Скрининг протистоцидной активности новых веществ из ряда амидов жирных кислот Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Скрининг протистоцидной активности новых веществ из ряда амидов жирных кислот

М.А. Бодрякова, м.н.с, А.А. Зубенко, кх.н, А.В. Коваленко, д.в.н, Л.Н. Фетисов, с.н.с., А.Н. Бодряков, к.в.н, СевероКавказский зональный НИВИ

Экономический ущерб, причиняемый кокцидиозами (эймериозами), в животноводстве складывается из снижения привесов, снижения яичной продуктивности (в птицеводстве), падежа молодняка, дополнительных затрат на проведение санации помещений и лечебно-профилактических мероприятий [1]. В птицеводстве, к примеру, это заболевание широко распространено в связи с высокой устойчивостью ооцист эймерий к воздействию химических веществ, возможностью пара-зитирования нескольких видов кокцидий в одном организме, способностью эймерий вырабатывать резистентность к антиэймериозным препаратам.

Профилактика и терапия эймериозов включает применение антикокцидийных средств, которые должны предупреждать заболеваемость и гибель птицы от всех видов кокцидий, быть безвредными (отсутствие токсичности для птицы и человека), не оказывать отрицательного влияния на продуктивные и репродуктивные свойства птицы, не обладать кумулятивным действием, не вызывать развитие резистентности, быть устойчивыми при хранении, быть совместимыми с кормовыми ингредиентами, не изменять вкусовые качества корма [2, 3].

Действие различных кокцидиостатиков направлено на ингибирование процессов биосинтеза, замещение витаминов (тиамин, фолиевая кислота, витамин РР, рибофлавин, биотин, витамин К), замещение ферментов (цитохром) [2].

Способность кокцидий приобретать резистентность к химиопрепаратам становится всё более актуальной проблемой. Механизм развития устойчивости эймерий к кокцидиостатикам обусловливается следующими факторами:

образованием и выделением паразитами ферментов, разрушающих препарат; появлением мутагенных устойчивых форм; изменением характера метаболических процессов; размножением природно-резистентных штаммов и гибелью не-

резистентных форм на фоне селективного фактора, которым является кокцидиостатик [3].

Нужно отметить также, что сформированная резистентность к препарату генетически передаётся потомству и сохраняется у эймерий неопределённое время [2].

Начиная с 2000 г. исследователями практически не было разработано и на рынке не появилось ни одного нового противококцидиозного препарата [4].

При кокцидиозах чаще всего используют кок-цидиостатики двух групп: химические (химкокцид, диклазурил и др.) и ионофорные антибиотики (одно- и двухвалентные). Механизм действия первых заключается в ингибировании биосинтеза тиамина (витамина В1) у паразитов. Химические кокцидиостатики по своему строению сходны с тиамином, необходимым для жизнедеятельности кокцидий, они быстро проникают в клетку паразита и блокируют активные центры связывания витамина, в результате углеводный обмен нарушается и паразит погибает. Антикокцидийное действие ионофоров обусловлено их способностью образовывать липофильные комплексы с ионами щелочных металлов и переносить их через клеточную стенку паразита, что приводит к нарушению осмотического баланса и гибели простейших [5].

В последние годы в СКЗНИВИ ведётся синтез и активный скрининг среди новых веществ различных классов органических соединений. Синтезы в ряду производных амидов жирных кислот позволили получить новые соединения, обладающие высокими антибактериальными свойствами. Мы предположили, что эти соединения могут обладать также протистоцидной активностью.

Цель и задачи — определить протистоцидную активность и токсичность новых веществ из ряда амидов жирных кислот, установить зависимость уровня протистоцидной активности от структурных особенностей новых веществ (наличие четвертичного атома азота, длина углеводородной цепи в формуле кислоты и структура аминного фрагмента).

Материалы и методы. Протистоцидную активность изучали по разработанной нами методике

на культурах: Tetrachimena piriformis, Paramecia caudatum, Colpoda steinii и др. на средах, описанных ранее [6—8]. Протистоцидную активность изучали методом серийных разведений. Наиболее удобным и доступным тест-объектом оказались колподы вида С. steinii. Работу выполняли в микропланшетах, например для постановки ИФА. В качестве среды для переживания простейших использовали смесь кипячёной водопроводной воды и стерильной дистиллированной воды в равных объёмах. Первоначальное разведение вещества готовили на дистиллированной воде. Серийные разведения новых соединений готовили следующим образом:

Раствор № 1:5 мг вещества + 50 мкл 70-процентного водного раствора ДМСО (диметилсуль-фоксид) + 5 мл дистиллированной при перемешивании стеклянной палочкой — учитываемая концентрация — 1000 мкг/мл.

Растворы № 2—12 — со второй по двенадцатую лунки автоматической восьмиканальной пипеткой вносят по 150 мкл воды (смесь кипячёной водопроводной и дистиллированной воды), затем во вторую лунку приливают 150 мкл раствора № 1 и после перемешивания переносят 150 мкл в третью лунку и так далее до конца ряда, из двенадцатой лунки после перемешивания удаляли 150 мкл. В первую лунку вносили 150 мкл раствора № 1.

Во все лунки с подготовленными разведениями веществ вносили по 30 мкл взвеси простейших трёхсуточного возраста. Взвесь простейших готовили таким образом, чтобы в каждом поле зрения при микроскопии на малом увеличении насчитывалось 10—15 активных особей. После внесения простейших планшет накрывали крышкой и оставляли при комнатной температуре (20—22°С) на 18—20 часов. Для учёта результатов автоматической микропипеткой с разовым наконечником набирали после перемешивания из последней лунки ряда 30 мкл содержимого, наносили этот объём на чистое предметное стекло и просматривали под микроскопом на малом увеличении (10 х 15). Отмечали наличие или отсутствие живых простейших. Просмотр производили справа налево. Первая лунка, где нет ни одной живой особи, считается содержащей минимальную протистоцидную концентрацию изучаемого вещества. Ставили контроли: контроль среды — вода для переживания + простейшие (5 лунок); контроль растворителя (используется при изучении активности водонерастворимых веществ) — 50 мкл ДМСО 70% + 5 мл дистиллированной воды и далее серийные разведения как для вещества, затем в лунки вносили по 30 мкл взвеси простейших. Таким образом, в одном планшете (8х12 лунок) проводили испытания 8 веществ.

Острую токсичность новых соединений изучали на лабораторных крысах по следующей методике [8]: в предварительном опыте на малом количестве лабораторных животных (по три крысы в группе) устанавливали максимально переносимую

дозу (МПД) и дозу, вызывающую 100-процентную гибель животных (ЛД100). Затем в основном опыте каждую из 5—7 доз препарата, лежащую в интервале между МПД и ЛД100, вводили пяти лабораторным крысам. Расчёт ЛД50 производили по методу Кербера. В предварительном и основном опытах соединения вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде водных растворов или суспензии в изотоническом растворе хлорида натрия (0,85-процентный р-р по №С1).

Сравнивали действие известных противо-кокцидийных препаратов байкокс, ампролиум, и фуразолидон, часто рекомендуемых для лечения животных, больных кокцидиозом (эймериозом).

Результаты исследований. Синтезированы соединения ряда амидов жирных кислот общей формулы 1 (а-1):

СН3-(СН2)п-(С=0)-Р 1 (аП)

1а п=10 R=

1b n=10 R= N N

O

H

1c n=12 R= NH-CH2-CH2-CH2-N-(CH3)2

Cl-

1d n=12 R= NH-CH2-CH2-CH2-N-(CH3)

32

1e n=12 R= N

N

1f n=12 R= N

N

O

где п — число метиленовых звеньев.

Изучена активность 150 новых соединений на простейших вида Colpoda steinii. Минимальная протистоцидная концентрация и установленная величина ЛД50 некоторых изученных нами соединений представлены в таблице.

Протистоцидная активность новых соединений (от 0,48 до 7,8 мкг/мл) превосходит активность известных препаратов (62,5—250 мкг/мл). Обращает на себя внимание тот факт, что соеди-

Минимальные протистоцидные концентрации

нения 1а (производное лауриновой кислоты), 1с и 1е (производные миристиновой кислоты), содержащие некватернизованную аминогруппу, значительно более активны, чем соединение И (производное лауриновой кислоты). Возможно, это связано с лучшей проницаемостью в клетку простейших из-за более высокой липофильности этих структур. Все изученные соединения малотоксичны для лабораторных крыс.

Выводы.

1. Высокая протистоцидная активность веществ из ряда амидов жирных кислот в отношении Со!ройа

steinii даёт основание для дальнейшего их изучения в качестве антипротозойных средств.

2. Учитывая высокую протистоцидную активность и низкую токсичность, данные соединения могут быть отобраны для дальнейшего изучения в качестве активно действующих веществ в составе противококцидиозных препратов.

Литература

1. Никитин И.Н., Анчиков В.В. Эффективность мероприятий при кокцидиозе // Ветеринария. 1984. № 9. С. 42—44.

2. Елисеева Е.Н. Эффективные препараты для профилактики и лечения кокцидиоза птицы. 2008. URL: http://geum.ru/ next/refrt-60761.html / (дата обращения 3.09.14 г.).

3. Хованских А.Е., Илюшечкин Ю.П., Кириллов А.И. Кокцидиоз сельскохозяйственной птицы. Л.: Агропромиздат. Ленингр. отд., 1990. 152 с.

4. Гинберт Э. Вакцина — паракокс: крупное достижение в области контроля кокцидиоза птиц // Информационный бюллетень Schering-Plough Animal Health Poultry focus, 2008. Вып. 4. URL: www.intervet.ru/ (дата обращения 3.09.2014 г.).

5. Беспалова Н.С. Современные противопаразитарные средства в ветеринарии. М.: КолосС, 2006. 192 с.

6. Зубенко А.А., Фетисов Л.Н., Бодряков А.Н. и др. Определение протистоцидной активности новых соединений в ряду азотсодержащих гетероциклов // Научное обеспечение инновационного развития отечественного животноводства: матер. Всеросс. науч.-практич. конф. ГНУ СКЗНИВИ. Новочеркасск, 2011. С. 162—165.

7. Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии. М.: Медицина, 1971. С. 24-26, 528-530.

8. Фетисов Л.Н., Зубенко А.А., Бодрякова М.А. и др. Изыскание новых протистоцидных средств // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии: матер. междунар. симпозиума «Проблемы общей и частной паразитологии». СПб., 2012. С. 70-73.

новых веществ и сравниваемых препаратов

Соединения Уровень протистоцидной активности в отношении Colpoda steinii, мкг/мл Токсичность, ЛД50

1a 0,9 >2 г/кг

1b 3,9 >2 г/кг

1c 0,48 >2 г/кг

1d 3,125 >2 г/кг

le 1,9 >2 г/кг

1f 7,8 >2 г/кг

Байкокс 62,5 -

Ампролиум 62,5 -

Фуразолидон >250 -