ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ MINOR VARIANT FINDER ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АЛЛЕЛЬНОЙ НАГРУЗКИ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ПРИ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Использование программного обеспечения Minor Variant : Finder для выявления и количественного определения f уровня аллельной нагрузки соматических мутаций при онкогематологических заболеваниях

Т.Н. Субботина1, 2, И.Е. маслюкова1, А.А. Фалеева1, 2, П.А. Николаева1, 2, А.С. Хазиева3, Е.А. дунаева4, к.О. миронов4, л.Б. Полушкина5, И.С. мартынкевич5, С.В. Верещагина2, Б.В. Баранкин2

ФГАОУВО «Сибирский федеральный университет»; Россия, 660041 Красноярск, Свободный проспект, 79; 2ФГБУ«Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России»;

Россия, 660037Красноярск, ул. Коломенская, 26; 3КГБУЗ «Краевая клиническая больница»; Россия, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а; 4ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора; Россия, 111123 Москва, ул. Новогиреевская, 3а; 5ФГБУ«Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России»; Россия, 191024 Санкт-Петербург, ул. 2-Советская, 16

Контакты: Татьяна Николаевна Субботина stn.25@mail.ru

Введение. Известно, что при использовании секвенирования по Сэнгеру для анализа соматических мутаций возникают проблемы, связанные как с количественной оценкой уровня аллельной нагрузки мутантного гена, так и с интерпретацией результатов в образцах ДНК с уровнем аллельной нагрузки менее 15—20 %. Компанией Applied Biosystems (США) было разработано новое программное обеспечение Minor Variant Finder, позволяющее определять мутации с уровнем аллельной нагрузки от 5 %. Цель исследования — определение уровня аллельной нагрузки и выявление малопроцентных вариантов соматических мутаций в генах ASXL1, JAK2 и в онкогене BCR-ABL с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder у пациентов с миелопроли-феративными новообразованиями.

Материалы и методы. После анализа точечных соматических мутаций в генах ASXL1, JAK2 и онкогене BCR-ABL для 15 пациентов с миелопролиферативными новообразованиями (5ASXL1-положительных, 9 JAK2-положительных и 1 BCR-ABL-положи-тельный) была проведена оценка уровня аллельной нагрузки выявленных мутаций с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder. Использовали биологические образцы с ранее выявленными мутациями. В частности, мутации в гене ASXL1 и в онкогене BCR-ABL выявлены с помощью секвенирования по Сэнгеру, а мутации в гене JAK2 — более чувствительными методами: пиросеквенированием и полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени.

Результаты. При использовании программного обеспечения Minor Variant Finder уровень аллельной нагрузки во всех 5 ASXL1-m-ложительных образцах и BCR-ABL-положительном образце был определен как выше 20 %. При анализе 9 JAK2-положительных образцов уровень аллельной нагрузки в 2 случаях был выше 20 % и в 7случаях ниже 20 %.

Заключениие. Программное обеспечение Minor Variant Finder может быть использовано для оценки уровня аллельной нагрузки и выявления малопроцентных вариантов соматических мутаций в генах ASXL, JAK2 и BCR-ABL.

Ключевые слова: Minor Variant Finder, ASXL1, JAK2, BCR-ABL, миелопролиферативное новообразование, Ph-миелопролифератив-ное новообразование, хронический миелоидный лейкоз

Для цитирования: Субботина Т.Н., Маслюкова И.Е., Фалеева А.А. и др. Использование программного обеспечения Minor Variant Finder для выявления и количественного определения уровня аллельной нагрузки соматических мутаций при онкогематологических заболеваниях. Онкогематология 2020;15(2):85—91.

DOI: 10.17650/1818-8346-2020-15-2-85-91

using the Minor Variant Finder software to identify and quantify the allelic burden level of somatic mutations

in oncohematologic diseases

T.N. Subbotina1,2, I.E. Maslyukova1, A.A. Faleeva1,2, P.A. Nikolaeva1,2, A.S. Khazieva3, E.A. Dunaeva4, K.O. Mironov4, L.B. Polushkina5,1.S. Martynkevich5, S. V. Vereshchagina2, B. V. Barankin2

'Siberian Federal University; 79 Svobodnyy Prospekt, Krasnoyarsk 660041, Russia; 2Federal Siberian Research and Clinical Center of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; 26Kolomenskaya St., Krasnoyarsk 660037, Russia; 3Regional Clinical Hospital; 3a Partizana Zheleznyaka St., Krasnoyarsk 660022, Russia; 4Central Research Institute of Epidemiology, Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance;

3a Novogireevskaya St., Moscow 111123, Russia;

cv

CS

cv a cv

cv

cv а сч

CV CS

CV а CV

«V

5Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology of the Federal Medical and Biological Agency of Russia;

162-Sovetskaya St., Saint Petersburg 191024, Russia

Background. There are problems related to both quantitative assessment of an allele burden level of a mutant gene and interpretation of results in DNA samples with the burden level of the mutant allele less than 15—20 %, when using Sanger sequencing for analyzing somatic mutations. Applied Biosystems (USA) has developed new software Minor Variant Finder, which allows determining mutations with the allele burden level from 5 %.

The objective: to determine the allele burden level and identification of minor variants of somatic mutations in the ASXL1, JAK2 genes and BCR-ABL oncogene using Minor Variant Finder software in patients with myeloproliferative neoplasms.

Materials and methods. The level of mutant allele burden for 15 patients with myeloproliferative neoplasms was determined by the identified mutations using the Minor Variant Finder software, after analysis of point somatic mutations in the ASXL1, JAK2 genes and BCR-ABL oncogene by Sanger sequencing.

Results. The allele burden level in all 5 ASXL1-positive samples and BCR-ABL-positive sample was determined as higher than 20 % using the Minor Variant Finder software. The allele burden level in 2 cases was higher than 20 % and in 7 cases lower than 20 %, when we analyzed 9 JAK2-positive samples.

Conclusion. Minor Variant Finder software can be used to estimate the allele burden level and to identify minor variants of somatic mutations in the ASXL, JAK2 and BCR-ABL genes.

Key words: Minor Variant Finder, ASXL1, JAK2, BCR-ABL, myeloproliferative neoplasm, Ph-myeloproliferative neoplasm, chronic my-eloid leukemia

For citation: Subbotina T.N., Maslyukova I.E., Faleeva A.A. et al. Using the Minor Variant Finder software to identify and quantify the allelic burden level of somatic mutations in oncohematologic diseases. Onkogematologiya = Oncohematology 2020;15(2):85—91. (In Russ.).

Введение

Соматические мутации в опухолевых клетках играют ключевую роль в патогенезе миелопролифе-ративных новообразований (МПН), могут служить диагностическими и прогностическими маркерами, а также определять чувствительность к противоопухолевым препаратам.

Зачастую молекулярно-генетическим маркером какого-либо заболевания является соматическая мутация по типу однонуклеотидной замены, например мутация V617F в гене 1АК2 при хронических Р^миело-пролиферативных новообразованиях (Р^МПН) [1]. В то же время бывают случаи, когда формирование фенотипа заболевания ассоциировано не с одной мутацией, а с целым рядом разных соматических мутаций, локализованных на каком-либо определенном участке ДНК. Примером могут быть диагностические соматические мутации в экзоне 12 гена 1АК2 (более 40 мутаций), обусловливающие развитие истинной полици-темии, а также мутации в экзоне 13 гена ASXL1 (более 100 мутаций), ассоциирующиеся с неблагоприятным прогнозом при Р^МПН и других миелоидных заболеваниях. В обоих приведенных примерах спектр мутаций, ассоциированных с заболеванием, разнообразен. Это могут быть точечные мутации, делеции и вставки небольших участков ДНК, а также их сочетания. Кроме этого, соматические мутации могут обусловливать резистентность к определенному типу лечения. Например, основными причинами резистентности у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) являются точечные соматические мутации в киназном домене (KD) химерного онкогена BCR-ABL, которые могут изменять структуру KD и ухудшать связывание с препаратом [2]. Перечень таких мутаций очень раз-

нообразен, и они могут встречаться на протяженном участке ABL в составе онкогена BCR-ABL. Все это обусловливает необходимость использования такого метода генетического анализа, как секвенирование.

Известно, что при использовании секвенирования по Сэнгеру для анализа соматических мутаций существуют проблемы, связанные как с количественной оценкой уровня аллельной нагрузки мутантного гена (что важно при онкогематологических патологиях), так и с интерпретацией результатов в образцах ДНК с уровнем аллельной нагрузки мутантного гена менее 15—20 % [3]. В то же время достаточно часто, в том числе при онкогематологических заболеваниях, соматические мутации (драйверные, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом течения заболевания, или мутации резистентности) присутствуют в небольшом количестве исследуемых аллелей. Это диктует необходимость использования для анализа соматических мутаций более чувствительных молекулярно-генети-ческих методов или дополнительного программного обеспечения (ПО).

Новое ПО Minor Variant Finder (MVF) для генетических анализаторов фирмы Applied Biosystems (США) предлагается как удобное в использовании ПО для поиска малопроцентных вариантов соматических мутаций, а также подходящее для оценки уровня аллельной нагрузки соматических мутаций [4]. Разработчики заявляют, что ПО способно обнаружить мутацию при уровне аллельной нагрузки от 5 %. По изученным данным литературы, ПО MVF ранее не использовалось для исследования уровня аллельной нагрузки соматических мутаций при онкогематологических заболеваниях. В то же время такое ПО применяли в ряде работ: в исследовании геномного импринтинга [5]; для уточнения

соматического мозаицизма, связанного с одной из мутаций в гене FGFR3 [6]; при установлении корреляции полиморфизмов в гене PDLIM4 с остеопоротическим переломом [7]; в определении онкомаркеров при ме-ланоме [8]. Также чувствительность ПО подтверждалась при скрининге ДНК из солидных опухолей на ряд соматических мутаций [9].

Драйверная мутация V617F в гене JAK2 встречается в большинстве случаев Ph-МПН. Так, у больных истинной полицитемией мутация V617F выявляется в 96 % случаев, при эссенциальной тромбоцитемии — в 55 %, при миелофиброзе — примерно в 45—68 % [10]. Также в последние годы в ряде исследований показано неблагоприятное прогностическое значение соматических мутаций в гене ASXL1 при МПН [11]. Выявлено, что мутации этого гена встречаются примерно у 23 % пациентов с миелофиброзом, определяя высокий риск прогрессирования заболевания [12]. Согласно базе данных COSMIC [13] в последовательности экзона 13 гена ASXL1 описано более 100 соматических мутаций, часть которых относится к точечным мутациям, имеющим неблагоприятное прогностическое значение для пациентов с МПН. Около 40 % пациентов с ХМЛ, принимающих препарат 1-й линии ингибиторов ти-розинкиназной активности, и 50 % пациентов, принимающих препараты 2-й и последующей линий ингибиторов тирозинкиназной активности, являются резистентными к лечению. Список аминокислотных замен в BCR-ABL, обнаруженных у этих пациентов, постоянно пополняется и включает более 90 различных мутаций, встречающихся с различной частотой [14].

Цель исследования — выявление редких вариантов и определение уровня аллельной нагрузки соматических мутаций в генах ASXL1, JAK2 и BCR-ABL с помощью ПО MVF у пациентов с диагнозом МПН.

Материалы и методы

В исследование были включены образцы ДНК 15 пациентов с диагнозом МПН и ранее выявленными соматическими мутациями. В частности, 5 образцов ДНК с мутациями в экзоне 13 гена ASXL1 от пациентов с диагнозом миелофиброз, 9 образцов с мутацией V617F в гене JAK2 от пациентов с различными фенотипически-ми вариантами Ph-МПН и 1 BCR-ABL-положительный образец от пациента с ХМЛ. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов цельной крови: для 11 из 14 пациентов методом адсорбции на силикатной мембране (GeneJET, Thermo Fisher Scientific, США); для 3 образцов ДНК с мутацией в гене ASXL1 использовали фенол-хлороформный метод. РНК пациента с ХМЛ выделяли из лейкоцитов цельной крови с использованием набора реагентов Рибо-преп (ИнтерЛабСервис, Россия). Реакцию обратной транскрипции с образованием комплементарной ДНК проводили с помощью набора ОТ-M—MuLV-RH (БИОЛАБМИКС, Россия).

Мутации в гене ASXL1 и в онкогене BCR-ABL выявлены с помощью секвенирования по Сэнгеру. Му-

тации в гене JAK2, а также уровень аллельной нагрузки данной мутации определены более чувствительными методами: пиросеквенированием и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени [15]. Уровень аллельной нагрузки находился в диапазоне ~5—40 %. Здесь можно отметить, что в отличие от сек-венирования по Сэнгеру, которое не позволяет определять уровень аллельной нагрузки автоматически и требует для этого применения специализированного ПО (например, MVF), использование технологии пи-росеквенирования с применением систем генетического анализа серии PyroMark (Qiagen, Германия) позволяет автоматически определять уровень аллельной нагрузки с помощью базовых версий ПО [16].

Участки экзона 13 гена ASXL1 амплифицировали с использованием 2 пар праймеров (табл. 1). Для амплификации участка гена JAK2 использовали прайме-ры, заимствованные из статьи [17]. Амплификацию химерного транскрипта BCR-ABL (p210) с последующей вложенной ПЦР для амплификации KD химерного транскрипта BCR-ABL проводили с использованием праймеров, заимствованых из статьи [2]. ПЦР выполняли на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США).

Таблица 1. Праймеры для амплификации участков генов ASXL1, JAK2 и онкогена BCR-ABL

Table 1. Primers for polymerase chain reaction amplification ASXL1, JAK2 genes and BCR-ABL oncogene

Праймер Последовательность (5'—3') Размер фрагмента fragment

Sequence (5'-3')

ASXL1.1 прямой ASXL1.1 forward ACAGTCCCTAG-GTCAGATCACC 798 bp

ASXL1.1 обратный ASXL1.1 reverse TCCCACTAGAGA-CGGAATGG

ASXL1.2 прямой ASXL1.2 forward CGGATGTTAGAA-CTGAATGTGAGT 803 bp

ASXL1.2 обратный ASXL1.2 reverse CATGTCACCATT-CACCTTGG

JAK2прямой JAK2 forward CAAAGCACATTG-TATCCTCA 377 bp

JAK2 обратный JAK2 reverse AGTCCTACAGTG-TTTTCAGT

BCR-ABL прямой BCR-ABL forward TGACCAACTCGTG-TGTGAAACTC 1687/

BCR-ABL обратный BCR-ABL reverse TCCACTTCGTCTG-AGATACTGGATT 1612 bp

ABL1 прямой ABL1 forward CGCAACAAG-CCCACTGTCT 713 bp

ABL1 обратный ABL1 reverse TCGGACTTGATG-GAGAACTTGTT

cv a cv

cv

CS

cv a cv

cv

cv а сч

CV CS

CV а CV

«V

Для анализа продуктов амплификации проводили электрофорез в 2 % агарозном геле с последующей визуализацией с использованием системы гель-документирования Gel Doc (Bio-Rad, США). Продукт ПЦР очищали с применением реагента ExoSAP-IT (Applied Biosystems, США). Секвенирующую ПЦР с прямого и обратного праймеров и очистку полученного продукта проводили с помощью BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и BigDye XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США) соответственно. Продукт секвенирования анализировали с помощью прибора Генетический анализатор 3500 (Applied Biosystems, США). Уровень аллельной нагрузки мутаций в исследуемых генах определяли с использованием ПО MVF (Applied Biosystems, США). В качестве контроля была взята ДНК пациентов без мутаций в вышеуказанных генах.

Результаты

При анализе мутаций в гене ASXL1 ПО MVF позволило выявить и рассчитать уровень аллельной нагрузки с прямого и обратного праймеров для всех отобранных 5 пациентов (табл. 2).

• • • V # • * *

G G G G A G C A

Т

425 430

w АЛЛ

C T

C C C C A

315

WWW

# + * * + 4 *

C A G G A A C

■Ал Л 395 ,лЛЛЛ/

—г

T C

345

т—;—~

C T G

T A

350

I УХ-УЛЛА/УЛ.

С прямого праймера / Forward С обратного праймера / Reverse

Рис. 1. Секвенограммы, отражающие уровень аллельной нагрузки, обнаруженный с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder у пациентов с ASXLl-мутациями: а — пациент №4 с мутацией c.2113G>T;p.E705*; б - пациент № 5 с мутацией с. 2077С>Т; p.R693* Fig. 1. The а11е1е burden level detected by Minor Variant Finder software in patient No.4 with c.2113G>T; p.E705* ASXL1 mutation (a) and patient No.5 with c.2077C>T;p.R693* ASXL1 mutation (б)

Таблица 2. Уровень аллельной нагрузки мутаций в гене ASXL1, определенный с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder после секвенирования по Сэнгеру для 5 пациентов с миелофиброзом Table 2. The allele burden level in ASXL1 gene after Sanger sequencing determined by Minor Variant Finder software in 5 myelofibrosis patients

№ пациента

мутация в гене ASXL1

Уровень аллельной нагрузки при секвенировании, %

The allele burden level sequencing, %

1 c.2077C>T; p.R693* 21,6 32,6

2 c.1815C>A; p.C605* 56,0 38,4

3 c.2122C>T; p.Q708* 46,9 37,2

4 c.2113G>T; p.E705* 32,3 33,1

5 с.2077С>Т p.R693* 35,0 42,3

Примеры визуализации результатов использования ПО МУР для пациентов № 4 и 5 с мутациями в гене ASXL1 приведены на рис. 1.

При анализе мутации У617Р в гене 1АК2 ПО МУР выявило данную однонуклеотидную замену во всех 9 анализируемых образцах (табл. 3).

Примеры результатов использования ПО МУР для пациентов № 1 и 4 с мутацией У617Р в гене 1АК2 приведены на рис. 2.

При анализе мутаций резистентности в КО химерного онкогена BCR-ABL ПО МУР позволило выявить мутацию с.898С>Т ^300*) и рассчитать уровень

Т G 17 5

T G Т

C 180

G A C 130 A

A C A 135

» * *

Т G T G T C

17 5 Т

A C A

A C 135

С прямого праймера / Forward С обратного праймера / Reverse

Рис. 2. Секвенограммы, отражающие уровень аллельной нагрузки, обнаруженный с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder у пациентов № 1 (a) и № 4 (б) с мутацией V617F в гене JAK2 Fig. 2. The аШЫ burden level detected by Minor Variant Finder software in patient No. 1 (a) and No. 4 (б) with V617F

аллельной нагрузки с прямого и обратного праймеров, который составил 30,3 и 29,7 % соответственно. Визуализация результата использования ПО МУР для этого пациента приведена на рис. 3.

Представленные секвенограммы были сгенерированы ПО МУР на основе данных секвенирования тестовых и контрольных образцов.

Обсуждение

Программное обеспечение МУР имеет существенное ограничение и может быть использовано для поиска

а

б

а

T

T

G

A

Таблица 3. Уровень аллельной нагрузки мутации V617F в гене JAK2, определенный с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder после секвенирования по Сэнгеру, а также методами пиросеквенирования и полимеразной цепной реакции в реальном времени для 9 пациентов с Ph-миелопролиферативными новообразованиями

Table 3. The allele burden level of V617F mutation in JAK2 gene determined by Minor Variant Finder software Sanger sequencing, pyrosequencing technique, and real-time polymerase chain reaction in 11 Ph-myeloproliferative neoplasms patients

Уровень аллельной нагрузки, %

№ пациента Секвенирование по Сэнгеру

patient no. Sanger sequencing Пиросеквенирование Pyrosequencing Полимеразная цепная реакция

с прямого праймера с обратного праймера в реальном времени

Real-time polymerase chain reaction

1 5,1 4,7 7,0 5,2

2 15,9 20,5 22,0 27,8

3 14,1 17,7 20,0 20,4

4 41,2 37,8 40,0 35,2

5 12,0 12,8 20,0 15,0

6 13,9 16,2 17,0 20,9

7 26,4 27,9 25,0 27,6

8 6,0 7,4 7,0 2,9

9 17,2 8,9 3,0 19,8

cv a cv

cv

CS

cv a cv

cv

С прямого праймера / Forward С обратного праймера / Reverse

Рис. 3. Секвенограммы, отражающие уровень аллельной нагрузки, обнаруженный с помощью программного обеспечения Minor Variant Finder у пациента с мутацией с.898С>Т (Q300*) в киназном домене онкогена BCR-ABL

Fig. 3. The аllele burden level detected by Minor Variant Finder software in patient with с.898С>Т (Q300*) in kinase domain of BCR-ABL oncogene

редких вариантов соматических мутаций и определения уровня аллельной нагрузки только в случае присутствия в анализируемом образце однонуклеотидных замен и не может быть применено при анализе инсер-ций и делеций. Указанное ограничение влияет на выбор генетических локусов, для которых возможно использование ПО MVF. В частности, из всего разнообразия диагностических, прогностических и определяющих чувствительность к противоопухолевым препаратам соматических мутаций, ассоциированных с МПН, для выполнения данной работы нами были выбраны лишь некоторые мутации, а именно те, которые связаны с заменой одного нуклеотида на другой.

При анализе мутаций в гене ASXL1 с помощью ПО MVF уровень аллельной нагрузки для всех 5 образцов был определен как выше 20 %. Данные мутации

были бы выявлены при секвенировании по Сэнгеру и без использования дополнительного ПО, но уровень аллельной нагрузки определить было бы возможно лишь приблизительно. Также можно отметить, что для пациентов № 1, 2 и 3 различия в уровне аллельной нагрузки при определении с прямого и обратного прай-меров имели более выраженные отличия, чем для пациентов № 4 и 5.

При анализе амплифицированного участка экзо-на 14 гена 1АК2 с помощью ПО в 9 образцах ДНК с ранее выявленной другими методами мутацией V617F во всех 9 образцах применение ПО позволило обнаружить данную мутацию. При этом 2 из них имели уровень аллельной нагрузки выше 20 % (выше предела обнаружения секвенирования по Сэнгеру), т. е. в этих 2 случаях мутация была бы выявлена при секвенировании по Сэнгеру и без использования дополнительного ПО, но уровень аллельной нагрузки определить было бы возможно лишь приблизительно. Остальные 7 образцов имели нагрузку менее 20 % и соответственно при анализе данных результатов секвенирования по Сэн-геру без применения ПО MVF нельзя было бы быть уверенным в наличии мутации.

При анализе мутаций в КО химерного онкогена BCR-ABL с помощью ПО М^ уровень аллельной нагрузки для образца был определен как выше 20 %. Поскольку все мутации онкогена BCR-ABL, обусловливающие лекарственную резистентность у пациентов с ХМЛ, точечные, их перечень очень разнообразен, уровень аллельной нагрузки может меняться и даже

cv a cv

cv

CS

клоны с одной мутациеи резистентности могут меняться на клоны с другой мутацией, то секвенирование по Сэнгеру с дальнейшим использованием ПО MVF является очень удобным подходом при исследовании резистентности у пациентов с ХМЛ.

В целом можно отметить, что использование ПО MVF позволяет увеличить выявляемость соматических мутаций при их детекции с помощью секвени-рования по Сэнгеру, поскольку в случае присутствия в образце ДНК менее 20 % мутантного аллеля и при анализе результатов секвенирования по Сэнгеру без применения данного ПО нельзя быть уверенным в наличии мутации. В то же время возможность оценки с помощью ПО MVF уровня аллельной нагрузки в не-

которых случаях очень важна, особенно при диагностике, прогнозировании и лечении онкогематологи-ческих заболеваний.

Заключение

Программное обеспечение MVF может быть использовано для выявления малопроцентных вариантов и оценки уровня аллельной нагрузки соматических мутаций в генах ASXL1, JAK2 и онкогене BCR-ABL, однако при планировании использования данного ПО необходимо учитывать, что оно может применяться только в случае анализа однонуклеотидных замен и не может быть использовано в случае мутаций по типу инсерций или делеций.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

CV a CV

CV

1. Vannucchi A.M., Guglielmelli P. Molecular pathophysiology of Philadelphia — negative myeloproliferative disorders: beyond JAK2 and MPL mutations. Haematologica 2008;93(7):972-6. DOI: 10.3324/haematol.13266.

2. Иконникова А.Ю., Яценко Ю.Е., Кременецкая О.С. и др. Определение мутаций гена BCR-ABL при хроническом миелолейкозе с использованием биочипа. Молекулярная биология 2016;50(3):412-6.

DOI: 10.7868/S0026898416020087. [Ikonnikova A.Yu., Yatsenko Yu.E., Kremenetskaya O.S. et al. Detection of BCR-ABL gene mutations in chronic myeloid leukemia using biochips. Moleku-lyarnaya biologiya = Molecular Biology 2016;50(3):412-6. (In Russ.)].

3. Ogino S., Kawasaki T., Brahmandam M. et al. Sensitive sequencing method for KRAS mutation detection by pyrose-quencing. J Mol Diagn 2005;7(3):413-21. DOI: 10.1016/S1525-1578(10)60571-5.

4. Schreiber E.H., Leong H., Schneider S.J. Minor Variant Finder: New software

for detecting somatic mutations at low level in Sanger sequencing traces. Am Assoc Cancer Res 2016;76(14):5269.

DOI: 10.1158/1538-7445.AM2016-5269.

5. Zhuo Z., Lamont S.J., Abasht B. RNA-Seq Analyses identify frequent allele specific expression and no evidence of ge-nomic imprinting in specific embryonic tissues of chicken. Sci Rep 2017;7(1):11944. DOI: 10.1038/s41598-017-12179-9.

6. Bessis D., Plaisancie J., Gaston V., Bieth E. Fibroblast growth factor receptor 3 epidermal naevus syndrome with urothe-lial mosaicism for the activating p.Ser249Cys FGFR3 mutation. Acta Derm Venereol 2017;97(3):402-3.

DOI: 10.2340/00015555-2554.

7. Chen J., Hong Z., Zhao C. et al. Associations between polymorphisms of the PDLIM4 gene and susceptibility to osteoporotic fracture in an elderly population of Han Chinese. Biosci Rep 2019;39(1):20181505.

DOI: 10.1042/BSR20181505.

8. Beretti F., Bertoni L., Farnetani F. et al. Melanoma types by in vivo reflectance confocal microscopy correlated with protein and molecular genetic alterations:

a pilot study. Exp Dermatol 2019;28(3):254-60. DOI: 10.1111/exd.13877.

9. Jackson S., Gerstner A., Varma K. A capillary electrophoresis-sequencing based screening solution for identifying and quantifying hotspot mutations in solid tumors. Eur J Cancer 2016;61(1):156-7. DOI: 10.1016/S0959-8049(16)61553-8.

10. Меликян А.Л., Ковригина А.М., Суборцева И.Н. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миело-пролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофи-броз). Гематология и трансфузиология 2018;63(3):275-315.

DOI: 10.25837/HAT.2019.51.88.001. [Melikyan A.L., Kovrigina A.M., Subortseva I.N. et al. National dinical recommendations for diagnosis and therapy of Ph-negative myeloproliferative neoplasms (polycythemia vera, essential thrombocythemia, primary myelofibrosis). Gematologiya i transfuziologiya = Russian Journal of Hematology and Transfusiology 2018;63(3):275-315. (In Russ.)].

11. Vannucchi A.M., Lasho T.L., Guglielmelli P. et al. Mutations and prognosis in primary myelofibrosis. Leukemia 2013;27(9):1861-9. DOI: 10.1038/leu.2013.119.

12. Sorigué M., Ribera J.M., Garcia O. et al. Highly variable mutational profile

of ASXL1 in myelofibrosis.

Eur J Haematol 2016;97(4):331-6.

DOI: 10.1111/ejh.12731.

13. Catalogue of somatic mutations

in cancer. Available by http://cancer. sanger.ac.uk/cosmic.

14. Soverini S., Abruzzese E., Bocchia M. et al. Next-generation sequencing

for BCR-ABLj kinase domain mutation testing in patients with chronic myeloid leukemia: a position paper. J Hematol Oncol 2019;12(1):131. DOI: 10.1186/s13045-019-0815-5.

15. Larsen T.S., Christensen J.H., Hasselbalch H.C. et al. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. Br J Haematol 2007;136(5):745-51.

DOI: 10.nn/j.1365-2141.2007.06497.x.

16. Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П. и др. Количественное определение мутации V617F

в гене JAK2 методом пиросеквенирова-ния. Клиническая лабораторная диагностика 2014;59(11):60-3. [Dunaeva E.A., Mironov K.O., Dribnokhodova O.P. et al. The quantitative testing of V617F mutation in gene JAK2 using pyrosequencing technique. Klin-icheskaya laboratornaya diagnostika = Clinical Laboratory Diagnostics 2014;59(11):60-3. (In Russ.)].

17. Wu Z., Zhang Y., Zhang X. et al.

A multiplex snapback primer system for the enrichment and detection of JAK2 V617F and MPL W515L/K mutations in Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms. Biomed Res Int 2014;2014:458457. DOI: 10.1155/2014/458457.

Вклад авторов ¡2 Т.Н. Субботина, С.В. Верещагина, Б.В. Баранкин: разработка дизайна исследования, научное редактирование, утверждение статьи; И.Е. Маслюкова, А.А Фалеева, П.А. Николаева: получение данных, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание части текста рукописи; в А.С. Хазиева, И.С. Мартынкевич: предоставление материалов для исследования, анализ полученных данных, научное редактирование, cv утверждение статьи; ™ Е.А. Дунаева, К.О. Миронов, Л.Б. Полушкина: получение данных, анализ полученных данных. ^ Authors' contributions

T.N. Subbotina, S.V. Vereshchagina, B.V. Barankin: developing the research design, article editing, article approval;

I.E. Maslyukova, A.A. Faleeva, P.A. Nikolaeva: obtaining data, analysis of the obtained data, reviewing of publications of the article's theme, writing о

part of the text; J

A.S. Khazieva, I.S. Martynkevich: providing materials for research, analysis of the obtained data, article editing, article approval; |_ E.A. Dunaeva, K.O. Mironov, L.B. Polushkina: obtaining data, analysis of the obtained data.

ORCID авторов / ORCID of authors

Т.Н. Субботина / T.N. Subbotina: https://orcid.org/0000-0001-7790-5033 О

И.Е. Маслюкова / I.E. Maslyukova: https://orcid.org/0000-0003-1323-2612 "

А.А. Фалеева / A.A. Faleeva: https://orcid.org/0000-0001-7618-5177 ^

П.А. Николаева / P.A. Nikolaeva: https://orcid.org/0000-0002-3863-8347 _

А.С. Хазиева / A.S. Khazieva: https://orcid.org/0000-0001-7525-6981 „ Е.А. Дунаева / E.A. Dunaeva: https://orcid.org/0000-0002-4477-8506

К.О. Миронов / K.O. Mironov: https://orcid.org/0000-0001-8207-9215 I

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. в

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. a

cv

Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. CV Financing. The study was performed without external funding.

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

Протокол исследования одобрен локальным комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический _

центр Федерального медико-биологического агентства России». Протокол № 10 от 01.02.2017. в Compliance with patient rights and principles of bioethics

The study protocol was approved by the Local Ethics Committee of Federal State Budgetary Institution "Federal Siberian Scientific Clinical Center ^

of Federal Medico-Biological Agency of Russia". Protocol No 10 dated 01.02.2017. ш

Статья поступила: 22.04.2020. Принята к публикации: 29.05.2020. Article submitted: 22.04.2020. Accepted for publication: 29.05.2020.