CC BY
262
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
experimental gastroenterology
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ МЕТАБОЛИЗМОМ ВИТАМИНОВ МИКРОБИОТОЙ И ВЫЖИВАНИЕМ ПОЗИТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЖКТ
Громова О. А.1,2, Торшин И. Ю.2,3, Гарасько Е. В.1, Лиманова О. А.1,2, Гришина Т. Р.Рудаков К. В.3
1 ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия МЗ РФ»
2 РСЦ Института микроэлементов ЮНЕСКО, Москва
3 ГБОУ ВПО «Московский физико-технический институт», Москва
Громова О. А
E-mail: unesco.gromova@gmail.com
РЕЗЮМЕ
Перспективным направлением терапии дисбактериоза является использование так называемых метаболических пребиотиков — продуктов обмена веществ позитивной флоры (например, водный субстрат продуктов обмена веществ E. coli, S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus (штаммы DSM), из которых, как известно, изготовляется препарат Хилак Форте). Проведенный нами ранее систематический анализ метаболомов представителей позитивной микрофлоры указал на то, что последние содержат специфические биохимические механизмы для биосинтеза и переработки ряда витаминов. В настоящей работе представлены результаты систематического анализа эффектов витаминов В2, В6 и К на выживание представителей позитивной микрофлоры на основе субстрата продуктов обмена позитивной флоры. Результаты данного анализа позволяют уточнить молекулярные механизмы терапевтического воздействия данного препарата с весьма сложным составом, подтверждают имеющиеся клинические данные и являются важным обоснованием для проведения последующих микробиологических исследований. Метаболиты в составе препарата способствуют нормализации обмена пиридоксальфосфата (витамин В6), флавинадениндинуклеотида (ФАД, производное витамина В2) и никотинамид динуклеотида (НАД, производное витамина В3) — кофакторов ферментов, оказывающих существенное воздействие на выживание микробиоты. Предлагаемые молекулярные механизмы также указывают на возможный синергизм между определенными витаминами и микроэлементами, с одной стороны, и молекулярными компонентами препаратов на основе продуктов жизнедеятельности микробиоты — с другой.
Ключевые слова: обмен веществ; дисбактериоз; микробиота; пребиотики.
СО OJ
SUMMARY
A perspective direction of the treatment of dysbacteriosis is the use of so-called metabolic prebiotics — products of metabolism of positive flora (for example, water substrate of the products of metabolism of E. coli, S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus (strains of DSM), out of which, as known, drug Hylak Forte is made. Our earlier systematic analysis of metabolomics, representatives of positive microflora, pointed to the fact that the latter contain specific biochemical mechanisms for biosynthesis and processing of a number of vitamins. In the present paper the results of a systematic analysis of the effects of vitamins B2, B6 and K on the survival of the representatives of the positive microflora on the basis of the substrate of metabolic products of positive flora have been presented. The results of the analysis allow us clarify the molecular mechanisms of the therapeutic effects of this drug with a very complex structure and confirm the available clinical data and are an important foundation for subsequent microbiological research. Metabolites in the preparation composition contribute to the normalization of metabolism of pyridoxalphosphate (vitamin B6), flavin adenin dinucleotide (FAD, a derivative of vitamin B2) and nicotinamide dinucleotide (NAD, a derivative of vitamin B3) — cofactors of enzymes that have a significant impact on the survival of microbiota. The proposed molecular mechanisms also indicate on a possible synergies between certain vitamins and micro elements, on the one hand, and molecular components of the preparations on the basis of waste products of microbiota on the other. Keywords: metabolism; dysbacteriosis; microbiota; prebiotics.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что любые хронические заболевания сопровождаются полигиповитаминозом — соче-танным дефицитом многих витаминов. При этом взаимосвязь между полигиповитаминозом и заболеванием двунаправлена. С одной стороны, полигиповитаминоз зачастую развивается как следствие того или иного заболевания. С другой — полигиповитаминоз затрудняет полное клиническое выздоровление, способствует снижению иммунитета и переходу заболевания в хроническую форму (хронический тонзиллит, бронхит, стоматит, хронический колит и др.).
Важным фактором в этиологии полигиповитаминоза является дисбактериоз кишечника, приводящий к значительному снижению усвоения витаминов из пищи и витаминно-минеральных комплексов.
Дисбактериоз кишечника — нарушение баланса между позитивной и патогенной флорой в сторону патогенной. В терапии дисбактериоза используются препараты активной позитивной микрофлоры (пробиотики) и пребиотики — олигосахариды и другие вещества натурального или синтетического происхождения, селективно стимулирующие рост/выживание нормофлоры. Применение пребиотиков устраняет проблему генетической совместимости между индивидуальной микро-биотой хозяина и принимаемыми штаммами про-биотиков. Клинические исследования показывают перспективность использования метаболических пребиотиков (например, Хилак Форте — водный экстракт продуктов обмена веществ E. coli, S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus, а именно штаммы DSM). Этот препарат, подобно олигосахаридным пребио-тикам, стимулирует рост позитивной микробиоты.
Метаболические пребиотики отличаются весьма сложным составом, что существенно затрудняет анализ механизмов молекулярного фармакологического воздействия этих препаратов. В нашей предыдущей работе был проведен сравнительный метабо-ломный анализ позитивной микрофлоры, лежащей в основе препарата Хилак Форте [1]. Результаты проведенного анализа показали, что среди молекулярных компонентов Хилак Форте (RatioPharm GmbH, ФРГ) могут присутствовать такие важнейшие для выживания нормофлоры сигнальные молекулы, как аутоиндукторы 1-го и 2-го типов (посредством которых контролируется образование бактериальных пленок позитивной микрофлоры). Было установлено, что позитивная флора в основе Хилак Форте производит и потребляет метаболиты, связанные с переработкой желчных кислот, биосинтезом и биотрансформациями витаминов, селена, пребиотических сахаров, короткоцепочечных жирных кислот и т.д. На основе анализа возможных молекулярных компонентов были сформулированы новые механизмы терапевтического воздействия данного препарата, открывающие перспективы
синергидного эффекта при совместном использовании с витаминами В., В., К, селеном,
6 2
глутатионом (рис. 1)*.
Результаты метаболомного анализа позволили утверждать, что метаболиты в составе Хилак Форте способствуют выживанию позитивной флоры и в то же время могут тормозить рост патогенной микрофлоры кишечника. В настоящей работе представлены результаты систематического исследования эффектов витаминов В2, В6 и К на выживание представителей позитивной микрофлоры, на основе водного субстрата продуктов обмена веществ продуктов обмена веществ E. coli, S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus (штаммы DSM), из которых изготовляется препарат Хилак Форте.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛОМНЫЙ АНАЛИЗ ИССЛЕДОВАННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СИМБИОТИЧЕСКОЙ И ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ
Эффективный и безопасный пребиотический препарат должен поддерживать выживание позитивной кишечной флоры и сдерживать рост негативной флоры. Механизмы действия и, следовательно, эффективность и безопасность пребиотических препаратов были рассмотрены нами ранее с использованием анализа метаболомов — то есть массивов всех метаболитов одного микроорганизма [1-3]. Наиболее типичными представителями сим-биотической микрофлоры являются физиологические штаммы Escherichia coli, Streptococcus faecalis, представители Lactobacillus. Именно на основе экстрактов нормофизиологических штаммов этих бактерий изготовлен препарат Хилак Форте.
Так как Хилак Форте содержит часть метаболома бактерий, соответствующих позитивной микрофлоре, сравнение метаболомов этих микроорганизмов с метаболомами бактерий условно патогенной флоры указывает на наиболее вероятные молекулярные пути, посредством которых осуществляется терапевтическое воздействие препарата. Суммарная информация по метаболомам исследованных микроорганизмов представлена на рис. 2*. Установлено существование 396 метаболитов, общих для исследованных представителей позитивной микрофлоры, и 350 метаболитов, общих для представителей условно патогенной флоры.
Сравнительный анализ метаболомов этих микроорганизмов показал, что у данных представителей нормофлоры присутствуют определенные метаболические маршруты, которых не существует ни у одного из исследованных представителей условно патогенной
Б >
ст
So
1_ с
01
0£
QJ о
Н1Ё
21
I- £
и
га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш
2 s а ш с и
v
m
На цветной вклейке в журнал.
о
OJ
■
Таблица 1
МЕТАБОЛИТЫ НОРМОФЛОРЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В БИОСИНТЕЗЕ ВИТАМИНОВ Данные метаболиты входят в состав метаболомов только представителей позитивной флоры
Метаболит Биохимический маршрут Функция
Фосфонооксибутаноат, 4-фосфоги-дрокситреонин Биосинтез пиридоксаль фосфата Метаболизм витамина В6
Пиридоксаль Переработка пиридоксаль фосфата
2,5-диамино-6-(5-фосфо-Б-рибозиламино) пиримидин-4; 6,7-диметил-8-(1-Б-рибитил)-лумазин; рибофлавин Биосинтез флавина Метаболизм витамина В2
Менахинолы, менахиноны Биосинтез 8-менахинола (К2) Биосинтез витамина К, восстановление никотинамидного кофермен-та НАД с образованием НАДН
Никотинат Циклический путь переработки НАД Синтез витамина В3
Таблица 2
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФУНКЦИИ ФАД-ЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК МИКРОБИОТЫ (на примере E. coli)
Число белков Код функции по БД GO Функция
37 GO: 0009055 Перенос электрона в процессах энергетического метаболизма аминокислот и короткоцепочечных жирных кислот, метаболизм кофермента НАД
21 GO: 0048038 Связывание хинона
10 GO: 0009060 Аэробное дыхание, аэротаксис
8 GO: 0042773 Синтез АТФ
7 GO: 0009437 Метаболизм карнитина
6 GO: 0006099 Цикл трикарбоновых кислот (короткоцепочечных жирных кислот)
5 GO: 0003995 Ацил-КоА дегидрогеназа
5 GO: 0006744 Биосинтез убихинона, поддержка антиоксидантного ресурса Микробиоты
4 GO: 0006537 Биосинтез глутамата
4 GO: 0030976 Связывание тиаминпирофосфата
о m
флоры. В частности, были установлены метаболиты, связанные с биосинтезом ряда витаминов (табл. 1), и наличие этих молекул в экстрактах продуктов жизнедеятельности нормофлоры будет ускорять рост позитивной флоры. Однако не был проведен анализ соответствующих биохимических маршрутов. Одной из целей настоящей работы является детальное рассмотрение биохимических маршрутов, связанных с метаболизмом витаминов: метаболизм витамина В6, биосинтез и функции рибофлавина, биосинтез и функции витамина К и взаимосвязи этих маршрутов с выживаемостью нормофлоры ЖКТ.
БИОСИНТЕЗ И ФУНКЦИИ РИБОФЛАВИНА
В результате проведенного метаболомного анализа было установлено, что такие метаболиты, как
фосфорибозил аминопиримидин (название по международной номенклатуре ШРАС 2,5-диами-но-6- (5-фосфо-Б-рибозиламино) -пиримидин-4) и рибитил лумазин (международное название 6,7-ди-метил-8- (Ю-рибитил) -лумазин), уникальны для позитивной флоры, лежащей в основе препарата Хилак Форте.
Эти два метаболита важны для синтеза рибофлавина. Рибофлавин, в свою очередь, необходим для образования белковых кофакторов флавинаденинди-нуклеотида (ФАД) и флавинмононуклеотида (ФМН).
Фосфорибозил аминопиримидин образуется в результате гидролиза гуанидинтрифосфата (ГТФ) ферментом ГТФ-циклогидролазой II (пЬА). Этот Mg-, Zn-зависимый фермент катализирует удаление дифосфата и другие трансформации структуры ГТФ, осуществляя тем самым первый шаг
Рис. 5. Химическая структура рибофлавина (слева) и белкового кофермента флавинадениндинуклеотида (ФАД, справа).
биосинтеза рибофлавина (рис. 3) *. При дефицитах цинка и магния активность данного фермента упадет, что отрицательно скажется на динамике синтеза рибофлавина. Поэтому обеспеченность этими микронутриентами весьма важна для поддержания жизнедеятельности нормофлоры.
Таким образом, вхождение молекул фосфори-бозил аминопиримидина и рибитил лумазина в состав препарата Хилак Форте будет способствовать интенсификации синтеза рибофлавина из этих промежуточных продуктов. Второй из обсуждаемых метаболитов, рибитил лумазин, потребляется ферментом рибофлавин-синтетазой (ribC), который катализирует последний шаг в биосинтезе рибофлавина (рис. 4) **.
Активация синтеза рибофлавина в представителях нормофлоры будет приводить к лучшей обеспеченности клеток микробиоты коферментом ФАД (флавинадениндинуклеотид) — коферментом, принимающим участие в окислительно-восстановительных процессах. Восстановленная форма кофермента (ФАДШ) является переносчиком энергии и используется как субстрат в реакциях окислительного фосфорилирования в митохондриях. При окислении восстановленной формы ФАДШ выделяется энергия, запасаемая в форме двух молекул АТФ. ФАД образуется из рибофлавина (рис. 5).
ФАД-зависимые ферменты вовлечены широкий круг процессов выживания клеток микробиоты. Например, в E. coli известно более 70 ФАД-зависимых белков, то есть белков, для активности которых ФАД принципиально необходим. Большинство этих белков вовлечены в энергетический метаболизм клетки, в том числе в процессы аэробного дыхания, катаболизма аминокислот и углеводов, цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса). В табл. 2 приведен краткий обзор молекулярных функций ФАД-зависимых белков.
В частности, ФАД-зависимые белки алкилги-дроперексид редуктаза (ген ahpF) и универсальный
На цветной вклейке в журнал. На цветной вклейке в журнал.
белок стресса (ген uspA) необходимы для защиты клеток микробиоты от повреждений клеточной ДНК. ФАД-зависимая глутати-онредуктаза (ген gor) служит той же цели, поддерживая высокий уровень восстановленного глутатиона в цитозоле.
Интересно отметить существование среди ФАД-зависимых белков тех, которые опосредуют сигналы окружающей среды, принципиально важные для выживания бактерий позитивной флоры. Например, аэротаксис рецептор (ген aer) формирует сигнал для аэротаксиса нормофлоры — то есть для движения клеток по направлению к пузырькам воздуха в кишечном транзите, так как кислород необходим для процессов аэробного окисления. Данный белок контролирует уровни протонов и окислительно-восстановительный баланс клетки, используя ФАД как окислительно-восстановительный датчик для контроля уровня поступающего в клетку кислорода. Другой пример — ФАД-зависимый белок-антирепрессор YcgF связывает и освобождает белок-репрессор транскрипции YcgE от связанных им участков ДНК при снижении температуры, активируя тем самым гены энергетического метаболизма, необходимые для выживания клеток микробиоты.
Также напомним, что одной из наиболее важных функций кофермента ФАД, производного рибофлавина (витамин В2), является его участие в метаболических процессах основного кофермента энергетического метаболизма клеток микробиоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД, НАД^ НАДР, NAD, NADP рис. 6), производного витамина В3 (витамин РР). Этот кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав ферментов-дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции; выполняет функцию переносчика электронов и водорода.
Таким образом, кофермент ФАД, активация синтеза которого возможна в присутствии вышеназванных метаболитов фосфорибозил амино-пиримидина и рибитил лумазина, необходим для синтеза витамин-РР-зависимого кофермента НАД.
Б >
ст
So
1_ о
01
0£ QJ CT
Н1Ё
21
I- £
и
га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш
2 s а ш с и
V
m
■
о
Рис. 6. Химическая структура кофермента никотинамид адениндинуклеотидфосфата (NADP).
Таблица 3
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФУНКЦИИ НАД-ЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК МИКРОБИОТЫ (на примере E. coli)
Число белков Код функции по БД GO Функция
38 GO: 0009055 Реакции переноса электронов (энергетический метаболизм, в том числе метаболизм белков, жиров и углеводов)
27 GO: 0048038 Связывание хинона для повышения антиоксидантного ресурса микробиоты
11 GO: 0009061 Анаэробное дыхание, переработка уксусной и муравьиной кислот, этанола и глицерина
9 GO: 0006099 Цикл трикарбоновых кислот (Кребса)
9 GO: 0008615 Процессы биосинтеза пиридоксина
8 GO: 0009060 Аэробное дыхание
7 GO: 0009103 Биосинтез липополисахаридов бактериальной стенки для повышения устойчивости против неблагоприятных факторов (химических, вирусных, бактериальных)
6 GO: 0009447 Обезвреживание путресцина (устранение «дурного запаха» изо рта)
6 GO: 0046677 Активация защитных реакций для повышения выживаемости на фоне воздействия антибиотиков, детоксикация соединений азота
Таблица 4
OJ
m
ПИРИДОКСИН-ЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ E. COLI Отдельно указаны магний-зависимые ферменты. Ферменты с неизвестной функцией (n = 12) исключены
Биохимический процесс Число ферментов Кодовые обозначения ферментов/генов
Биосинтез аминокислот, потенцирование бел-ково-синтетической функции нормофлоры 25 Kbl argD bioA alr dadX tyrB aspC ilvE metC metB cysM lysA gadA gadB alaA alaC hisC ltaE selA ilvA ybdL spec malY thrC trpB avtA
Деградация аминокислот, детоксикация 9 gabT adiA speA (Mg) dsdA gcvP tdcB ldcC astC tnaA
Метаболизм витамеров В6, поддержка усвоения витамина В6 8 pdxA (Mg) epd pdxB serC ybhA (Mg) pdxY pdxJ pdxK
Утилизация макро- и микроэлементов (углерода, серы, селена и др.) из различных источников, детоксикация 7 puuE iscS sufS csdA dcyD patA Cof (Mg)
Метаболизм углеводов, энергетический метаболизм бактериальной клетки 6 yihX (Mg) glgC glgP rffA malP arnB
Биосинтез биотина, фолатов, тиамина, стимуляция усвоения витаминов и поддержание витаминного баланса 4 bioF pabC thiD glyA
Синтез порфиринов, обезвреживание желчных кислот 2 hemL hemC
Этот кофермент нужен для поддержания активности многочисленных НАД-зависимых белков: например убихинон оксидоредуктазы, киназы изо-цитрат дегидрогеназы, формиатдегидрогеназы H, глицерин дегидрогеназы и многих других. В табл. 3 приведены молекулярные функции белков, активность которых зависит от НАД.
Среди НАД-зависимых ферментов, особо следует отметить те, которые необходимы для выживания нормофлоры кишечника при различных внешних условиях. Например, ферменты комплекса окисления жирных кислот (fadB, fadJ и т.д.) участвуют в аэробной и анаэробной деградации длин-ноцепочечных жирных кислот. НАД-зависимый фермент изоцитрат дегидрогеназа (icdA) является необходимой составляющей цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса) и необходим для переработки сахаров бактериями микробиоты. В то же время НАД-зависимый фермент киназа изоцитрат дегидрогеназы (aceK) позволяет бактериям нормофлоры синтезировать АТФ в обход цикла Кребса через глиоксилатный шунт при наличии в среде других источников углерода. Так, при избытке глюкозы активен вышеупомянутый фермент изоцитрат дегидрогеназа, а если бактерия использует в качестве источника углерода ацетат (уксусная кислота) или этанол, то киназа изоцитрат дегидрогеназы «выключает» фермент изоцитрат дегидрогеназу и ориентирует метаболизм клетки на доступный источник углерода. Параллельно происходит эффективное обезвреживание ацетата и этанола в кишечном транзите.
Несмотря на то что уксусная кислота, этанол, муравьиная кислота, глицерин являются нормальными продуктами кишечного метаболизма, избыток этих веществ может оказывать негативное влияние на функцию ЖКТ. Например, избыток глицерина вызывает диарею; избытки муравьиной и уксусной кислот стимулируют эрозивные процессы. Существуют и другие НАД-зависимые ферменты, необходимые для переработки вышеназванных веществ. Например, фермент формиатдеги-дрогеназа H (fdhF) разлагает муравьиную кислоту на водород и углекислый газ в анаэробных условиях. Другой НАД-зависимый фермент, глицерин дегидрогеназа (gldA), катализирует НАД-зависимое окисление глицерина в дигидроксиацетон и позволяет микроорганизмам нормофлоры использовать глицерин в качестве источника углерода в анаэробных условиях. В E. coli важная роль этого фермента заключается также в регулировке внутриклеточного уровня дигидроксиацетона путем обратной конвертации дигидроксиацетона в глицерин.
Ряд НАД-зависимых ферментов участвует в процессах детоксикации, что весьма важно как для выживания нормофлоры, так и способствует обезвреживанию токсических метаболитов в организме хозяина. Фермент глицеральдегид-3-фосфат-редуктаза (ген gpr) катализирует восстановление и детоксикацию глицеральдегид-3-фосфата,
инициирует реакцию клеток микробиоты на стресс и преобразует токсичные метаболиты метилглиоксаля в ацетол. Флавогемопротеин (hmp) участвует в детоксикации химически активного оксида азота NO, избыточно образующегося в аэробных процессах, и защищает микробиоту от различных токсичных соединений азота, играя центральную роль в инициировании ответа клеток микробио-ты на нитрозативный стресс.
МЕТАБОЛИЗМ ВИТАМИНА В6
Связанные с биосинтезом витамина В. ме-
6
таболиты, найденные в ходе метаболомного анализа (фосфонооксибутаноаты, производные пиридоксаля, пиридоксилактон и др.), производят витамин В6 не столько для нужд организма хозяина, сколько для поддержания метаболической активности самой микробиоты. По данным настоящего анализа, производное витамина В6 пиридоксаль фосфат входит в состав более чем 70 таких важных для E. coli ферментов, как глутамат декарбоксилаза (синтез короткоцепочечных жирных кислот, профилактика диабета), триптофаназа (расщепление аминокислоты триптофана), цистеин десульфураза (утилизация серы из цистеина, обезвреживание токсинов, связанных с SH-группами), порфирино-билиноген деаминаза (обезвреживание желчных кислот), аденилосукцинат синтаза и аминобутират синтаза (метаболизм короткоцепочечных жирных кислот, профилактика запоров) и других, поддерживающих разнообразные процессы внутри бактериальной клетки (табл. 4). Являясь кофактором белка,вовлеченного в транспорт и переработку мальтозы (ген MalY, цистатионазная активность), пиридоксаль фосфат напрямую определяет способность E. coli перерабатывать мальтозу и, следовательно, необходим для выживания этой и других бактерий микробиоты [4].
Найденные в ходе метаболомного анализа фос-фонооксибутаноат, 4-фосфогидрокситреонин и пиридоксаль служат для синтеза активной формы пи-ридоксина (пиридоксаль 5-фосфата) в позитивной флоре кишечника. Фосфонооксибутаноат и 4-фос-фогидрокситреонин могут трансформироваться друг в друга и затем каждый из них трансформируется в 3-амино-1-гидроксиацетон-1-фосфат, из которого синтезируется активная форма витамина В6, пиридоксин и пиридоксаль фосфат. Метаболит 4-фосфогидрокситреонин (3-гидроксигомосерин фосфат) является обязательным промежуточным продуктом биосинтеза пиридоксаль-5'-фосфата в E. coli [5]. Превращение 4-фосфогидрокситреонина в упоминаемый выше 3-амино-1-гидроксиацетона-1-фосфат осуществляется цинк-зависимым ферментом PdxA дегидрогеназой (рис. 7) *.
Б >
ст
So
1_ с
01
0£ QJ CT
Н1Ё
21
I- £
и
га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш
2 s а ш с и
v
m
На цветной вклейке в журнал.
m m
■
Делеция гена PdxA дегидрогеназы оказывает существенное воздействие на выживание позитивной флоры: удаление гена вызывает торможение биосинтеза пиридоксина и значительно тормозит рост бактерий позитивной флоры [6]. Дефицит цинка также будет вызывать торможение метаболизма пиридоксина. Таким образом, фосфонооксибу-таноат, 4-фосфогидрокситреонин и пиридоксаль (предположительно содержащиеся в составе Хилак Форте) будут способствовать накоплению пиридоксина в микроорганизмах позитивной флоры. Пиридоксин является принципиально необходимым для активации упоминаемых в табл. 4 пири-доксин-зависимых ферментов.
Рассмотрим некоторые из пиридоксин-зави-симых ферментов на примере E. coli. Несколько В6-зависимых ферментов необходимы для выживания бактерий в определенных условиях обеспеченности теми или иными молекулами-источниками биоэлементов. Иначе говоря, эти ферменты важны для усвоения биоэлементов из пищевого транзита. Например, В6-зависимая 4-аминобути-рат аминотрансфераза puuE обеспечивает перенос аминогруппы гамма-аминобутирата (ГАМК) в альфа-кетоглутарат, что важно для использования продукта гнилостного брожения путресцина в качестве источника азота и углерода. Путресцин также является основным молекулярным компонентом, приводящим к «дурному запаху» изо рта. Фермент цистеин десульфураза (sufS) необходим для удаления элементарной серы и селена из ци-стеина и селеноцистеина для синтеза аланина и для сохранения серы и селена внутри бактерий нор-мофлоры. Магний-зависимый фермент гидрокси-метилпиримидин пирофосфат фосфатаза Cof (Mg) создает устойчивость позитивной флоры к антибиотикам, уменьшая формирование токсических форм этих ксенобиотических веществ.
Ряд В6-зависимых ферментов необходимы для поддержания внутри- и внеклеточного рН (кислотности), одного из принципиальных факторов выживания бактериальной клетки. Фермент глутамат декарбоксилаза альфа-gadA конвертирует глутамат в гамма-аминобутират (ГАМК), поддерживая внутриклеточный рН, близкий к нейтральному. Фермент лизиндекарбоксилаза ldcC обеспечивает конвертацию L-лизина в кадаверин и поддерживает гомеостаз рН, нейтрализуя кислые побочные продукты брожения углеводов. В то же время фермент аргинин декарбоксилаза adiA регулирует рН перерабатывая аргинин из белков.
Из микробиологии известно, что различные организмы могут использовать совершенно разные транспортные/метаболические механизмы для усвоения определенных питательных веществ, причем потребности в тех или иных формах витаминов соответствует этим механизмам. Пиридоксин гидрохлорид оказывает дифференцированное воздействие на различные виды бактерий: например, подавляет рост альфа-гемолитического
стрептококка [7], но поддерживает рост необходимых для организма бактерий рода Lactobacillus [8; 9].
E. coli использует для процессов роста три нефосфорилированные формы витамина B6 [10]. В этом представителе нормофлоры были установлены три особенных биохимических пути, обеспечивающих синтез пиридоксальфосфата в отсутствие активности фермента фосфоэритро-нат дегидрогеназы (PdxB), вовлеченного в стандартный путь биосинтеза [11]. При дефиците активности данного фермента (например, вследствие дефицитов тех или иных микронутриентов) синтез В6 осуществляется на основе метаболитов биосинтеза серина с участием упомянутого 4-фосфогидрокситреонина, что повышает выживаемость этой необходимой для микробиоты бактерии в условиях нутриентного дефицита.
Таким образом, пиридоксин и другие формы витамина В6 необходимы для выживания нормофлоры кишечника. И наоборот, здоровая нор-мофлора обеспечивает синтез витамина В6 из продуктов пищевого транзита, способствуя профилактике дефицита пиридоксина и патологий, связанных с дефицитом этого витамина. Поэтому прием Хилак Форте, оказывая поддержку биохимических путей метаболизма пиридоксина, может способствовать развитию нескольких клинических эффектов. Во-первых, поддерживая рост нормофлоры у пациентов с деформациями микробиоты, он будет способствовать устранению запаха изо рта, обусловленного отчасти избытком путресцина. Во-вторых, поддерживая метаболизм короткоце-почечных жирных кислот, он нормализует динамику пищевого транзита. В-третьих, поддержка пиридоксинового метаболизма способствует вытеснению патогенной и условно патогенной флоры.
Таким образом, молекулярные компоненты, например препарата Хилак Форте, могут активировать синтез витаминов В2 (рибофлавин), РР (нико-тинамид), В6 (пиридоксин), которые играют важные роли в ферментативных реакциях, обеспечивающих выживание нормофлоры кишечника. Наличие в среде питания этих витаминов или же метаболитов, стимулирующих их синтез/накопление, необходимо для роста бактерий [12]. Обогащение питательной среды бактерий нормофлоры этими и другими витаминами группы В улучшает синтез молочной кислоты и стимулирует процессы клеточного роста [13]. Фолаты, витамины РР, В5, В6 и В2 значительно стимулируют рост лактобактерий и синтез экзополисахаридов [14; 15], повышающих устойчивость нормофлоры к негативным воздействиям. Исследование 10 штаммов Lactobacillus показало, что витамины группы В способствуют росту лактобактерий, более активному использованию простых сахаров и синтезу короткоцепо-чечных кислот [16]. Вещества, специфически тормозящие активность ФАД-зависимых ферментов, характеризуются значительной антибиотической активностью [17].
Рис. 8. Пример структуры бактериального менахинона (менахинон-8). Менахинол отличается от менахинона заменой одной из групп =О на -ОН.
БИОСИНТЕЗ И ФУНКЦИИ ВИТАМИНА К
В метаболомах представителей позитивной микрофлоры кишечника, входящих в состав экстракта для приготовления препарата Хилак Форте, установлено наличие менахинонов и менахинолов. Эти вещества, образующие различные формы витамина К (рис. 8), входят в состав плазменных мембран бактерий, где они играют важную роль в переносе электронов, окислительном фосфорилировании и повышении антиоксидантного ресурса нормофлоры.
Витамином К называют группу структурно похожих жирорастворимых витаминов, являющихся производными менахинонов. В организме человека витамин К необходим для активации определенных белков посредством так называемых посттрансляционных изменений. Например, витамин К принципиально необходим для активации белков свертывания крови и белков метаболических путей соединительной и костной тканей. Витамин К1, также известный как филлохинон или менадион, синтезируется растениями. Нормофлора толстого кишечника синтезирует витамин К2 и также способствует конвертации витамина К1 в К2 [18].
Менахинолы и менахиноны важны для метаболизма короткоцепочечных жирных кислот. В частности, фермент хинолин-фумарат редуктаза (ген QFR, также известен как FrdA, рис. 9)* — интегральный мембранный комплекс, являющийся одним из неотъемлемых компонентов анаэробного дыхания микробиоты. Это фермент катализирует заключительный этап анаэробного окисления. Мембранно-растворимый менахинол переносит электроны к этому ферменту, связываясь непосредственно с клеточной мембраной. Хинолин-фумарат редуктаза также является ФАД-зависимым ферментом. Делеции гена FrdA снижают окисление сукцината и фумарата на 75% [19]. Соответственно к подобному эффекту будет приводить и дефицит менахинона. Поэтому наличие менахинона в составе Хилак Форте будет способствовать повышению антиоксидантного ресурса микробиоты и активации процессов клеточного дыхания.
Помимо хинолин-фумарат редуктазы менахи-нон и менахинол участвуют и в других окислительно-восстановительных процессах, важных для выживания микробиоты. В частности, менахи-нон необходим в цикле Кребса для трансформации малата в оксалоацетат, лактата — в пируват;
На цветной вклейке в журнал.
менахинол способствует восстановлению кофермента НАД. Кроме того, менахинон участвует в биосинтезе гема из протопор-фириногена IX и оротата из дигидрооротата.
Следует также отметить, что среди витаминов с антиоксидантными свойствами витамин С может играть особую роль в поддержании выживания именно позитивной микрофлоры. Так, марганец-зависимый фермент аскорбат 6-фосфат лактоназа (ulaG) необходим для возможности использовать L-аскорбиновую кислоты в качестве единственного источника углерода в анаэробныхусловияхроста (рис. 10)* [3]. При этом, как показал результат настоящего анализа, данный фермент имеется у S. faecalis, E. coli и отсутствует у изученных представителей негативной микрофлоры кишечника. Марганец, являющийся неотъемлемой частью этого фермента, необходим, таким образом, для усвоения микробиотой витамина С. Поэтому прием витамина С будет способствовать выживанию именно позитивной флоры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Клинические исследования показывают перспективность использования метаболических пре-биотиков (экстрактов продуктов обмена веществ позитивной флоры) для стимулирования роста нор-мофлоры. Метаболический пребиотик Хилак Форте содержит значительное количество метаболитов, водных субстратов продуктов обмена веществ из таких представителей микробиоты, как Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus helveticus. Сравнительный метабо-ломный анализ показал, что метаболиты в составе Хилак Форте могут способствовать нормализации метаболизма микробиотой таких важных для выживания клеток микробиоты кофакторов, как пиридоксальфосфат (витамин В6), флавинаденин-динуклеотид (ФАД) и никотинамид динуклеотида (НАД), оказывающих существенное воздействие на энергетический метаболизм и антиоксидантный ресурс микробиоты (рис. 11)*. Результаты настоящего анализа также позволяют предположить существенный синергизм между витаминами группы В (прежде всего витаминов В2, РР и В6) и определенными микроэлементами (цинк, марганец, магний), с одной стороны, и с молекулярными компонентами препарата Хилак Форте — с другой. Последнее делает весьма актуальным проведение исследований микроэлементного состава аналогичных препаратов.
Б >
ст
So
1_ о
01
0£
QJ о
Н1Ё
21
I- £
и
га
L Б
га
X
j
га
I-
х ш
2 s а ш с и
v
m
1-Л
m
■
ЛИТЕРАТУРА
•О
m
1. Лиманова О. А. Избирательная модуляция роста позитивной флоры кишечника — новая концепция воздействия метаболического пребиотика Хилак Форте / О. А. Лиманова, И. Ю. Торшин,
E. В. Гарасько, О. А. Громова // Consilium Medicum. — 2012. — № 20 (253). — С. 47-56.
2. Torshin I. Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: physiology and medicine / I. Yu. Torshin. — Nova Biomedical Books, NY, USA 2007. — ISBN: 1600217524.
3. Caspi R. MetaCyc: a multiorganism database of metabolic pathways and enzymes / R. Caspi, H. Foerster, C. A. Fulcher, R. Hopkinson,
J. Ingraham, P. Kaipa, M. Krummenacker, S. Paley, J. Pick, S. Y. Rhee, C. Tissier, P. Zhang, P. D. Karp // Nucleic Acids Res. — 2006. — Vol. 34. — D511-5116.
4. Schlegel A. Network regulation of the Escherichia coli maltose system / A. Schlegel, A. Bohm, S. J. Lee, R. Peist, K. Decker, W. Boos // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. — 2002. — Vol. 4, No. 3. — P. 301-307.
5. Zhao G. 4-Phospho-hydroxy-L-threonine is an obligatory intermediate in pyridoxal 5'-phosphate coenzyme biosynthesis in Escherichia coli K-12 / G. Zhao, M. E. Winkler // FEMS Microbiol. Lett. — 1996. — Vol. 135, No. 2-3. — P. 275-280.
6. Wetzel D. K. Functional complementation between the PDX1 vitamin B6 biosynthetic gene of Cercospora nicotianae and pdxJ of Escherichia coli / D. K. Wetzel, M. Ehrenshaft, S. A. Denslow, M. E. Daub // FEBS Lett. — 2004. — Vol. 564, No. 1-2. — P. 143-146.
7. Sherman S. P. Pyridoxine inhibition of a symbiotic streptococcus / S. P. Sherman, J. A. Washington 2nd. // Am. J. Clin. Pathol. — 1978. — Vol. 70, No. 4. — P. 689-690.
8. Vera Pingitore E. Influence of vitamins and osmolites on growth and bacteriocin production by Lactobacillus salivarius CRL 1328 in a chemically defined medium / E. Vera Pingitore, E. M. Hebert,
F. Sesma, M. E. Nader-Macias // Can. J. Microbiol. — 2009. — Vol. 55, No. 3. — P. 304-310.
9. Mulligan J. H. Transport and metabolism of vitamin B6 in lactic acid bacteria / J. H. Mulligan, E. E. Snell // J. Biol. Chem. — 1977. — Vol. 252, No. 3. — P. 835-839.
10. Yamada R. H. Uptake and utilization of vitamin B6 and its phosphate esters by Escherichia coli / R. H. Yamada, T. Tsuji, Y. Nose // J. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo). — 1977. — Vol. 23, No. 1. — P. 7-17.
11. Kim J. Three serendipitous pathways in E. coli can bypass a block in pyridoxal-5'-phosphate synthesis / J. Kim, J. P. Kershner, Y. Novikov, R. K. Shoemaker, S. D. Copley // Mol. Syst. Biol. — 2010. — Vol. 6. — P. 436.
12. Mandelstam J. Class II reactions: Synthesis of small molecules / J. Man-delstam, K. Mcquillen // Biochemistry of bacterial growth. 2nd ed. — New York: Wiley, 1976. — P. 202-250.
13. Xu G. Q. Effects of vitamins on the lactic acid biosynthesis of Lactobacillus paracasei NERCB 0401 / G. Q. Xu, J. Chu, Y. P. Zhuang, Y. H. Wang, S. L. Zhang // Biochem. Eng. J. — 2008. — Vol. 38. — P. 189-197.
14. CerningJ. arbon source requirement for exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer / J. Cerning, C.M.G.C. Renard, J. F. Thibault, C. Bouillanne, M. Landon, M. Desmazeaud, L. Topisirovic // Appl. Environ. Microbiol. — 1994. — Vol. 60. — P. 3914-3919.
15. KojicM. Analysis of exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 isolated from cheese / M. Kojic, M. Vujcic, A. Banina, P. Cocconcelli, J. Cerning, L. Topisirovic // Appl. Environ Microbiol. — 1992. — Vol. 58. — P. 4086-4088.
16. Ewe J. A. Viability and growth characteristics of Lactobacillus in soymilk supplemented with B-vitamins / J. A. Ewe, W. N. Wan-Abdullah, M. T. Liong // Int. J. Food Sci. Nutr. — 2010. — Vol. 61, No. 1. — P. 87-107.
17. Zhao Y. Discovery and development of the covalent hydrates of triflu-oromethylated pyrazoles as riboflavin synthase inhibitors with antibiotic activity against Mycobacterium tuberculosis / Y. Zhao, A. Bacher, B. Illari-onov, M. Fischer, G. Georg, Q. Z. Ye, P. E. Fanwick, S. G. Franzblau, B. Wan, M. Cushman // J. Org. Chem. — 2009. — Vol. 74, No. 15. — P. 5297-5303.
18. ShearerM. J. Metabolism and cell biology of vitamin K / M. J. Shearer, P. Newman // Thromb Haemost. — 2008. — Vol. 100, No. 4. — P. 530-547.
19. Baba T. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection / T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K. A. Datsenko, M. Tomita, B. L. Wanner,
H. Mori // Mol. Syst. Biol. — 2006. — Vol. 2. — P. 2006-2008.
ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ МЕТАБОЛИЗМОМ ВИТАМИНОВ МИКРОБИОТОЙ И ВЫЖИВАНИЕМ ПОЗИТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЖКТ
Рис. 1. Молекулярные механизмы воздействия компонентов беззародышевых водных субстратов продуктов обмена веществ позитивной флоры кишечника.
Рис. 2. Относительные размеры метаболомов исследованных представителей кишечной микробиоты. Метаболом — массив всех метаболитов клетки. Исследовано 4 типичных представителя позитивной флоры (Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus) и 3 представителя условно-патогенной флоры (Clostridium difficile, Staphylococcus аureus, Candida аlbicans). Модели метаболомов (в виде списков входящих в каждый метаболом молекул) были получены с использованием программного обеспечения BioCyc [3].
ГТФ + зн,о
!
сг-^—о-
т
+
NQ: "'ОН
ФосфорНбо31П амтюпнргсш вд т
! ) *
I
Д|гфосфат
Форммат
Рис. 3. Гидролиз ГТФ до фосфорибозил аминопиримидина — начальная стадия синтеза рибофлавина. Показаны уравнение химической реакции и пространственная структура Mg-, Zn-зависимого фермента ГТФ-циклогидролазы II (PDB код 2BZ0), катализирующего данную биотрансформацию. Показаны молекула аналога ГТФ, ионы цинка и магния в активном центре фермента.
+н*
PuGmuu iVM-i 'iui
о fr
ОМ OK
I
5 -аммво-б-рпбнп ui а шшоуращы
«—г 1-0
Рибофлавин
Рис. 4. Последняя стадия синтеза рибофлавина и структура соответствующего фермента. Показано расположение рибофлавина в активном центре фермента (PDB 1HZE).
МАОИ +
им;
4-фосфопщр окситр еоштн
I
Д^Д^0-/ /
3-ам1шо-1-пшрокс11ацеюна-1-фосфат
Периплазматическое пространство бактерии
Внутренняя мембрана менахиноп менахинон
Цитозоль
Хинол-фумарат редуктаза (QFR)
Фумарат Сукцинат
о о
Рис. 7. Превращение фосфогидрокситреонина и пространственная структура фермента PdxA дегидрогеназы, поддерживающего данную реакции (модель на основе PDB 1PS6). Показаны ион цинка и молекула фосфогидрокситреонина в активном центре фермента.
Рис. 9. Химические процессы трансформации различных форм витамина К и пространственная структура фермента хинолин-фумарат редуктазы. Показаны менахинон (решетчатая модель) и флавина-дениндинуклеотид (ФАД, сферическая модель) в активном центре фермента (PDB
Рис. 10. Пространственная структура марганец-зависимого фермента аскорбат 6-фосфат лактоназа (PDB 2WYM). Показан ион марганца в активном центре (сфера).
Метаболиты в составе Хилак Форте, стимулирующие синтез и биотрансформации витаминов В2, В6, РР и К
фосфорибозил аминопиримидин, рибитил лумазин
Витамин В2
Витамин РР
чуу -
ми он •4
*—'
Цикл трихарбоновых кислот,
метаболизм короткоцепочечных жирных кислот, синтез коферменто НАД, аэробное дыхание, поддержка антиоксидантного ресурса
ФосфоноокСибутаноат, 4-фосфогидрокситреонин
менахиноны и менэхйнолы ...........А..........
Витамин В6
витамин К
Энергетический метаболизм, повышение антиоксидантного ресурса микробиоты анаэробное дыхание, переработка уксусной и муравьиной кислот, этанола и
глицерина Обезвреживание путресцина
Потенцирование Ъелково-синтетической функции нормофлоры, детоксикация, поддержка усвоения витамина В6 и других витаминов, энергетический метаболизм
Повышение ант иоксидан тного ресурса микробиоты и активация процессов клеточного дыхания
Повышение обеспеченности витаминами микробиоты и организма хозяина, вытеснение патогенной и условно-патогенной потенцирование детонсинации пищевого транзита
Рис. 11. Молекулярные механизмы воздействия метаболитов в составе Хилак Форте на метаболизм витаминов, детоксикацию пищевого транзита и выживание микробиоты.
