CC BY
20
УДК 577.113.5, 577.151.4
ДНК-МИКРОЧИПЫ НА ПОРИСТЫХ МЕМБРАННЫХ НОСИТЕЛЯХ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ М.М. Уляшова, Ю.Ю. Рябова, М.Ю. Рубцова, А.М. Егоров
(кафедра химической этимологии; e-mail: mmulyashova@gmail.com)
Разработана технология ДНК-микрочипов на пористых мембранных носителях с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена. Проведено сравнение способов иммобилизации олигонуклеотидов на мембранах разной химической природы, оптимизированы условия колориметрической детекции биотина в составе ДНК-дуплексов на поверхности микрочипов. Возможность использования разработанного метода показана на примере определения типа генов р-лактамаз расширенного спектра.
Ключевые слова: ДНК-микрочипы, гибридизационный анализ, иммобилизация олигонуклеотидов, пероксидаза хрена, в-лактамазы расширенного спектра.
В последнее время одним из интенсивно развивающихся направлений ДНК-диагностики становится использование ДНК-микрочипов для анализа нуклео-тидных последовательностей. Основным преимуществом этих методов является возможность одновременного анализа образца по нескольким параметрам при минимальном расходе анализируемого материала и реагентов. Сейчас ДНК-микрочипы становятся эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований, таких, как идентификация генов, определение уровня их экспрессии, исследование генетического полиморфизма ДНК [1-2].
ДНК-микрочип представляет собой небольшую по площади поверхность носителя с иммобилизованными в определенном порядке короткими олигонуклеотид-ными зондами или фрагментами молекул ДНК. Исследуемая ДНК, в которую предварительно вводится метка, гибридизуется с ДНК-зондами на поверхности микрочипа. В случае комплементарности первичных последовательностей образуются ДНК-дуплексы, которые можно обнаружить по появлению аналитических сигналов. Большая часть разработанных к настоящему времени ДНК-микрочипов основана на использовании в качестве подложек стеклянных пластин с химически модифицированной поверхностью и флуоресцентных красителей в качестве меток [3-4]. Это обеспечивает необходимую чувствительность анализа, кроме того, сканирование и обработка результатов производятся сразу после стадии гибридизации. Однако высокая стоимость подложек данного рода, флуоресцентных меток и особенно оборудования для регистрации
флуоресценции препятствуют использованию технологии ДНК-микрочипов в клинической практике.
Цель данной работы - создание технологии ДНК-микрочипов на пористых мембранных носителях с колориметрической детекцией на основе пероксидазы хрена (ПХ). В задачи исследования входили сравнительное изучение иммобилизации олигонуклеотидов на мембранных носителях разной химической природы, а также оптимизация условий выявления биотина в составе ДНК-дуплексов на поверхности микрочипа. Возможность использования разработанного метода изучалась на примере определения типа генов р-лак-тамаз расширенного спектра (БЛРС). Продукция данных ферментов - один из наиболее распространенных и клинически значимых механизмов резистентности патогенных микроорганизмов к современным Р-лак-тамным антибиотикам [5]. В настоящий момент насчитывается около 400 различных БЛРС, большая часть которых относится к ферментам ТЕМ-, 8ИУ- и СТХ-М-групп. Определение наличия и типа продуцируемой Р-лактамазы является одним из этапов скрининга инфекционных штаммов микроорганизмов на антибиотикорезистентность.
Экспериментальная часть
Набор праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амино-модифицированные олигонуклео-тидные зонды были синтезированы фирмой "Син-тол" (Россия). Образцы ДНК, выделенные из клинических штаммов энтеробактерий-продуцентов БЛРС, предоставлены сотрудниками НИИ антимикробной химиотерапии СГМА (г. Смоленск, Россия).
В работе использовали следующие мембраны: «Biodyne A» (найлон), «Biodyne C» (отрицательно активированный найлон), «BioTrace NT» (нитроцеллюлоза) («Pall Corporation», США). Модификация мембран осуществлялась с помощью 1-этил-3-(3-диметила-минопропил)карбодиимида («Sigma», США) по методике, описанной в [6]. Для синтеза конъюгатов биотина с пероксидазой хрена (Rz = 3,0; «Яринвест», Россия) мы использовали следующие производные биотина: N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, N-гидроксисукцинимидный эфир биотинамидогексановой кислоты, N-гидроксисукцинимидный эфир биотинами-догексаноил-6-аминогексановой кислоты («Sigma», США); синтез проводили согласно методике [7].
Для иммобилизации олигонуклеотиды растворяли в солевом буфере (160 мМ Na2SO4, 130 мМ Na2HPO4) до нужной концентрации и наносили роботом «XactlI™ Array er» («LabNEXT Inc.», США) с иглами диаметром 300 мкм на мембраны, после чего мембраны инкубировали в термостате при 60°С в течение 30 мин.
Мультиплексную ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем 10 мМ Трис-НС1 (рН 8,3), 2,5 мМ ацетата магния, 50 мМ KCl, 2,5 ед. Taq ДНК полимера-зы, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-11-биотин («Fermentas», Германия), по 0,8 мкМ прямого и обратного праймера для каждой группы ß-лактамаз и 1 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе «Mastercycler gradient» (««Eppendorf», Германия) по следующей схеме: начальная денатурация при 94°С (2 мин), 25 циклов амплификации (20 с - денатурация при 94°С, 30 с - отжиг праймеров при 65°С, 1 мин -элонгация при 72°С), завершающий этап элонгации при 72°С (6 мин). Горизонтальный электрофорез продуктов ПЦР проводили в 1%-м агарозном геле с использованием ТАЕ-буфера (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА; рН 8,5) и добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 1,6 мкг/мл. Визуализацию проводили на УФ-трансил-люминаторе при длине волны 260 нм.
Перед проведением гибридизации микрочипы отмывали ФСБТ* (0,01 М К2НРО4; 0,15 М NaCl; 0,05% Твин 20; рН 7,0) 2 раза по 10 мин при комнатной температуре и блокировали в растворе 1%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1%-го казеина («Sigma», США) в ФСБ** (0,01 М К2НРО4; 0,15 М NaCl; рН 7,0) при 37°С в течение 30 мин. Необходи-
мые количества меченой ДНК (концентрацию оценивали спектрофотометрическии при l = 260 нм на спектрофотометре «Shimadzu», Япония) растворяли в гибридизационном буфере (2'SSPE: 0,3 М NaCl; 0,02 М NaH2PO4; 0,002 М ЭДТА; рН 7,4), содержащем 1,6 пмоль/мл контрольного олигонуклеотида, меченного биотином (положительный контроль гибридизации). Микрочип помещали в гибридизационную смесь (300 мкл на 1 микрочип) и инкубировали в течение 3 ч при 45° С в термомиксере «Thermomixer comfort» («Eppendorf», Германия). После гибридизации проводили отмывку мембран ФСБТ - 2 раза по 15 мин при комнатной температуре.
Для детекции результатов гибридизации микрочипы инкубировали в растворе стрептавидина (0,2 мкг/мл) в ФСБТ, содержащем 1% БСА, в течение 30 мин при 37°С. Затем мы проводили отмывку (ФСБТ - 10 мин при 37°С) и инкубацию с раствором конъюгата био-тин-ПХ в ФСБТ (разведение 1/8000) в течение 30 мин при 37°С. Затем мембраны снова отмывали (ФСБТ - 10 мин, ФСБ - 10 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании) и помещали в субстратный раствор на основе 3,3,5,5-тетраметил-бензидина (ТМБ) и Н2О2 («НВО Иммунотех», Россия) с добавлением декстран сульфата натрия (Mr = 8000, «Pharmacia», Швеция) до конечной концентрации 0,5% (по массе) на 10 мин при комнатной температуре. После этого мембраны промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе. Мембранные микрочипы сканировали на сканере «Perfection V750 Pro» («Epson», Германия) при разрешении 4800 dpi. Полученные изображения (в формате TIF) обрабатывали количественно с использованием программы «Scan Array Express» («PerkinElmer», version 3.0, Германия).
Результаты и их обсуждение
Выбор типа мембранного носителя для иммобилизации олигонуклеотидов
Одна из основных задач при разработке мембранного ДНК-микрочипа - подбор типа мембранного носителя и способа иммобилизации олигонуклеотидов на его поверхности. Мы провели сравнение различных методов иммобилизации, включая нековалентную иммобилизацию методом физической адсорбции на нитроцеллюлозе и разных типах найлона, а также ко-валентную иммобилизацию на тех же типах мембран, модифицированных 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-
*Фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,05% Tween 20; **фосфатно-солевой буферный раствор.
карбодиимидом (ББС). Для этого были изготовлены микрочипы, содержащие олигонуклеотид, меченный биотином
(МН2-ТТТТТТТТТТТТТТСТАОАСАОССАСТСАТА-биотин)
в разных концентрациях (от 0,02 до 10,0 пмоль/мкл). Для выявления молекул биотина микрочипы инкубировали сначала в растворе стрептавидина, а затем - в растворе конъюгата биотин-ПХ. После отмывки мы проводили колориметрическое определение ферментативной активности ПХ по накоплению окрашенного продукта на носителе. Интенсивность окраски образующегося пятна была пропорциональна концентрации фермента и соответственно количеству иммобилизованных молекул меченого олигонуклеотида.
На рис. 1 приведены кривые адсорбции меченного биотином олигонуклеотида на различных мембранах. Максимальное количество иммобилизованного олиго-нуклеотида наблюдалось при использовании методов ковалентной иммобилизации на нитроцеллюлозе и отрицательно активированном найлоне, модифицированных ББС. Это объясняется высокой плотностью находящихся на их поверхности электрофильных групп. Они легко активируются ББС с образованием промежуточного соединения, которое, будучи нестабильным, может активно реагировать с нуклеофильными группами олигонуклеотидов. Физическая адсорбция на тех же типах носителей происходит менее эффективно. При использовании отрицательно активированного найлона мы практически не наблюдали иммобилизацию олигонуклеотида, что можно объяснить сильным электростатическим отталкиванием его сахаро-фосфатного остова от отрицательно заряженной поверхности носителя. Модификация нативного найлона не приводила к увеличению концентрации олигонукле-отида на носителе, что, по-видимому, связано с низ-
Рис. 1. Кривые адсорбции меченного биотином олигонуклеотида на различных мембранных носителях: 1 - нитроцеллюлоза + ЕБС, 2 - отрицательно активированный найлон + ЕБС, 3 - нитроцеллюлоза, 4 - найлон, 5 - найлон + ЕБС, 6 - отрицательно активированный найлон
кой плотностью карбоксильных групп на его поверхности.
Помимо эффективности иммобилизации олигонук-леотидов на поверхности мембран, обеспечивающей величину аналитического сигнала, в технологии ДНК-микрочипов важен диаметр точек (ячеек), получаемых при нанесении. Наименьший диаметр точек (350 мкм) наблюдался на нитроцеллюлозе, что связано с меньшей пористостью и смачиваемостью материала данного типа. Поэтому именно нитроцеллюлоза была выбрана в качестве носителя для производства мембранных ДНК-микрочипов с колориметрической детекцией.
Оптимизация колориметрической детекции биотина на поверхности нитроцеллюлозы
Одним из наиболее важных параметров, определяющих чувствительность гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе, является чувствительность детектирующей системы. После проведения гибридизации на поверхности мембранного чипа образуются двухцепочечные комплексы ДНК, меченные биотином. Поэтому на следующей стадии необходимо было разработать высокочувствительную систему детекции биотина на поверхности нитроцеллюлозы. Оптимизацию системы детекции мы также проводили на микрочипах, содержащих на своей поверхности меченный биотином олигонуклеотид, наносимый из раствора с концентрацией 2,5 пкмоль/мкл. Необходимо отметить, что использование конъюгата стрепта-видин-ПХ для выявления меченной биотином ДНК на поверхности нитроцеллюлозы оказалось невозможным из-за высокого фонового окрашивания. Поэтому для выявления биотина мы использовали двухстадий-ную схему выявления биотина сначала стрептавиди-ном, а затем биотинилированной ПХ.
Первым шагом оптимизации детектирующей системы был подбор рабочей концентрации стрептави-дина. Для этого микрочипы после гибридизации инкубировали в растворах, содержащих разные концентрации белка (от 0,025 до 1 мкг/мл). Критерием выбора рабочей концентрации стрептавидина служила интенсивность и четкость окраски зоны детекции. В качестве оптимальной для проведения анализа на микрочипах была выбрана концентрация стрептавидина 0,2 мкг/мл, так как при больших концентрациях наблюдался высокий уровень неспецифического связывания белка, приводящий к очень сильному фоновому окрашиванию, а при более низких концентрациях уменьшалась интенсивность окраски зоны детекции.
Рис. 2. Кривые титрования комплекса стрептавидина с иммобилизованным на поверхности микрочипа олигонуклео-тидом конъюгатами биотина с ПХ: 1 - ПХ-С12-Бт, 2 - ПХ-С6-Бт, 3 - ПХ-Бт
При оптимизации стадии взаимодействия стрептавидина с биотинилированной ПХ были синтезированы три типа конъюгатов ПХ с биотином: ПХ, непосредственно связанная с биотином (ПХ-Бт), ПХ, связанная с биотином через ножку из аминокапроновой кислоты (ПХ-С6-Бт), и ПХ, связанная с биотином через ножку из двух молекул аминокапроновой кислоты (ПХ-С12-Бт). Концентрация ПХ в полученных ра-
12 -5
створах конъюгатов составляла 1,5x10 М. Сравнение полученных конъюгатов проводили при титровании ими комплекса стрептавидина с иммобилизованным олигонуклеотидом на поверхности микрочипов.
Кривые титрования представлены на рис. 2. Максимальная интенсивность окраски ячеек микрочипа для всех разведений наблюдалась в случае использования конъюгата, в котором ПХ биотинилирована через ножку из двух молекул аминокапроновой кислоты (ПХ-С12-Бт). В этом случае, по-видимому, увеличивается подвижность фермента на фазе и активный центр более доступен для взаимодействия с молекулами субстрата. Поэтому для дальнейших исследований мы использовали именно этот конъюгат в разведении 1/8000.
Гибридизационный анализ на мембранных микрочипах с колориметрической детекцией для определения генов БЛРС
ДНК-микрочип для идентификации основных типов БЛРС представляет собой нитроцеллюлозную подложку размером 3,5x9,0 мм, на которой в определенном порядке иммобилизованы олигонуклеотиды с уникальными нуклеотидными последовательностями, специфичными к различным участкам генов БЛРС типов ТЕМ, 8ИУ и СТХ-М (таблица). Выбор последовательности олигонуклеотида для идентификации определенной группы БЛРС мы проводили на основе выравнивания кодирующих последовательностей генов всех ферментов этой группы, при этом определялись консервативные участки, не имеющие гомологии с генами Р-лактамаз других групп. На основе их последовательностей синтезировались олигонуклеотидные
Рис. 3. Расположение олигонуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе для идентификации типа генов, кодирующих БЛРС (а); результаты тестирования образца, содержащего гены Р-лактамаз групп ТЕМ и СТХ-М-1, на мембранном ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией (б)
Последовательности олигонуклеотидных проб для идентификации генов БЛРС и праймеров для мультиплексной П11Р
Название Нуклеотидная последовательность, 5'^3' Длина, нуклеотиды Т °С 1 ил? ^
Контроль иммобилизации КН2-ТТТТТТТТТТТТТТСТАОАСАОССАСТСАТА-биотин 18 52
Положительный контроль гибридизации КН2-ТТТТТТТТТТТТТОАТТООАСОАОТСАООАОС 19 60
Отрицательный контроль гибридизации КН2-ТТТТТТТТТТТТТТСТАОАСАОССАСТСАТА 18 52
я « я н __ группа ТЕМ КН2-ТТТТТТТТТТТССАОАААСОСТООТОАААОТА 21 62
группа 8НУ КН2-ТТТТТТТТТТТТТОТТОАТССОСТССОТОСТО 19 60
группа СТХ-М КН2-ТТТТТТТТТТТТТАТАТСОСООТОАТСТООСС 19 58
и ю 5 о ? а подгруппа СТХ-М-1 ЫН2-ТТТТТТТТТТТТТСАСССАОССТСААССТАА 18 56
Ь с я о подгруппа СТХ-М-2 КН2-ТТТТТТТТТТТТТТТАСССААССООАОСАОА 18 56
я ч о подгруппа СТХ-М-8 КН2-ТТТТТТТТТТТТТСАСССАОССАОАОСАОАА 18 58
подгруппа СТХ-М-9 КН2-ТТТТТТТТТТТТТТАСССАОССОСААСАОА 17 56
группа ТЕМ прямой АТОАОТАТТСААСАТТТССОТОТС 24 70
обратный ТТААТСАОТОАООСАССТАТСТС 23 70
группа 8НУ прямой ОССОООТТАТТСТТАТТТОТСОС 23 72
обратный аТТАССОТТОССАОТаСТСа 20 69
подгруппа СТХ-М-1 прямой АТООТТААААААТСАСТОСОССАО 24 72
а ^ обратный ССОТСааТОАСаАТТТТАаССа 22 73
« Й р подгруппа СТХ-М-2 прямой АТОАТОАСТСАСАОСАТТСОСС 22 70
С обратный ССОТаааТТАСОАТТТТСаССа 22 73
подгруппа СТХ-М-8 прямой AтаAтаAаACATcаcаттAAаc 22 66
обратный ccатcаатаAcаATтттcаcа 21 70
подгруппа СТХ-М-9 прямой аатаACAAAаAаAатаcAAcаа 22 72
обратный СССТТСООСОАТОАТТСТСОС 21 72
пробы, каждая из которых иммобилизовалась на поверхности микрочипа в пяти повторах (рис. 3, а). Каждый микрочип содержал три типа контрольных олигонуклеотидов: 1) контроль иммобилизации (олиго-нуклеотид, меченный биотином); 2) положительный контроль гибридизации (олигонуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна меченному биотином олигонуклеотиду, добавляемому к гиб-ридизационной смеси); 3) отрицательный контроль гибридизации (олигонуклеотид со случайной последовательностью оснований). Определение наличия генов БЛРС в образцах методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе состояло из следующих этапов: 1) амплификация гена Р-лактамазы из клинического материала в процессе мультиплексной ПЦР с набором праймеров (таблица), для введения молекул биотина в амплифицируемый ген часть дезокситими-динтрифосфата ^ТТР) в реакционной смеси заменяли на меченный биотином дезоксиурацилтрифосфат
(ШТР-11-биотин); 2) гибридизация меченной биоти-ном ДНК со специфическими олигонуклеотидами на поверхности микрочипа; 3) детекция результатов гибридизации с помощью системы стрептавидин-биоти-нилированная ПХ с последующей колориметрической детекцией фермента. Изображение микрочипа после гибридизации с генами Р-лактамаз групп ТЕМ и СТХ-М-1 приведено на рис. 3, б.
Последовательности олигонуклеотидных проб для идентификации генов БЛРС и праймеров для мультиплексной ПЦР
В ходе работы нами были подобраны оптимальные условия проведения гибридизации. В качестве гибри-дизационного буфера был выбран 2х88РЕ с добавлением 0,2%-го додецилсульфата натрия для улучшения смачиваемости мембраны. При выборе температуры основным критерием являлось то, что она не должна превышать температуру плавления (Т) олигонуклео-
тидных зондов, однако резко понижать ее нельзя, так как при этом теряется специфичность анализа. Из исследуемого диапазона температур (42-52°С) в качестве оптимальной была выбрана температура 45°С. Оптимизация времени гибридизации была проведена в диапазоне от 0,5 до 4,0 ч. Было показано, что реакция гибридизации меченной биотином ДНК с имеющимся набором олигонуклеотидов на мембранном микрочипе достигает равновесного режима, при котором наблюдается максимальная чувствительность анализа, в течение 3 ч после начала (при интенсивном перемешивании). Однако следует отметить, что при переходе в кинетический режим (продолжительность гибридизации 1,5 ч) происходит лишь незначительное снижение величины аналитического сигнала с сохранением специфичности гибридизации, что позволяет достоверно идентифицировать наличие генов (ТЕМ, 8ИУ и СТХ-М) Р-лактамаз в гибридизацион-ной смеси. Это актуально при необходимости проведения экспресс-анализа.
На мембранном ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, для идентификации основных групп БЛРС была проведена оценка воспроизводимости результатов и чувствительности метода. Для этого в серии экспериментов изучали зависимость интенсивности окраски определенных ячеек микрочипа от концентрации соответствующего гена БЛРС в гиб-ридизационной смеси. Предел обнаружения изменялся в диапазоне от 0,20 до 0,92 нг/мкл меченой ДНК, а коэффициент вариации находился в интервале от 4 до 11% в зависимости от типа определяемого гена БЛРС, что свидетельствует о хорошей чувствительности и воспроизводимости разработанного метода. Кроме того, проведение анализа не требует дорогостоящих реагентов и оборудования, детекция результатов осуществляется на оптическом сканере или визуально, что делает метод ДНК-микрочипов более доступным для клинической медицины.
CnHCOK HHTEPATyPM
1. Bilitewski U. // Methods Mol. Biol. 2009. 509. P. 1.
2. Bier F.F., Nickisch-RosenegkM., Ehrentreich-Forster E. et al. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2008. 109. P. 433.
3. Heise C., Bier F.F. // Top Curr. Chem. 2006. 261. P. 1.
4. Chee M., YangR., HubbellE. et al. // Science. 2001. 274. P. 610.
5. Сидоренко C.B., Тишков В.И. // Усп. биол. хим. 2004. 44. С. 263.
6. Zhang Y., Coyne M.Y., Will S.G. et al. // Nucleic Acids Res. 1991. 19. P. 3929.
7. Bayer E.A., WilchekM. // Methods Enzymol. 1990. 184. P. 138.
Поступила в редакцию 20.01.10
DNA-MICROARRAYS ON POROUS MEMBRANE SUPPORTS WITH COLORIMETRIC DETECTION
M.M. Ulyashova, Yu.Yu. Ryabova, M.Yu. Rubtsova, A.M. Egorov
(Division of Chemical Enzymology)
The technology of DNA-microarrays on porous membrane supports with colorimetric detection based on horseradish peroxidase was developed. The comparison of the methods of oligonucleotide immobilization on chemically different membranes was carried out, the conditions of colorimetric detection of biotin in DNA duplexes on microarray surface were optimized. The method developed was applied for determining type of genes encoding extended-spectrum p-lactamases.
Key words: DNA-microarrays, hybridization analysis, oligonucleotide immobilization, horseradish peroxidase, extended-spectrum beta-lactamases.
Сведения об авторах: Уляшова Мария Морисовна — аспирантка кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (mmulyashova@gmail.com); Рябова Юлия Юрьевна - студентка химического факультета МГУ; Рубцова Майя Юрьевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (mrubtsova@gmail.com); Егоров Алексей Михайлович - глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, академик РАМН, профессор, докт. биол. наук (alex.m.egorov@gmail.com).
