Системный тромболизис и Маркеры эндотелиальной дисфункции при остром инфаркте миокарда Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

СИСТЕМНЫЙ ТРОМБОЛИЗИС И МАРКЕРЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ

ДИСФУНКЦИИ ПРИ ОСТРОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

О. С. Бахметьева

Красноярская государственная медицинская академия им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. - д.м.н., проф. А. Б. Салмина; кафедра поликлинической и семейной медицины с курсом ПО, зав. - д.м.н., проф. М.М.Петрова. Научные руководители

проф. А.Б. Салмина, проф. М.М. Петрова.

Резюме. В статье рассматривается изменение экспрессии и активности СБЗв/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных с острым инфарктом миокарда. Исследовали экспрессию фермента СБЗв нейтрофилами периферической крови и ее роль в развитии эндотелиальной дисфункции при остром инфаркте миокарда. Обнаружили увеличение экспрессии СБЗв нейтрофилами периферической крови на фоне уменьшения активности АДФ-рибозилциклазы у больных с острым инфарктом миокарда и модуляцию экспрессии/активности фермента при системном тромболизисе.

Ключевые слова: СБЗв, АДФ-рибозилциклаза, нейтрофил, острый инфаркт миокарда.

Последние годы ознаменовались интенсивным развитием фундаментальных и клинических исследований, посвященных изучению роли сосудистого эндотелия в генезе сердечно-сосудистых заболеваний. В 1998 году после получения Нобелевской премии в области медицины Феридом Мурадом, Робертом Фуршготом и Луисом Игнарро была создана теоретическая основа для нового направления медицинской науки - изучение дисфункции эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и поиск способов ее эффективной коррекции. В качестве доступной модели изучения степени выраженности эндотелиальной дисфункции можно рассматривать нейтрофилы

периферической крови, которые отвечают всем следующим необходимым условиям: обладают высокой чувствительностью к действию апоптотических и активационных факторов, являются субстратом иммунного ответа; популяция нейтрофилов обладает динамичностью в связи с относительно непродолжительным пребыванием в системном кровотоке нейтрофилов; а так же участие нейтрофилов в инициации повреждения клеток- мишеней и формировании эндотелиальной дисфункции [1]. Кроме того нейтрофилы периферической крови секретируют ряд провоспалительных цитокинов: ИЛ-1 в, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, участвующих в запуске воспалительной реакции.

Нейтрофилы чрезвычайно чувствительны к стимулирующим воздействиям и быстро мигрируют в очаг воспаления. Так при остром инфаркте миокарда нейтрофилы уже к концу первых суток накапливаются на периферии некроза. Локальная деструкция тканей в результате повреждения ведет к протеолизу белков и появлению пептидов, являющихся химическими стимулами для направленного движения нейтрофилов. Их скопления образуют демаркационную зону между живой и погибшей тканью [7,4]. Один из механизмов реализации феномена дыхательного взрыва в нейтрофилах, сопряженного с увеличением активности НАДФН-оксидазы, и процесса их направленной миграции является изменение внутриклеточной концентрации кальция.

Молекула СБ38 - это бифункциональный рецептор-фермент с молекулярной массой 46 кД, участвующий в передаче внутриклеточной сигнальной информации, а также в межклеточной коммуникации в клетках различной природы [4,5]. Основным продуктом каталитической активности СБ38 является циклическая АДФ-рибоза, выполняющая функцию мобилизатора кальция из внутриклеточных депо в цитозоль. Спектр экспрессии СБ38 достаточно широк и включает в себя клетки крови, центральной нервной системы, поджелудочной железы, кардиомиоциты и др. [2,7]. Показано, что взаимодействие СБ38, экспрессированного на клетках лимфоцитарно-лейкоцитарного звена, и СБ31, экспрессированного на эндотелиоцитах, представляет собой один из

механизмов роллинга лейкоцитов, сопровождающего физиологические и патофизиологические события на поверхности эндотелия [5,8]. В последние годы появились данные о роли СБ38/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности ряда клеток, в том числе нейтрофилов, однако данные об особенностях экспрессии и проявления активности СБ38 в этих клетках при остром инфаркте миокарда отсутствуют.

Цель исследования: дать оценку патогенетической обоснованность

применения тромболитиков и ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента с точки зрения модуляции ими СБ38/СБ31 взаимодействий в эндотелии у больных острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни.

Материалы и методы

Было проведено обследование больных обоего пола в возрасте от 40 до 65 лет с острым инфарктом миокарда (ОИМ) на фоне гипертонической болезни. Все больные, участвовавшие в исследовании, находились на стационарном лечении в Красноярской городской клинической больнице № 6 им. Н.С. Карповича, в кардиологическом отделении. Каждая группа больных оценивалась в динамике на первые и четырнадцатые сутки развития острого инфаркта миокарда.

Получали стандартную медикаментозную терапию 10 больных, дозировка препаратов подбиралась индивидуально (ингибитор ангиотензин-превращающего фермента - эналаприл, в-блокаторы - атенолол, эгилок, мочегонные препараты - гипотиазид, фуросемид, антикоагулянты - гепарин, дезагреганты - ацетилсалициловая кислота, нитраты - кардикет, изокет) и дополнительно - тромболитическую терапию стрептокиназой (150000 ЕД) (группа ТЛТ).

Первую сравнительную группу составили 30 больных ОИМ, получавшие стандартную медикаментозную терапию, но без тромболитической терапии стрептокиназой (сравнительная).

Вторую контрольную группу (контрольная группа II) составили больные: 10 женщин и 20 мужчин соответствующего возраста, без сердечно-сосудистой патологии, не страдающие артериальной гипертензией и не имеющие в анамнезе сосудистых катастроф, проходившие дополнительную диспансеризацию в рамках Национального проекта «Здоровье» на базе МУЗ ГП №2 (п=30).

Из исследования были исключены больные с ОИМ, развившимся на фоне симптоматической артериальной гипертонии или при отсутствии гипертензионного анамнеза; с ОИМ, развившимся на фоне гипотонии; пациенты с ОИМ, осложненным кардиогенным и аритмогенным шоком, отеком легких, и страдающие тяжелой сопутствующей патологией, такой, как онкологические заболевания, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническая почечная недостаточность, системные заболевания соединительной ткани, хроническая ревматическая болезнь, а также с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями.

Клинические методы исследования заключались в общеклиническом и кардиологическом осмотрах. Учитывались данные анамнеза, наследственность, перенесенные ранее и сопутствующие заболевания, метеочувствительность, вредные привычки, лекарственная переносимость препаратов, приверженность к лечению гипертонической болезни и контроля уровня артериального давления.

Одним из маркеров эндотелиальной дисфункции в нашем исследовании являлось количество десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови. У всех обследуемых производился забор периферической венозной крови в объеме 5 мл на первые и четырнадцатые сутки развития острого инфаркта миокарда в период госпитализации. Для выделения нейтрофильной фракции периферической крови использовали фиколл-верографин, плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,142 и 1,062 г/см , соответственно. В дальнейшем полученная суспензия клеток использовалась для определения активности АДФ-рибозилциклазы, а мазки клеток - для определения

экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови иммуноцитохимическим методом, путем инкубации фиксированного препарата с моноклональными FITC-мечеными антителами (anti-CD38, Caltag, США). Визуализация осуществлялась методом флуоресцентной микроскопии, с помощью микроскопа «ЛЮМАМ» (х450): определяли относительное

количество CD38+ нейтрофилов в препарате. При микроскопии мазка нейтрофильной фракции периферической крови производили идентификацию и подсчет слущенных эндотелиоцитов из расчета на 100 клеток нейтрофильной фракции.

Активность АДФ-рибозилциклазы оценивалась методом

флуориметрического анализа, основанного на измерении флуоресценции продукта каталитической конверсии никотинамидгуаниндинуклеотида, по стандартному протоколу. Белок определялся методом Лоури, по стандартному протоколу. Спектрофлуориметрические исследования выполнены на спектрофлуориметре “Solar” (Беларусь).

Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью пакета прикладных программ. При использовании параметрических методов анализа предварительно определялось соответствие выборок закону нормального распределения с учетом теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса. При соответствии данных нормальному распределению для их сравнения использовали /-критерий Стьюдента-Фишера. В случае отклонения выборок от нормального распределения в сравнительном анализе использовали критерий W. Уилкоксона, критерий T Манна-Уитни для непараметрических показателей. Для исследования взаимосвязи нормально распределенных количественных признаков использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона; для непараметрических - коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Мы обнаружили высокий уровень экспрессии CD38+ на нейтрофилах периферической крови у больных с ОИМ на 1 и 14 сутки заболевания по сравнению с контрольной группой II (р<0,05). При этом активность фермента на 1 сутки развития инфаркта миокарда составила 0,475±0,14 ед/мин/мг белка, а на 14 сутки - уменьшилась в 2 раза( р<0,05) (табл. 1).

Интересно, что активность фермента после введения стрептокиназы на 1 сутки развития ОИМ была в 6 раз ниже, чем в I сравнительной группе без применения тромболитической терапии ( р<0,05) (табл. 1).

Обращает на себя внимание факт смещения пика максимальной активности фермента in vitro: в контрольной группе II - 0,2±0,0001 мин. после начала инкубации компонентов реакции, на первые сутки развития инфаркта миокарда

- 0,7±0,004 мин. (p<0,05), на 14 - 0,18±0,0001 мин. (p<0,05). По нашему мнению. Это может быть связано с конформационными изменениями в молекуле фермента [5], определяющими изменение доступности активного центра для субстрата.

Повышение содержания слущенных эндотелиоцитов в периферической крови отображает функциональное состояние эндотелия [C. Lobbe, 2003]. Увеличение концентрации циркулирующих эндотелиоцитов у больных ОИМ на первые и четырнадцатые сутки может быть результатом механического повреждения, ишемии или гипертензии, а также ответом на инфекционную инвазию. Мы обнаружили достоверное увеличение количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови больных ОИМ, применение тромболитической терапии достоверно не влияло на этот параметр (табл. 1).

Таким образом, нами впервые зарегистрированы изменения экспрессии и активности CD38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных ОИМ, что, вероятно, обусловлено активацией клеток, мигрирующих в очаг воспаления. Экспрессия CD38 на клетках лейкоцитарной популяции крови может рассматриваться в качестве маркера эндотелиальной дисфункции. Поскольку дисфункция эндотелия занимает ключевую роль в развитии

сердечно-сосудистой патологии и является самостоятельным фактором, определяющим характер течения и развития осложнений ишемической болезни сердца, воздействие на различные этапы ее формирования представляется перспективным в плане эффективного патогенетического лечения инфаркта миокарда.

Также весьма интересен факт достоверного снижения активности фермента под влиянием тромболитической терапии у больных с ОИМ. Это позволяет по-новому оценить механизмы активации нейтрофилов, сопровождающие системный тромболизис [4], предположив роль АДФ-рибозилциклазы в процессах, регулирующих активность нейтрофилов при этом патологическом состоянии.

SYSTEMIC THROMBOLYSIS AND MARKERS OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN PATIENTS WITH ACUTE MYOCARDIAL INFARCTION

O. S. Bakhmetieva

Krasnoyarsk state medical academy named in honour of V.F. Vojno-Yasenetskij

The paper contains results of study of CD38/ADP-ribosyl cyclase in patients with acute myocardial infarction (MI). We assessed expression and activity of CD38/ADP-ribosyl cyclase in peripheral blood neutrophiles in patients with MI in order to elucidate its role in progression of endothelial dysfunction. We found changes in expression and activity of the enzyme affected by systemic thrombolysis.

Литература

1. Маянский Д.Н., С.Д. Маянская. Роль нейтрофилов в ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Тер. арх. - 2001. - № 12. - С. 84-88.

2. Dewitt S, Laffafian I., Hallett M. B. Does neutrophil CD38 have a role in Ca++ signaling triggered by integrin? // Nature Med. - 2002. - Vol. 307, №8. - Р. 12011214.

3. Graeff R., Munshi C., Aarhus R. A single residue at the active site of CD38 determines its NAD cyclizing and hydrolyzing activities // J. Biol. Chem. - 2001. -Vol. 276. - Р. 12169-12173.

4. Link B., Schwerdt H., Berg G. et al. Neutrophil adhesion and activation during systemic thrombolysis in acute myocardial infarction - neutrophil activation, peripheral leukocyte responses, and myocardial injury // Thrombosis Res. - 1999. -Vol. 91, N 4. - P. 183-190.

5. Liu Q., Kriksunov I.A., Graeff R. et al. Structural basis for the mechanistic understanding of human CD38-controlled multiple catalysis // J. Biol. Chem. - 2006.

- Vol. 281. - Р. 32861-32869.

6. Munshi С., Thiel D.J., Mathews I.I. Characterization of the active site of ADP-ribosyl cyclase // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - Р. 30770-30777.

7. Naruko T., Ueda M., Haze K. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes // J. Circulation. - 2002. - Vol.106. - Р. 2894-2900.

8. Salmina A., Olovyannikova R., Noda M., and Higashida H. NAD+ metabolism and ADP-ribosyl cyclase as targets for central nervous system therapy // Current Medicinal Chemistry. - 2006. - Vol.6. - P. 193-210.

Таблица 1

Маркеры эндотелиальной дисфункции у больных с острым инфарктом

миокарда

Группа Маркеры эндотелиальной дисфункции

Количество CD38+ нейтрофилов (%) Активность АДФ- рибозилциклазы (ед/мин/мг белка) Количество слущенных эндотелио- цитов (%)

Сравнитель ная I 1 сутки (п= 30) 14 сутки (п= 30) 25,8±0,12 0,270±0,01 6,10±0,30

18,0±1,4 0,247±0,04 3,20±0,48

Контроль II 1 сутки (п=30) 14 сутки (п=30) 6,5±0,73 * 0,432±0,08 * 1,30±0,01 *

6,5±0,73 * 0,431±0,08 * 1,34±0,01 *

ТЛТ 1 сутки (п=10) 14 сутки (п=10) 23,4±1,6 # 0,070±0,01 *# 6,18±0,71 #

16,0 ±1,38 # 0,233±0,05 *# 2,78±0,34 #

Примечание: * - р<0,05 при сравнении с сравнительной группой I

# -p<0,05 - с контрольной группой II