CC BY
17СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕАЗ РОДА BACILLUS ПРИ РАЗЛИЧНЫХ
УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 1Ишанходжаев Т.М., 2Рахмонов Р.А., 3Холиков А.Ф., 4Муртозоев А.К., 5Саъдуллаев Ш.Т., 6Пулатова О.М., 7Алимова Б.Х., 8Махсумханов А.А.
1,2,3,4,5,6,7,8Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, г.Ташкент,
Узбекистан. е-mail: microbio@academy.uz https://doi.org/10.5281/zenodo.8372639 Аннотация. Широкое применение и разработка эффективных технологий получения промышленных ферментов с помощью микроорганизмов привлекает все большое количество исследователей в этой области на поиск и исследование продуцентов протеолитических ферментов. В этой связи , целью представляемой работы было проведение скрининга бактерий рода Bacillus из местной коллекции Института Микробиологии для отбора наиболее эффективных штаммов продуцентов протеаз и подбор оптимальных условий культивирования. Результаты исследования показали, что из 20 отобранных штаммов три: В. licheniformis, В. endophyticus и B. subtilis проявили наибольшую протеазную активность при рН 8,0, 48 часов инкубации. При добавлении в обедненную питательными веществами среду культивирования дополнительных источников углерода и азота только мономеры углеводов: арабиноза и фруктоза, а также мочевина восстанавливали активность протеаз исследованных продуцентов до исходных величин.
Ключевые слова: протеазы, микроорганизмы, род Bacillus, среда культивирования, рН, казеин, углеводы, источник азота,
Annotatsiya. Mikroorganizmlar yordamida sanoat fermentlarini olishning samarali texnologiyalarini keng tatbiq etish va ishlab chiqish ushbu sohadagi tadqiqotchilarni tobora ko'proq jalb qilmoqda. Ushbu ishning maqsadi proteaza ishlab chiqaruvchilarning eng samarali shtammlarini tanlash va optimal etishtirish sharoitlarini tanlash uchun Mikrobiologiya institutining mahalliy kolleksiyasidan Bacillus jinsi bakteriyalarini skrining qilish edi. Tadqiqot natijalari shuni ko'rsatdiki, tanlangan 20 ta shtammdan uchtasi: B. licheniformis, B. endophyticus va B. subtilis pH 8,0, 48 soat inkubatsiyada eng yuqori proteaza faolligini ko'rsatdi.
Kalit so'zlar: proteazlar, mikroorganizmlar, Bacillus jinsi, etishtirish muhiti, pH, kazein, uglevodlar, azot manbai,
Abstract. The wide application and development of effective technologies for the production of industrial enzymes with the help of microorganisms attracts a growing number of researchers in this field. The aim of the present work was to screen bacteria of the genus Bacillus from the local collection of the Institute of Microbiology in order to select the most effective strains of protease producers and select the optimal cultivation conditions. The results of the study showed that three of the 20 selected strains: B. licheniformis, B. endophyticus and B. subtilis showed the highest protease activity at pH 8.0, 48 hours of incubation.
When studying the effect of additional sources of carbon and nitrogen, arabinose and fructose, as well as urea, had the greatest effect on the activity of the enzyme.
Keywords: proteases, microorganisms, Bacillus genus, cultivation medium, pH, casein, carbohydrates, nitrogen source,
Протеазы представляют собой один из наиболее ценных классов, содержащий около 40% доли рынка промышленных ферментов во всем мире. В некоторых отраслях промышленности они используются для различных целей, включая стиральные порошки, продукты питания, фармацевтические препараты, обработку кожи, синтез пептидов и извлечение серебра из использованных рентгеновских пленок.
Наиболее часто используемыми коммерческими ферментами являются микробные протеазы, особенно из рода Bacillus [1]. Микроорганизмы рода Bacillus являются эффективными продуцентами различных метаболитов, в том числе ферментов протеаз. Получение протеаз, с помощью микроорганизмов, оказалось намного рентабельней, чем из растений и животных и отличаются простотой технологии производства и экономичностью. Известно, что щелочные протеазы привлекают к себе внимание возможностью применения их не только в промышленности: моющие средства, продукты питания, кожевенное производство, но и в составе кормовых добавок и фармацевтических средств. Возможность использования протеаз не только в качестве протеолитических ферментов, но и в качестве противомикробных средств для лечения многих заболеваний и инфекций может оказать огромное влияние на медицинские и различные клинические методы лечения [2-4]. Протеазы в отношении физиологической и коммерческой роли занимают ключевое положение, их считают альтернативой химическим веществам, они экологически безопасны для окружающей среды. И потребность в разработке новых способов и источников получения протеолитических ферментов устойчивых к рН и температурным воздействиям для их промышленного применения остается актуальной и в настоящее время.
В связи с этим, целью представляемой работы было проведение скрининг бактерий рода Bacillus из местной коллекции Института микробиологии для отбора наиболее эффективных штаммов продуцентов протеаз и подбор оптимальных условий культивирования.
Материалы и методы исследования
В работе представлены результаты качественного и количественного определения протеазной активности 20 продуцентов из рода Bacillus при различных условиях культивирования, у которых при первоначальном скрининге на твердой среде зона деградации казеина достигала более 10 миллиметров. Исследования проведены на штаммах бактерий рода Bacillus хранящиеся в коллекции Института микробиологии АН РУз, а также в коллекции лаборатории Энзимологии, которые были выделены ранее из образцов почв территорий масложиркомбинатов Кашкадарьинской и Самаркандской областей.
В работе были использованы следующие питательные среды: твердая среда состоящая из мясного экстракта, агар-агара и обезжиренного молока, в состав жидкой среды входил питательный бульон (HiMedia, India), 1% казеин и различные углеводные и содержащие NH группу добавки. При исследовании влияния различных углеводных и NH групп добавок среда культивирования содержала основные компоненты питательного бульона в 5 раз меньше исходного. Протеазную активность определяли по методу Ансон [5] и выражали в единицах активности фермента в 1 мл культуральной жидкости, что соответствует единице активности фермента, которое необходимо для высвобождения 1 мкмоля тирозина в минуту.
Влияние различных условий культивирования, углеводных и содержащих КН группы веществ (добавляли в количестве 1% массы на объем питательной среды) исследовали как описано в работах [6, 7]. Сухую биомассу продуцентов определяли гравиметрическим методом. Наиболее активные продуценты протеазы охарактеризованы микроскопическими методами и с помощью масс спектрометрии Ма1& ТоГ МБ.
Результаты исследования
В результате первичного качественного скрининга продуцентов протеаз на твердой среде, с молоком в качестве субстрата, были отобраны шесть штаммов, у которых зона расщепления казеина составляла от 4 до 18 мм после 48 часов культивирования при рН 8,0 (Рис. 1). Следует отметить, что зоны расщепления казеина при других рН были значительно ниже, что свидетельствует скорее о щелочной природе исследованных протеаз.
20 ей S Н и 1 ^ |
О X ва s с |
■С eU я S к с Р) о ^ Ii Ii II Ii .Ii
о ^ Я Си П
119 ХЗ Х4 Х5 Х6 Х7 Название штаммов
■ Активы.при pH 4 ( в мм) ■ Активы.при рН8 ( в мм) ■ Активн.прн рН10(в мм)
Рисунок 1. Скрининг штаммов бактерий рода Bacillus по протеазной активности на твердой питательной среде с обезжиренным молоком при различных значениях рН (48 ч культивирования).
Исследование протеазной активности 6 изолятов рода Bacillus при культивировании в течении 96 часов в жидкой среде с 1% казеином и при различных рН показало следующее (Рис. 2).
Рисунок 2. Протеазная активность отобранных штаммов рода Bacillus на жидкой питательной среде при различных значениях рН.
Из рисунка 2 видно, что наибольшая активность наблюдалась у штаммов 119, Х3 и Х7 при рН 8 и после 48 часов инкубации. При этом значение активности фермента штаммов 119 и Х7 выше 70 Ед/мл культуральной среды. При последующей инкубации в течении 96 часов при 30 оС и 150 об/мин скорости перемешивания наблюдается снижение активности фермента.
Наиболее активные продуценты протеаз из шести отобранных: 119, Х3 и Х7, были в последующем идентифицированы микроскопическими методами и с помощью масс спектрометрии Maldi-Tof-MS. Установлено, что они относятся к роду Bacillus: В. licheniformis - 119, В. endophyticus - X3 и B subtilis - X7, грамположительные, в форме палочек, одиночные и в коротких цепях, неподвижные, с белыми и сухими колониями.
Исследование влияние различных углеводов и источников азота показало (Рис. 3), что наибольшее влияние на активность протеазы продуцентов оказали арабиноза и фруктоза из углеводов, а также мочевина и (NH4)2HPO4 после 48 часов культивирования.
11 II II Ii II I
£ Контроль Арабиноза Галактоза Лактоза Мальтоза Фруктоза
■ Изменение в % N 119 ■ Изменение в % ХЗ ■ Изменение в % Х7
Рисунок 3. Изменение протеазной активности в процентах штаммов В. licheniformis -119, В. endophyticus -Х3 и B. subtilis -Х7 относительно контроля при добавление различных углеводов в среду культивирования после 48 часов инкубации.
Результаты этой серии экспериментов показывают, что для исследованных штаммов рода Bacillus (В. licheniformis -119, В. endophyticus -Х3 и B. subtilis -Х7) доступность углеродных компонентов для усвоения из мономерных углеводов выше, чем из полимеров (Рис. 3). Из источников азота наибольшее влияние на протеазную активность наблюдалось при добавлении мочевины и (NH4)2HPO4, возможно, также из-за большей доступности этих компонентов для усвоение (Рис. 4).
I II.....Ill
Контроль Мочевина NH4CL NH4N04 (NH4)2HP04
Источники азота
■ Изменение в % N 119 ■ Изменение в % ХЗ ■ Изменение в % Х7
Рисунок 4. Изменение протеазной активности в процентах штаммов В. licheniformis -119, В. endophyticus -Х3 и B. subtilis -Х7 относительно контроля при добавление содержащих азот веществ в среду культивирования после 48 часов инкубации.
Таким образом, результаты исследований показывают, что отобранные штаммы В. licheniformis -119, В. endophyticus -Х3 и B. subtilis -Х7 наибольшую протеазную активность проявляют при рН 8,0, 48 часов инкубации и при добавлении дополнительных источников углерода и азота. В работе [6], которые также исследовали влияние углеводных добавок на протеазную активность halotolerant Bacillus licheniformis наблюдали повышение активности ферментов при добавлении лактозы и мальтозы. В наших экспериментах эти углеводы не оказывали заметного влияния как на активность фермента, так и на количество тирозина и биомассу продуцентов. Возможно, при подборе оптимальных сред культивирования с дополнительными источниками углерода, азота и другими структурными и энергетическими компонентами можно добиться увеличения протеазной активности на единицу биомассы продуцентов для их промышленного применения в будущем.
REFERENCES
1. Tarek, H.; Nam, K.B.; Kim, Y.K.; Suchi, S.A.; Yoo, J.C., Biochemical Characterization and Application of a Detergent Stable, Antimicrobial and Antibiofilm Potential Protease from Bacillus siamensis. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 5774. https://doi.org/10.3390/ijms24065774
2. Rachanamol, R.; Lipton, A.; Thankamani, V.; Sarika, A.; Selvin, J. Production of protease showing antibacterial activity by Bacillus subtilis VCDA associated with tropical marine sponge Callyspongia diffusa. J. Microb. Biochem. Technol 2017, 9, 270-277.
3. Siritapetawee, J.; Thammasirirak, S.; Samosornsuk, W. Antimicrobial activity of a 48-kDa protease (AMP48) from Artocarpus heterophyllus latex. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2012, 16, 132-137. [PubMed]
4. Thomas, N.N.; Archana, V.; Shibina, S.; Edwin, B.T. Isolation and characterization of a protease from Bacillus sps. Mater. Today:Proc. 2021, 41, 685-691. [CrossRef]
5. B. Hagihara, The Enzymes, vol. 4, Academic Press Inc., Newyork, 1958
6. C. Suganthi, A. Mageswari, S. Karthikeyan, M. Anbalagan, A. Sivakumar, K.M. Gothandam, Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus
licheniformis isolated from saltern sediments, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology (2013) 11, 47-52. 7. Masi C, Gemechu G., Tafesse M. Isolation, screening, characterization, and identification of alkaline proteaseproducing bacteria from leather industry effluent. Annals of Microbiology (2021) 71:24, https://doi.org/10.1186/s13213-021-01631-
