issledo-vaniya ipraktika. 2016; 9(3): 314-25. (in Russian)
2. Campbell P.J., Scott L.M., Buck G., Wheatley K., Eastetal C.L., Marsden J.T. et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: aprospective study. Lancet. 2005; 366(9501): 1945-53. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)67785-9.
3. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S., Nivarthi H., Ru-mi E., Milosevic J.D. et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferatie neoplasms. The new England journal of medicine. 2013; 369(25): 2379-89. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
4. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C. et.al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms with Nonmutated JAK2. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2391-2405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542.
5. Barbui T., Thiele J., Gisslinger H., Kvasnicka H.M., Vannucchi A.M., Guglielmelli P. et al. The 2016 WHO classification and diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms: document summary and in-depth discussion. Blood Cancer J. 2018; 8(2): 15. DOI: 10.1038/s41408-018-0054-y.
6. Melikyan A.L., Kovrigina A.M., Subortseva I.N., Shuvaev V. A., Afanasiev B. V., Ageeva T. A. et al. National clinical recommendations for diagnosis and therapy of Ph-negative myeloproliferative neoplasms (polycythemia vera, essential thrombocythemia, primary myelofibrosis) (ed. 2018). Gematologiya i transfuziologia. 2018; 63(3): 275-315. (in Russian)
7. Levine R.L., Wadleigh M., Coolsetal J., Ebert B.L., Wernig G., Huntly B.J. et al. Activating mutation in the tyrosinekinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005; 7(4): 387-97.
8. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J., Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C. et.al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. American Journal of Hematology. 2014; 89(8): 2392-2405.
9. Merlinsky T.R., Levine R.L., Pronier E. Unfolding the Role of Calreticulin in Myeloproliferative Neoplasm Pathogenesis. Clinical Cancer Research. 2018; 18: 3777. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-3777.
10. Didone A, Nardinelli L, Marchiani M, Ruiz A., de Lima Costa A. L., Lima I.S. et al. Comparative study of different methodologies to detect the JAK2 V617F mutation in chronic BCR-ABL1 negative myeloproliferative neoplasms. Pract. Lab. Med. 2015; 4: 30-7. DOI: 10.1016/j.plabm.2015.12.004.
11. Jones A.V., Ward D., Lyon M., Leung W., Callaway A., Chase A. et al. Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms. LeukRes. 2015; 39(1): 82-7. DOI: 10.1016/j. leukres.2014.11.019.
12. Luo W, Zhongxin Yu Z. Calreticulin (CALR) mutation in myeloproliferative neoplasms (MPNs). Stem. Cell Investig. 2015; 2(16). DOI: 10.3978/j.issn.2306-9759.2015.08.01.
13. Ono A. Okuhashi Y., Takahashi Y., Takahashi Y., Itoh M., Nara N., Tohda S. Advantages of the quenching probe method over other PCR-based methods for detection of the JAK2 V617F mutation. Oncol Lett. 2012; 4(2): 205-8. DOI: 10.3892/ol.2012.741.
14. Rapado I., Grande S., Albizua E., Ayala R., Hernández J.A., Gallardo M. et al. High resolution melting analysis for JAK2 Exon 14 and Exon 12 mutations: a diagnostic tool for myeloproliferative neoplasms. J. Mol. Diagn. 2009; 11(2): 155-61. DOI: 10.2353/ jmoldx.2009.080110.
15. Moradabadi A., Farsinejad A., Khansarinejad B., Fatemi A. Development of a high resolution melting analysis assay for rapid identification of JAK2 V617F missense mutation and its validation. Exp. Hematol. Oncol. 2019; 8(10). DOI: 10.1186/s40164-019-0134-0.
16. Bilbao-Sieyro C., Santana G., Moreno M., Torres L., Santana-Lopez G., Rodriguez-Medina C. et al. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations. PLoS One. 2014; 9(7): e103511. DOI: 10.1371/journal.pone.0103511.
17. Lim K., Lin H., Chen C., Wang W., Chang Y., Chiang Y. et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. International journal of clinical chemistry. 2015; 440: 133-9. DOI: 10.1016/j.cca.2014.11.011.
18. Dunaeva E.A., Mironov K.O., Dribnokhodova T.E. Subbotina T.N., Bashmakova E.E, Olhovskii A. et al. The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique. Klinicheskaya LaboratornayaDiagnostika. 2014; 59(11): 60-3. (in Russian)
19. Larsen T.S., Christensen J.H., Hasselbalch H.C. Pallisgaard N. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymPhocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. Br. J. Haematol. 2007; 136(5): 745-51. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2007.06497.x.
20. Rozovski U., Verstovsek S., Manshouri T., Dembitz V., Bozinovic K., Newberry K., et al. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis. Haematologica. 2017; 102(1): 79-84. DOI: 10.3324/haematol.2016.149765.
21. Subbotina T., Karnyushka A., Dunaeva E., Mironov K., Vasiyliev E., Mikhalev M. et al. Application of heteroduplex analysis for CARL mutation detection.HemaSphere. 2019; 3(S1): 1002-3.
22. Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P., Shipulin G.A. Opytispol'zovaniya sistem geneticheskogo analiza na osnove tekhnologii pirosekvenirovaniya. Spravochnik zaveduyushchego KDL. 2016;(5): 33-43. (in Russian)
23. Subbotina T.N., Kharsekina A.E., Dunaeva E.A., Mironov K.O., Vasiyliev E.V., Mikhalev M.A. et al. Heteroduplex analysis and pyrosequencing in the diagnostic algorithm of polycythemia vera associated with JAK2 exon 12 mutations. Laboratornaya sluzhba. 2017; 6(1): 29-33. DOI: 10.17116/labs20176129-33. (in Russian)
24. Precision Melt Analysis™ Software Instruction Manual, Available at: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/litera-ture/10000080911.pdf (accessed 27 January 2020).
25. Sean T., Scott R., Kurtz R., Fisher C., Patel. V., Bizouam F. A Practical Guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Bio-Rad Laboratories, Available at: https://www.helicon.ru/news/hrm_analiz_vse_o_ metode_v_udobnoy_metodichke/ (accessed 26 January 2020).
Поступила 19.01.21 Принята к печати 02.02.21
