CC BY
35
© ФРАНЦИЯНЦ Е.М., ШИХЛЯРОВА А.И., КОМАРОВА Е.Ф., КОЗЛОВА Л.С.
УДК: 001.5:612.014.426:616.24.006.3.04
СИСТЕМА ПРОТЕОЛИЗА ТКАНИ ЛЕГКОГО КРЫС С ПЕРЕВИТОЙ С-45 ПРИ ПРИМЕНЕНИИ СОЧЕТАННОГО ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО
ВОЗДЕЙСТВИЯ
Е.М. Франциянц., А.И. Шихлярова, Е.Ф. Комарова, Л.С.Козлова ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития РФ, директор - д.м.н., проф. О.И. Кит.
Резюме. В динамике развития С-45 в ткани легкого крыс самцов изучалось влияние сочетанного применения сверхнизкочастотных магнитных полей со СКЭНАР-терапией на состояние фибринолитической, калликреин-кининовой и гидролитической систем. Показана эффективность примененного воздействия, выражающаяся в восстановлении баланса компонентов протеолитической системы. Сделан вывод об участии сочетанного воздействия сверхнизкочастотными магнитными полями и СКЭНАР в формировании противоопухолевой резистентности.
Ключевые слова: перевивная опухоль, сверхнизкочастотные магнитные поля, СКЭНАР-терапия, протеолитические процессы.
Франциянц Елена Михайловна - д.б.н., проф. рук. гормональной лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт»; e-mail: super. gormon@yandex.ru.
Шихлярова Алла Ивановна - д.б.н., проф., гл. научный сотрудник института аридных зон ЮНЦ РАН; e-mail: super.gormon@yandex.ru.
Комарова Екатерина Федоровна - д.б.н., старший научный сотрудник гормональной лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт»; e-mail: super. gormon@yandex.ru.
Одним из неблагоприятных последствий активации процессов переокисления, вызванных недостатком антиокислителей, является нарушение лизосомальных мембран с последующей утечкой из них протеолитических ферментов. Подтверждением того, что протеолитические ферменты связаны со злокачественным ростом, служат корреляция между активностью различных катепсинов и опухолевой инвазией, а также эффективная терапия специфическими ингибиторами [10,12,13]. В настоящее время не вызывает сомнений участие протеолитической системы в различных звеньях канцерогенеза, так как она имеет непосредственное отношение к нарушению таких фундаментальных свойств клетки, как активное прикрепление к подложке, контактное торможение и стабилизация [2,5,9,11].
В связи с вышеизложенным представляло интерес исследование некоторых показателей системы протеолиза ткани легкого в условиях роста в ней С-45 для определения возможности коррекции злокачественного процесса сочетанным воздействием сверхнизкочастотными магнитными полями и СКЭНАР-терапией.
Материалы и методы
Для изучения антиканцерогенного влияния сочетания сверхнизкочастотных магнитных полей и СКЭНАР воздействия на состояние протеолитических систем ткани легкого в динамике роста в легком С-45 были исследованы следующие группы животных:
- контрольная группа - животные, которым была перевита в легкое С-45 без каких-либо воздействий (n=30);
- опытная группа - животные с перевитой в легкое С-45 с применением комбинированного электромагнитного воздействия (n=30).
В качестве группы сравнения использованы интактные самцы (п=20). Комплексное электромагнитное воздействие проводилось в конце 1-й недели после внутривенной перевивки клеток саркомы 45 и до момента гибели животных 4 раза в неделю. Производилось двойное воздействие физических факторов - сверхнизкочастотных магнитных полей (СНЧМП) с помощью магнитотерапевтического аппарата «Градиент-2» с микропроцессорным программным управлением (НПФ «Пульс» при ВНИИ «Градиент», г. Ростов-на-Дону) и СКЭНАР (электростимулятор, разработанный и произведенный ЗАО ОКБ «Ритм» г. Таганрог) без применения специального противоопухолевого химио- или лучевого лечения. Первым этапом комбинированной электромагнитной терапии являлось воздействие СНЧМП, осуществляемое на голову (в проекции гипофиза) животного-опухоленосителя, помещенного в пластиковую камеру, сконструированную с учетом норкового рефлекса для самофиксации животного. Воздействие СНЧМП проводилось в период 9-10 часов утра с использованием дискретной последовательности частот 0,03 Гц-0,3 Гц-9 Гц, временем предъявления сигнала соответственно 5 мин.-1 мин.-1 мин. и интенсивностью - 5 мТл-3,5 мТл-2,8 мТл, каждое из значений которой на протяжении курса уменьшалось по экспоненте с коэффициентом 0,7, доходя до уровня значений 0,8 мТл-0,5 иТл-0,3 мТл. Через 15-20 мин после первого воздействия следовало второе воздействие с использованием СКЭНАР-терапии, которое заключалось в обработке кожных покровов животного со стороны спины в проекции позвоночника (положение 1) и легких (положение 2), а со стороны живота (положение 3) - в проекции печени и иммунной зоны (грудина) импульсным электрическим током с порядком изменения частоты - 15,3 Гц, 18,6 Гц, 24,4 Гц, 30,5 Гц, 33,6 Гц, интенсивности - при положении 1 амплитуда ~ 135 у.е., при положениях 2 и 3 амплитуда от 60 до 30 у.е. (в зависимости от чувствительности) и модуляцией 2:1 сек.
Для исследования состояния системы протеолиза в 10% гомогенатах ткани легкого определяли: активность кислостабильных ингибиторов (КСИ) [1];
активность катепсина Д (катД) [4]; содержание кислой (КФ) и щелочной фосфатаз (ЩФ) унифицированным методом с использованием наборов реагентов фирмы «Ольвекс»; активность калликреина (К), уровень прекалликреина (ПК) и общую аргинин-эстеразную активность (ОАЭА) методом Т.С. Пасхиной с соавт. [7,8]; активность плазмина (П) и уровень плазминогена (ПГ) - методом Т.С. Пасхиной с соавт. [6]; активность кининазы [3]; активность а2-макроглобулина (а2-МГ) и ai-протеиназного ингибитора (ai-ПИ) методом иммуноферментного анализа с помощью тест-наборов фирмы Elisa. Исследование проводили на 3-й и 5-й неделе от момента перевивки опухоли, поскольку ранее было обнаружено, что эти сроки являются переломными в динамике роста злокачественной опухоли в легком у самцов (срок выхода опухолевых узлов и гибели животных соответственно).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакетов программ Statistica v. 6.0 (StatSoft, США). Оценку соответствия законов распределения исследуемых случайных величин закону нормального распределения осуществляли путем расчета основных числовых характеристик выборки и сопоставления значений среднего арифметического и медианы. Статистические гипотезы считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Оценку значимости различий средних значений показателя осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок.
Результаты и обсуждение
Результаты изучения состояния фибринолитической системы ткани легкого (табл. 1) на 3-й неделе после перевивки опухоли в легкое свидетельствовали о нормализующем влиянии электромагнитного воздействия на активность ферментов и их ингибиторов, а также на соотношение компонентов системы. В этот срок исследования было обнаружено, что уровень плазминогена, основного предшественника плазмина, в группе опытных животных уменьшался на 24% по сравнению с показателями контрольной группы. Снизилась также и активность фермента системы фибринолиза плазмина.
Данный показатель был ниже в 1,6 раза, чем у крыс контрольной группы в этот срок исследования. В связи с этим неизменным остался коэффициент соотношения ПГ/П относительно интактных животных. Следует отметить, что показатель соотношения ПГ/П у крыс без применения сочетанного воздействия также не изменялся на 3-й неделе исследования, как и в группе опытных крыс. Это может свидетельствовать о попытке системы поддержать биохимическое равновесие в ответ на изменившиеся условия. Влияние СНЧМП в сочетании со СКЭНАР терапией было обнаружено и при рассмотрении соотношения ингибитор/протеиназа. На 3-й неделе в опытной группе животных наблюдалось повышение в 1,7 раза соотношения а2-МГ и активности плазмина за счет усиления активности ингибитора а2-МГ в 1,2 раза относительно показателя у контрольных животных.
К 5-й неделе после перевивки опухоли в контрольной группе наблюдалось истощение субстратов протеолиза: уровень ПГ и активность плазмина резко снижалась - в 3,9 и 7,2 раза по сравнению с предыдудщим сроком исследования. Это отразилось на показателе соотношения в системе «протеаза-ингибитор», который увеличился почти в 7 раз по сравнению с 3-й неделей исследования. В отличие от показателей у животных контрольной группы, у крыс в опытной группе отмечалось восстановление большинства показателей до нормативных значений.
В динамике применения электромагнитного воздействия мы изучили состояние калликреин-кининовой системы ткани легкого крыс в условиях роста перевитой в легкое С-45 (табл. 2). На третьей неделе с момента перевивки опухоли в легкое в группе животных, не подвергавшихся противоопухолевой терапии, выросла общая аргининэстеразная активность (ОАЭА), активность калликреина и содержание прекалликреина по сравнению с показателями у интактных животных в 5,2, 1,7 и 6,4 раза соответственно. При этом отмечалось снижение активности основного ингибитора кининовой системы - кининазы -в 1,4 раза.
Кроме того, обнаружилось нарушение соотношения активности
универсального ингибитора протеолиза а1-ПИ и калликреина. Коэффициент a1-ПИ /К снизился в 2,6 раза за счет усиленной активности калликреина в ткани легкого. К пятой неделе в контрольной группе животных в целом выявлялось снижение активности и содержания ПК, К и ОАЭА относительно предыдущего срока исследования, однако они оставались выше значений, полученных у интактных животных. Активность кининазы резко почти в 6 раз снизилась по сравнению с 3-й неделей исследования. Соотношение а1-ПИ /К в этот срок исследования достоверно не изменилось.
В целом отмечалась выраженная разбалансировка в функционировании ККС в ткани легкого с усилением активности протеолитических ферментов и их предшественников на фоне сниженной активности ингибиторного звена.
После применения сочетанного электромагнитного воздействия на третьей неделе исследования уровень ПК в ткани был ниже, чем у контрольных крыс, не достигая значений у интактных животных. Активность калликреина, при этом, достоверно не изменилась по сравнению с показателями контрольной группы. Незначительно уменьшилась и ОАЭА с 7806,7± 567,1 до 6431,2±348,9 ЭЕ/г ткани. Необходимо отметить, что в этот срок исследования в опытной группе активность ингибитора кининазы была на уровне показателей у интактных животных. Коэффициент а1-ПИ/К увеличился в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой животных.
К пятой неделе в группе крыс после воздействия большинство изученных показателей значительно отличались от значений у животных контрольной группы в этом сроке исследования, и достигали фоновых показателей. Так, содержание ПК было снижено в 2,5 раза, активность калликреина - в 1,1 раза, ОАЭА - почти в 2 раза. Значение кининазы и коэффициент соотношения а1-ПИ /К, напротив, повысился соответственно в 8 и в 2 раза по сравнению с контрольной группой животных. Таким образом, отмечено, что применение воздействия сочетания СНЧМП и СКЭНАР ведет к нормализации состояния и ликвидации дисбаланса основных компонентов калликреин-кининовой
системы, что свидетельствует о выраженном противоопухолевом эффекте используемой терапии.
На 3-й неделе после перевивки опухоли в легкое (табл. 3), было показано повышение уровня катепсина Д в ткани легкого у крыс контрольной группы на 13% по сравнению с интактными животными. Активность кислотостабильных ингибиторов (КСИ) протеиназ в группе крыс с перевитой опухолью без применения воздействия была значительно, в 3 раза, снижена относительно нормы. Выявленное изменение активностей отдельных ферментов оказало свое влияние и на баланс в системе протеиназа-ингибитор: отмечалось резкое повышение коэффициента катД/КСИ в 3,2 раза по сравнению с интактными животными.
При исследовании активности фосфатаз в этот срок исследования было обнаружено, что в ткани легкого контрольной группы животных активность обеих была повышена по сравнению с нормативными показателями. Активность кислой фосфатазы увеличивалась в 9,3 раз, а щелочной - в 3 раза на 3-й неделе исследования. Нормальное протекание метаболических процессов зависит не столько от активности отдельно взятых ферментов, сколько от слаженности их физиологических каскадов. В этой связи мы изучили коэффициент КФ/ЩФ. Выяснилось, что этот показатель в ткани легкого на 3-й неделе после перевивки был повышен в 3 раза.
В экспериментах с применением сочетанного электромагнитного
воздействия в 3-ю неделю после перевивки опухоли в легкое были выявлены изменения состояния гидролитической системы ткани легкого крыс. Выяснилось, что предьявляемое в этот срок воздействие оказывало ингибирующее влияние на уровень катепсина Д: показатели активности фермента у крыс опытной группы были ниже в 1,2 раза, чем у крыс контрольной группы, и по значениям достоверно не отличались от нормы.
Значение показателя КСИ у крыс опытной группы оставалось на уровне
значений у интактных животных в отличие от резкого снижения его у контрольной группы крыс. При рассмотрении значений коэффициентов
соотношения катД/КСИ крыс опытной группы на 3-й неделе после перевивки опухолевого материала было выявлено существенное влияние примененного воздействия. Показатель катД/КСИ не отличался от нормативных значений, что свидетельствует о сбалансированности в работе сопряженных компонентов системы - гидролазы и ее ингибитора.
Не было обнаружено в этот срок исследования выраженного влияния примененного воздействия на активность фосфатаз в ткани легкого с растущей опухолью. Показатели КФ и ЩФ у крыс опытной группы не изменялись относительно параметров в контрольной группе. При этом не изменялся и коэффициент их соотношения.
К пятой неделе с момента перевивки в легкое С-45 и спустя 4 недели после воздействия СНЧМП и СКЭНАР (табл. 3) активность катепина Д достигла нормативных значений, хотя у крыс контрольной группы изучаемый показатель начинал снижаться в этом сроке исследования по сравнению с покзателем на 3-ей неделе и у интактных крыс. Активность КСИ оставалась на уровне значений, полученных в опытной группе в предыдущем сроке исследования и соответствовала значениям у интактных животных. Она была выше в 2,5 раза, чем у контрольных животных на 5-й неделе после перевивки. Коэффициент катД/КСИ снижался до 100,2±5,8 относительно 240 ±13,5 - у крыс контрольной группы, при этом у интактных животных коэффициент соотношения составил 97,4±5,6.
Следует отметить, что в этом сроке исследования происходила нормализация в функционировании фосфатаз в ткани легкого под влиянием примененного воздействия. Отмечалось резкое снижение активности кислой и щелочной фосфатаз относительно показателей у крыс всех изучаемых групп. Не достигая уровня значений у интактных животных, происходило восстановление до исходного уровня коэффициента соотношения КФ/ЩФ, что отражает преобладание гипероксического типа энергообеспечения ткани в отличие от выявленного в ткани легкого экспериментальных животных с растущей
опухолью на более ранних этапах развития неоплазмы как в контрольной, так и в опытной группе.
Полученные результаты свидетельствуют, что воздействие СНЧМП в сочетании со СКЭНАР - терапией, модулируя активность отдельных элементов изучаемых систем, способствовало восстановлению показателей, характеризующих протеолитические процессы в ткани, до уровня, характерного для интактных животных. Влияние сочетанного электромагнитного воздействия заключается в нормализации и последующем поддержании на нормальном уровне протеиназ и их ингибиторов. Положительный противоопухолевый эффект от примененного воздействия проявился и в увеличении сроков «выхода» опухолевых узлов, снижением их количества и размеров, а также увеличении продолжительности жизни животных (табл. 4).
Это свидетельствует о том, что СНЧМП, в сочетании со СКЭНАР воздействием, способны влиять на противоопухолевую резистентность организма и повышать его устойчивость к действию неблагоприятных факторов.
Таким образом, можно сделать вывод, что примененная экспериментальная терапия, с одной стороны, подтвердила патогенетическую значимость найденных нарушений системы протеолиза при росте и развитии опухоли в легком, с другой - является патогенетически обоснованным способом воздействия на злокачественный рост.
THE SYSTEM OF PROTEOLYSIS OF RAT LUNG TISSUE WITH INTERWOVEN C-45 IN USE OF COMBINED ELECTROMAGNETIC INFLUENCE
E.M. Frantziyantz, A.I. Shikhlyarova, E.F. Komarova, L.S. Kozlova
Federal State Budget Institution «Rostov Research Oncologic Institute»
Abstract. In the dynamics of the C-45 in lung tissue of male rats it was examined the effect of combined use of ultra-low frequency magnetic fields with SCENAR therapy on the state of the fibrinolytic, kallikrein-kinin and hydrolytic systems. It was shown the effectiveness of the intervention, expressed in the restoration of the components balance at the proteolytic system.
As a result there was conclusion about the participation of combined effects of ultra-low frequency magnetic fields and SCENAR in the antitumor resistance development.
Key words: interwoven tumor, ultra-low frequency magnetic fields, SCENAR therapy, proteolytic processes.
Литература
1. Веремеенко К.Н., Голобородько А.И., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - Киев: Здоровье, 1988. - С. 173-176.
2. Коровин М.С., Новицкий В.В., Васильева О.С. Роль лизосомальных цистеиновых протеиназ в опухолевой прогрессии // Бюл. сибирской медицины.
- 2009. - Т.8, №2. - С.85-90.
3. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Унифицированный метод определения активности альфа-1-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина в сыворотке (плазме) крови человека // Вопр. медиц. химии. - 1979. - Т. 25, вып. 4. - С. 494500.
4. Оглоблина О.Г. Кислотостабильные белки - ингибиторы протеиназ млекопитающих. Структура, свойства, биологическая роль // Биохимия. 1982. -Т.47, вып.10. - С. 1587-1599.
5. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Ткачук В.А. Система активаторов плазминогена в ремоделировании сосудов и ангиогенезе // Биохимия. - 2002. -Т. 67, вып. 1. - С. 139-156
6. Пасхина Т.С. Метаболизм кининов и современные перспективы его изучения // Кинины и кининовая система крови: сб. науч. тр. - М., 1976. - С. 3-
11.
7. Пасхина Т. С., Кринская А.В. Упрощенный метод определения калликреиногена и калликреина в сыворотке (плазме) крови человека в норме и при некоторых патологических состояниях // Вопр. мед. химии. - 1974. - Т. 20, вып. 6. - С. 660-663.
8. Пасхина Т.С., Яровая Г.А. Калликреин сыворотки крови человека. Активность фермента и хроматографический метод определения // Биохимия. -1970. - Т. 35, вып. 5. - С. 1055-1058.
9. Спирина Л.В., Кондакова И.В. Роль внутриклеточного специфического протеолиза в онкогенезе // Вопр. онкологии. - 2008. - Т.54, №6. - С. 690-694
10. Chekhun V.F., Kvotonyuk O.V., Todor I.N. et al. Total proteolytic activity and levels of the main proteinases inhibitors in blood plasma of mice bearing Lewis lung carcinoma upon development of resistance to cisplatin // Exp. Oncol. - 2005. -Vol. 4. - Р. 286-289.
11. Ferreras M., Felbor U., Lenhard T. et al. Generation and degradation of human endostatin proteins by various proteinases // FEBS Lett. - 2000. - Vol. 486. - P. -247-251.
12. Frohlich E. Proteasen in Malignomen // Dtsch. med. Wochenschr. - 2004. -Vol. 129, №8. - P. 391-395.
13. Oliver M. J., Matrisian L. M. Molecular imaging of proteolytic activity in cancer // J. Cell. Biochem. - 2003. - Vol. 90, №6. - P. 1087.
