CC BY
19
УДК 577.113.5, 577.29, 577.15.08
СКРИНИНГ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА УСТОЙЧИВОСТЬ К БЕТА-ЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧИПОВ С ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
М.М. Уляшова, Г.В. Преснова, Ю.И. Поболелова, А.А. Филиппова, А.М. Егоров, М.Ю. Рубцова*
(кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ; *e-mail: mrubtsova@gmail.com)
Метод гибридизационного анализа на микрочипах с ферментативной детекцией на основе пероксидазы хрена применен для скрининга возбудителей внутри- и внеболь-ничных инфекций на наличие генов бета-лактамаз, обусловливающих устойчивость возбудителей к бета-лактамным антибиотикам. Показаны преимущества данного метода для экспресс-идентификации генов. Выявлены сходство и различие в генах бета-лактамаз, выявляемых у возбудителей внутри- и внебольничных инфекций. Самым распространенным типом бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) являются бета-лактамазы СТХ-М-типа. Отмечена высокая распространенность бета-лактамаз широкого спектра, особенно бета-лактамазы ТЕМ-1. У внебольничных возбудителей в большей степени идентифицированы гены бета-лактамаз подгруппы СТХ-М-1 (либо индивидуально, либо в сочетании с генами бета-лактамаз ТЕМ-1 и 8ИУ-1). Случаев одновременного выявления нескольких бета-лактамаз БЛРС-типа у внебольничных возбудителей не отмечено. У внутрибольничных возбудителей идентифицировано существенно более разнообразное сочетание генов различных бета-лактамаз: (сочетание бета-лактамаз расширенного и широкого спектра отмечено в 62% случаев, одновременное присутствие БЛРС двух различных типов - в 18% случаев).
Ключевые слова: бета-лактамазы, микрочипы, гибридизация, колориметрическая детекция, пероксидаза хрена.
Микроорганизмы семейства Enterobacteriacea являются одними из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний, для лечения которых в качестве антибактериальных средств обычно применяют бета-лактамные антибиотики, составляющие в настоящее время более половины всех используемых в мире антибактериальных препаратов. Однако все чаще встречаются случаи клинической неэффективности лекарственной терапии данным классом антибиотиков вследствие развития устойчивости микроорганизмов к их действию. Устойчивость возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам становится все более серьезной проблемой во всем мире [1, 2]. В последние годы эта проблема стала еще более угрожающей в связи с распространением панре-зистентных микроорганизмов [3]. Увеличение мобильности населения ускоряет распространение резистентных штаммов [4]. В настоящее время проблема устойчивости касается не только вну-трибольничных (нозокомиальных), но и внебольничных инфекций [5-7].
Самые распространенные в настоящее время виды резистентности связаны с продукцией
бактериями ферментов бета-лактамаз. Бета-лак-тамазы представляют собой суперсемейство генетически и функционально различных ферментов, которые объединяет способность разрушать бета-лактамное кольцо. К настоящему времени описано 1300 ферментов [8]. С точки зрения клинической практики наиболее значимыми являются бета-лактамазы молекулярного класса А (ТЕМ-, 8ИУ- и СТХ-М-типы). Многообразие бета-лактамаз молекулярного класса А и их широкое распространение диктуют необходимость разработки высокопроизводительного и быстрого скрининга микроорганизмов на наличие ферментов данного типа. В связи с этим методы геноти-пирования на олигонуклеотидных микрочипах можно считать перспективными с точки зрения как скорости получения результатов анализа, так и его информативности.
Цель данной работы - использование микрочипов с колориметической детекцией на основе пероксидазы хрена для скрининга ДНК возбудителей внутри- и внебольничных инфекций на наличие генов бета-лактамаз молекулярного класса А.
Экспериментальная часть
Набор праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амино-модифицированные оли-гонуклеотидные зонды были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Образцы ДНК, выделенные из клинических штаммов энтеробактерий-продуцентов, предоставлены НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (г. Смоленск, Россия).
В качестве мембранного носителя для микрочипов использовали нитроцеллюлозу BioTrace NT («Pall Corporation», США). Модификацию мембран осуществляли с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида («Sigma», США) по методике, описанной в [9]. Для иммобилизации олигонуклеотиды растворяли в солевом буфере (160 мМ Na^O^ 130 мМ Na2HPO4) до кон -центрации 20 мкМ и наносили роботом «XactlI™ Arrayer» («LabNEXT Inc.», США) с иглами диаметром 300 мкм на мембраны, после чего их выдерживали в термостате при 60°С в течение 30 мин.
Амплификацию генов бета-лактамаз типа TEM, SHV и СТХ-М с одновременным включением биотина в качестве метки осуществляли в процессе мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мультиплексную ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем 5 мкл 5*KAPA2G буфера М, 2 мМ хлорида магния, KAPA2G Fast ДНК-полимераза («KAPA Biosystems», США), 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-11-биотин («Fermentas», Германия), по 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров для каждой группы бета-лактамаз и 1 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе «Mastercycler gradient» («Eppendorf», Германия) по следующему протоколу: начальная денатурация при 94°С (2 мин), 20 циклов амплификации (10 с - денатурация при 94°С, 20 с - отжиг праймеров при 65°С, 5 с - элонгация при 72°С), завершающий этап элонгации при 72°С (2 мин). Горизонтальный электрофорез продуктов ПЦР проводили в 1%-м агарозном геле с использованием ТАЕ-буфера (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8,5) и добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 1,6 мкг/мл. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.
Амплифицированные и содержащие метку гены бета-лактамаз растворяли в концентрации 30 нг/мкл в реакционном буфере (40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2, pH 8,0) и добавляли ДНКазу I («Fermentas», Германия) в
количестве 0,5 мЕд на 1 нг ДНК. Фрагментацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Реакцию останавливали, добавляя 3 мМ ЭДТА и инкубируя в течение 10 мин в термостате при 65°С. Размер полученных фрагментов составлял 50-150 п.н.
Перед проведением гибридизации микрочипы отмывали ФСБТ (0,01 М К2НРО4; 0,15 М NaCl; 0,05% Твин 20; рН 7,0) 2 раза по 10 мин при комнатной температуре и блокировали в растворе 1%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1%-го казеина («Sigma», США) в ФСБ (0,01 М К2НРО4; 0,15 М NaCl; рН 7,0) при 37°С в течение 30 мин. 750 нг меченой фраг-ментированной ДНК растворяли в гибридиза-ционном буфере ^SSPE: 0,3 М NaCl; 0,02 М NaH2PO4; 0,002 М ЭДТА; рН 7,4), содержащем 1,6 пмоль/мл контрольного олигонуклеотида, меченного биотином (положительный контроль гибридизации). Микрочип помещали в гибри-дизационную смесь (300 мкл на 1 микрочип) и инкубировали в течение 1,5 ч при 45°С в термомиксере «Thermomixer comfort» («Eppendorf», Германия). После гибридизации проводили отмывку мембран ФСБТ (2 раза по 15 мин при комнатной температуре).
Для детекции результатов гибридизации микрочипы инкубировали в течение 30 мин при 37°С в растворе конъюгата стрептавидин-перок-сидаза хрена («Имтек», Россия) с концентрацией 1 мкг/мл в ФСБТ, содержащем 1% БСА. Микрочипы отмывали ФСБТ (10 мин) и ФСБ (10 мин) при комнатной температуре при перемешивании и помещали на 10 мин в субстратный раствор на основе 3,3',5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) и Н2О2 («НВО Иммунотех», Россия) с добавлением декстран сульфата натрия (Mr = 8000, «Pharmacia», Швеция) до конечной концентрации 0,5 мас.%, после чего их промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Мембранные микрочипы сканировали на сканере «Perfection V750 Pro» («Epson», Германия) при разрешении 4800 dpi. Полученные изображения (TIF) обрабатывали количественно с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0, Германия).
Результаты и обсуждение
Олигонуклеотидный микрочип для диагностики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз молекулярного класса А. В настоящее время известно 200 бета-лактамаз ТЕМ-типа, 177
бета-лактамаз SHV-типа и 170 бета-лактамаз CTX-M-типа (http://www.lahey.org/studies). В данные группы ферментов входят бета-лактамазы, имеющие различные спектры субстратной специфичности: бета-лактамазы широкого спектра, гидролизующие только пенициллины и цефало-спорины первого поколения; бета-лактамазы с таким же спектром субстратной специфичности, но устойчивые к действию классических ингибиторов сериновых бета-лактамаз (ИРТ); бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), которые наряду с пенициллинами и ранними цефалоспо-ринами обладают способностью гидролизовать цефалоспорины последних поколений и монобак-тамы; бета-лактамазы смешанного типа (СМТ) - ферменты, имеющие расширенный спектр субстратной специфичности, а также проявляющие устойчивость к ингибиторам.
Согласно литературным данным, внутри каждого типа ферментов имеется ограниченное число аминокислотных мутаций, влияющих на спектр их субстратной специфичности. Как правило, данные мутации располагаются в непосредственной близости от активного центра фермента. Для бе-та-лактамаз ТЕМ-типа установлено, что мутации E104K, R164S/H/C, G238S/D, E240K значительно расширяют спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов II-IV поколений, особенно цефтазидима. Мутации M69I/L/V, S130G, R244C/T/S/H/L/G, R275L/Q/A, N276D приводят к возникновению устойчивости ферментов к ингибиторам сериновых бета-лактамаз. Для бета-лактамаз SHV-типа известно, что мутации D179A/ N/G, G238S/A, E240K расширяют спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов II-IV поколений, особенно цефтазидима; мутации M69I, S130G, K234R приводят к возникновению устойчивости ферментов к ингибиторам серино-вых бета-лактамаз.
Все бета-лактамазы СТХ-М-типа являются БЛРС и характеризуются тем, что проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриаксона по сравнению с цефтазидимом. Однако в последнее время накапливается все больше данных о том, что продуценты СТХ-М бета-лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму вследствие аминокислотных мутаций P167T/S и D240G. Ранее нами был разработан олигонуклеотидный микрочип для идентификации генов TEM, SHV и СТХ-М бета-лактамаз и определения нуклео-тидных замен в них, являющихся причиной вышеперечисленных аминокислотных мутаций [9].
Данный микрочип позволяет идентифицировать наличие у микроорганизмов 94,8% типов генов БЛРС, 97,8% генов ИРТ бета-лактамаз и 100% генов СМТ бета-лактамаз молекулярного класса А, известных на настоящий момент. Дополнительно для идентификации на микрочипе были включены аминокислотные мутации, значимые для распознавания субтипов ферментов, широко распространенных на территории РФ: мутация L35Q в SHV бета-лактамазах, мутации A26T, V230G, E253A в бета-лактамазах подгруппы СТХ-М-2 и мутация A231V в бета-лактамазах подгруппы CTX-M-9.
Микрочип для идентификации генов БЛРС и ИРТ бета-лактамаз молекулярного класса А содержит два типа олигонуклеотидных зондов: оли-гонуклеотидные зонды для идентификации типа гена бета-лактамазы и олигонуклеотидные зонды для определения ключевых мутаций внутри каждой группы ферментов. Дизайн групп (подгрупп) специфических зондов осуществлялся на основе консервативных участков генов всех ферментов, принадлежащих к каждой группе. Для детекции нуклеотидных замен в генах, приводящих к определяемым аминокислотным мутациям, создавались наборы зондов, содержащие от 2 до 7 оли-гонуклеотидов. Последовательность одного из данных олигонуклеотидов соответствовала нукле-отидной последовательности фермента «дикого типа» (WT - wild type), являющегося родоначальником каждой группы/подгруппы бета-лактамаз (TEM-1, SHV-1, CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9). Остальные олигонуклеотиды в наборах (один или несколько) были комплементарны участкам генов, кодирующих мутантные по данной позиции формы ферментов (MT - mutant type). Последовательности таких олигонуклеоти-дов выбирались таким образом, чтобы мутантные нуклеотиды находились в центре, что увеличивает специфичность распознавания нуклеотидных мутаций. В связи с тем, что мутации в позициях бета-лактамаз 275, 276 ТЕМ, а также бета-лактамаз 238, 240 SHV близко расположены, для их определения использовали единые наборы зондов - T_275/276 и S_238/240 соответственно. Длина зондов варьировала от 18 до 28 нуклеотидов, GC-состав - от 32,1 до 76,2%, температура плавления зондов находилась в диапазоне 60,9-77,6°С. Дизайн практически всех наборов зондов, кроме С1_167 и С9_167, был выполнен по прямой цепи. Последовательности нескольких наборов зондов содержали искусственные замены в GC-богатых участках для снижения устойчивости вторичных структур
зондов или вероятности неспецифической гибридизации. Их введение в последовательности зондов Т_244, 8_234, С2_240 и С9_240 позволило значительно улучшить специфичность определения мутантных форм. Наборы зондов Т_130 и 8_35 содержали ЬНЛ-модифицированные нуклеотиды в позициях нуклеотидных мутаций. Их введение в олигонуклеотиды повысило эффективность их гибридизации с комплементарным участком ДНК-мишени. Одновременно с этим наблюдалось снижение специфичности гибридизации, однако оно было незначительным и не влияло на правильность определения типа гена.
Для изготовления микрочипа в качестве носителя использовали нитроцеллюлозу. На микрочипе площадью около 1 см2 были иммобилизованы 75 олигонуклеотидных зондов в виде трех блоков (для бета-лактамаз ТЕМ, 8НУ и СТХ-М): 7 зондов для идентификации групп/подгрупп ферментов и 68 зондов для определения мутаций в бета-лак-тамазах (8 мутаций в ТЕМ, 7 мутаций в 8НУ, 2 мутации в СТХ-М-1, 5 мутаций в СТХ-М-2 и 3 мутации в СТХ-М-9). Каждый олигонуклеотид наносился на микрочип в трех повторах. Помимо специфических зондов каждый микрочип содержал 3 типа контрольных олигонуклеотидов: контроль иммобилизации (олигонуклеотид, меченный биотином), положительный контроль гибридизации (олигонуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна меченному биотином олигонуклеотиду, добавляемому к гибридизационной смеси), отрицательный контроль гибридизации (олигонуклеотид со случайной последовательностью оснований). Во все зонды были введены дополнительные спейсе-ры на 5-конце, удаляющие зонд от поверхности носителя, что позволяет снизить стерические затруднения при гибридизации и повышает доступ-
ность зонда для ДНК-мишени. Было установлено, что оптимальным является использование спейсера из 13 тимидиновых остатков.
Процесс идентификации генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе состоял из следующих этапов (рис. 1): выделение бактериальной ДНК из клинического образца; амплификация гена бета-лактамазы в процессе мультиплексной ПЦР с одновременным включением метки; гибридизация меченной био-тином ДНК со олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа; детекция результатов гибридизации. В результате реакции гибридизации на поверхности микрочипа образуются дуплексы ДНК, меченные биотином. Биотин выявляли конъ-югатом стрептавидин-пероксидаза хрена (ПХ), которую затем детектировали колориметрически по накоплению нерастворимого окрашенного продукта ферментативной реакции. В результате в зонах микрочипа, где произошла гибридизация исследуемой ДНК, наблюдается образование окрашенных пятен.
Оптимизация условий амплификации генов бе-та-лактамаз ТЕМ-, 8НУ- и СТХ-М-типов, а также условий гибридизации и ферментативной детекции на микрочипах была выполнена с использованием контрольных охарактеризованных штаммов микроорганизмов, продуцирующих разные типы бета-лактамаз. Амплификацию всех типов генов изучаемых бета-лактамаз проводили в формате одной мультиплексной ПЦР с шестью парами прай-меров. В результате амплификации происходит синтез ПЦР-продуктов длиной 850-870 п.н., соответствующих полноразмерным генам ТЕМ, 8НУ и СТХ-М бета-лактамаз. Выход продуктов, достаточный для последующего гибридизационного анализа (750 нг ДНК), достигался за 20 циклов ПЦР. Благодаря использованию ДНК-полимеразы ново-
Рис. 1. Схема метода проведения гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе с коло-
риметической детекцией
го поколения KAPA2G Fast («KAPA Biosystems», США) существенно сократилась длительность основных стадий ПЦР, особенно стадии элонгации (5 с вместо 60 с) [10]. В результате общее время амплификации не превышало 40 мин. Для включения биотина в качестве метки в реакционную смесь добавляли биотинилированный дезоксиура-цилтрифосфат. Его концентрация была оптимизирована таким образом, чтобы на каждые 100 ну-клеотидов амплифицируемого гена встраивалось 5-7 молекул метки. Чувствительность данного метода составляла 50-100 копий гена на одну ПЦР
Скрининг клинических образцов на наличие генов бета-лактамаз молекулярного класса А. Разработанный ДНК-микрочип был использован для скрининга образцов ДНК, выделенных из внутрибольничных (n = 128) и внебольничных (n = 110) штаммов энтеробактерий в Российской Федерации. Для всех образцов была получена ДНК с 6 наборами праймеров, меченная в процессе мультиплексной ПЦР. По результатам ПЦР образцы были разделены на отрицательные и положительные по наличию или отсутствию ампликона с размером, соответствующим гену бета-лактамаз молекулярного класса А. Для каждого полученного ПЦР-продукта проведены два независимых эксперимента по гибридизации на мембранных микрочипах.
Тип гена бета-лактамаз определяли с помощью идентификационных зондов. Для определения БЛРС и отнесения их к определенной подгруппе использовали определение отдельных мутаций. Мутации во всех исследуемых позициях определялись однозначно: 90% ММ-зондов показали значения, не превышающие 0,6; для 10% ММ-зондов значения RIMM находились в диапазоне 0,6-0,7. Преимуществом разработанного метода гибридизационного анализа на микрочипах является успешная идентификация смеси генотипов бета-лактамаз, которые принадлежат не только к разным типам генов, но и к смеси двух генов, относящихся к одному генетическому типу. На рис. 2 приведены результаты тестирования двух штаммов микроорганизмов, один из которых продуцирует только пенициллиназы ТЕМ-1 и SHV-1, а другой - смесь пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и двух БЛРС (SHV-2 и CTX-M-3). Обе смеси генов ферментов достоверно определяли на микрочипе. Сравнение профилей гибридизации показывает появление двух сигналов комплементарной гибридизации в позиции S_238/240 SHV бета-лактамаз, что свидетельствует о наличии как гена фермента дикого типа SHV-1, так и гена бета-лактамазы SHV-2, имеющего мутацию в данной позиции.
Наличие гибридизационных сигналов для зондов, идентифицирующих гены ферментов подгруппы СТХ-М-1 и мутации в них, подтвердили продукцию фермента СТХ-М-3 во втором образце.
Результаты идентификации различных субтипов бета-лактамаз молекулярного класса А, полученные при скрининге ДНК внутрибольничных и внебольничных штаммамов энтеробактерий на микрочипах с ферментативной детекцией, представлены на рис. 3. В выборках внутрибольнич-ных и внебольничных возбудителей гены бета-лактамаз были выявлены в 125 и 103 образцах соответственно.
В выборке внутрибольничных инфекций 72,0% из 125 штаммов содержали гены ТЕМ-бета-лактамаз, 53,6% - гены SHV-бета-лактамаз и 87,2% - гены бета-лактамаз СТХ-М-типа, в выборке внебольничных инфекций 64,0% из 103 штаммов содержали гены ТЕМ-бета-лактамаз, 35,0% -гены SHV-бета-лактамаз и 92,0% - гены бета-лак-тамаз СТХ-М-типа. Распределение по подгруппам у СТХ-М-бета-лактамаз было следующим: у внутрибольничных возбудителей: blaCTX-M-1 (81,6%), blaCTX-M-2 (3,7%) и blaCTX-M-9 (14,7%); у внебольнич-
ных возбудителей: blaCTX-M-1 (90,5%) и blaCTX-M-9 (9,5%). CTX-M-1 CTX-M-9
Результаты тестирования клинических образцов совпадают с ситуацией, актуальной для России (исследование РЕВАНШ, проводимое НИИ Антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии, 2007 г.). Среди БЛРС в значительной степени преобладают бета-лактамазы СТХ-М-типа. Следует отметить высокую распространенность бе-та-лактамаз широкого спектра, особенно бета-лактамазы TEM-1 (73,6 и 64,1% у внутриболь-ничных и внебольничных штаммов соответственно). Этот факт еще раз подтверждает, что для диагностики типа антибиотикорезистент-ности недостаточно проводить идентификацию гена бета-лактамазы на уровне групповой принадлежности, необходимо определять наличие ключевых мутаций, влияющих на субстратную специфичность ферментов.
Бета-лактамаза типа CTX-M-15 является преобладающей БЛРС в России. Данная тенденция наблюдается среди как внутрибольничных, так и внебольничных штаммов энтеробактерий. В нашем исследовании 60% генов БЛРС идентифицировались как СТХ-М-15 (в пределах группы СТХ-М-бета-лактамаз доля СТХ-М-15 составляла 85%).
По данным исследований, SHV-12 - это самый частый вариант группы БЛРС SHV-типа
Рис. 2. Вид микрочипа и результат гибридизации 750 нг ДНК, амплифицированной из штамма: а, б - Escherichia coli (продуцента бета-лактамаз ТЕМ-1 и SHV-1), в, г - Klebsiella pneumoniae (продуцента бета-лактамаз ТЕМ-1, SHV-1, SHV-2 и CTX-M-3). Представлены только интенсивности сигналов гибридизации, значимо отличавшиеся
от фонового сигнала
Рис. 3. Комбинации различных субтипов бета-лактамаз молекулярного класса А, продуцируемых внутрибольничными и внебольничными штаммами энтеробактерий, выявленные при скрининге на
микрочипах с ферментативной детекцией
у возбудителей внутрибольничных инфекций, главным его продуцентом являются штаммы K. pneumoniae. Мы наблюдали такую же тенденцию: 85% генов БЛРС SHV-типа у образцов ДНК внутрибольничных штаммов идентифицировались как SHV-12.
Сравнение результатов тестирования генов бета-лактамаз у разных возбудителей показывает, что у внебольничных возбудителей наиболее часто идентифицированы гены бета-лактамаз подгруппы СТХ-М-1 (либо индивидуально, либо в сочетании с генами бета-лактамаз ТЕМ-1 и SHV-1). Случаев выявления одновременно двух бета-лактамаз БЛРС-типа у внебольничных возбудителей не отмечено. У внутрибольничных возбудителей идентифицировано существенно более разнообразное сочетание генов различных бета-лактамаз: сочетание бета-лактамаз расширенного и широкого спектра отмечено в 62% случаев, одновременное присутствие БЛРС двух различных типов - в 18% случаев.
Методика гибридизационного анализа на микрочипах позволила провести экспресс-анализ Работа выполнена при финансовой п
(проект №
микроорганизмов на наличие генов БЛРС и/ или ИРТ бета-лактамаз молекулярного класса А. Весь анализ занимает не более 4 ч (0,5 ч -выделение бактериальной ДНК; 0,7 ч - амплификация генов бета-лактамаз с одновременным включением метки; 0,3 ч - фрагментация полученных ПЦР-продуктов; 1,5 ч - гибридизация с последующей отмывкой; около 1 ч - колориметрическая детекция результатов гибридизации). Для сравнения - фенотипическое определение продукции БЛРС занимает 24-48 ч и больше зависит от типа бактериальной культуры.
Таким образом, метод гибридизационного анализа на микрочипах с ферментативной детекцией применен для скрининга ДНК возбудителей внутри- и внебольничных инфекций на наличие генов бета-лактамаз. Показаны преимущества данного метода для экспресс-идентификации генов, обусловливающих устойчивость возбудителей к бета-лактамным антибиотикам. Выявлены сходство и различие в генах бета-лактамаз, выявляемых у возбудителей внутри- и внебольничных инфекций.
юддержке Российского научного фонда
15-14-00014).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Carlet J., Collignon P., Goldmann D., Goosens H., Gys-sensI.C. et al. // Lancet. 2011. Vol. 378. P. 369.
2. Baquero, F., Tedim, A.P., Coque, T.M. // Front Microbiol. 2013. Vol. 4. Р. 1.
3. Antimicrobial Resistance Global Report on surveillance 2014 World Health Organization (http://www.who.int/ drugresistance/en/)
4. Van der Bij A., Pitout J.D.D. // J. Antimicrob. Chemother. 2012. Vol. 67. P. 2090.
5. Tang S., ApisarnthanarakA., Hsu L.Y. // Adv. Drug Delivery Rev. 2014. Vol. 78. P. 3.
6. Rodríguez-Baño J., Alcalá J.C., Cisneros J.M., Grill F., Oliver A. et al. // Arch. Intern. Med. 2008. Vol. 168. P. 1897.
7. Kresken M., Pfeifer Y., Hafner D., Wresch R. et al. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2014. Vol. 44. P. 295.
8. Bush K. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2013. Vol. 1277. P. 84.
9. RubtsovaM.Yu., UlyashovaM.M., EdelsteinM.V., Egorov A.M. // Biosens. Bioelectron. 2010. Vol. 26. P. 1252.
10. Pobolelova, Yu.I., Ulyashova, M.M., Rubtsova, M.Yu., and Egorov, A.M. // Biochemistry (Moscow). 2014. Vol. 79. P. 566.
Поступила в редакцию 01.03.16
SCREENING OF BACTERIAL GENES RESPONSIBLE FOR RESISTANCE TO BETA-LACTAM ANTIBIOTICS USING MICROARRAYS WITH ENZYMATIC DETECTION
M.M. Ulyashova, G.V. Presnova, Yu.I. Pobolelova, A.A. Filippova, A.M. Egorov, M.Yu. Rubtsova*
(Enzymology Division, Chemistry Department, M.V Lomonosov Moscow State University; *e-mail: mrubtsova@gmail.com)
The method of hybridization analysis on microarrays with enzymatic detection based on horseradish peroxidase was applied for screening the pathogens of nosocomially-acquired and community-acquired infections for the presence of genes of beta-lactamases, causing resistance to beta-lactam antibiotics. The advantages of this method for the rapid identification of genes were shown. Similarities and differences in the distribution of beta-lactamase genes for nosocomially-acquired and community-acquired infections were revealed. The most common ESBL type was CTX-M type of beta-lactamases. The high prevalence of beta-lactamase TEM-1 was detected. Beta-lactamase subgroup CTX-M-1 alone or in combination with genes of beta-lactamases TEM-1 and SHV-1 was most frequently identified for community-acquired infections. No cases of simultaneous detection of multiple ESBLs for community-acquired pathogens have been detected. Much more varied combinations of beta-lactamases were identified for nosocomially-acquired infections: a combination of ESBL and other beta-lactamases - in 62% of strains, the simultaneous presence of two different types of ESBLs - in 18% of strains.
Key words: beta-lactamases, microarrays, hybridization, colorimetric detection, horseradish peroxidase.
Сведения об авторах: Уляшова Мария Морисовна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (mmulyashova@gmail.com); Преснова Галина Васильевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (gpresnova@gmail.com); Поболелова Юлия Илдаровна - аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (pobolelovayulia@gmail. com); Филиппова Анна Андреевна - студентка химического факультета МГУ (iiffii@mail.ru); Егоров Алексей Михайлович - гл. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. биол. наук (alex.m.egorov@gmail.com); Рубцова Майя Юрьевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (mrubtsova@gmail.com).
