CC BY
27
УДК 001.5:612.018.2:616-006.04
КИНИНОВАЯ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМЫ КРОВИ КРЫС В ДИНАМИКЕ ФОРМИРОВАНИЯ ПЕРЕВИТОЙ ОПУХОЛИ С-45
© 2010 г. Л.С. Козлова, Е.М. Франциянц, Е.М. Непомнящая, Е.Ф. Комарова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Rostov Research Oncological Institute,
14линия, 63, г. Ростов н/Д, 344037, 14 line, 63, Rostov-on-Don, 344037,
rnioi@list.ru rnioi@list.ru
Изучена активность компонентов кининовой и фибринолитической систем в сыворотке крови крыс-самцов в динамике перевитой в легкое саркомы-45. Показано, что нарушение баланса в метаболизме и взаимодействии изученных систем, выражающееся в гиперпродукции калликреина и плазмина, на фоне снижения активности их ингибитора способствует повышению проницаемости сосудов, миграции опухолевых и эндотелиальных клеток на территорию легкого, а также стимуляции неоангиогенеза и формированию вторичной опухоли.
Ключевые слова: перевитая опухоль, кининовая система, фибринолитическая система, проницаемость сосудов, миграция клеток.
Activity of components ofkinin and fibrinolytic systems in serum of blood of male-rats has been studied in dynamics of sarcoma-45 inoculated into lung. It has been concluded that disturbance in balance of metabolism and interaction of the systems under study manifested in hyperproduction of kallikrein and plasmin against the background of activity reduction of their inhibitor contributes to increase of vessels' permeability, migration of tumour and endothelial cells onto the lung territory, as well as to neogenesis stimulation and formation of secondary tumour.
Keywords: inoculated tumour, kinin system, fibrinolytic system, vessels' permeability, migration of cells.
Развитие неопластического процесса сопровождается, как правило, изменением функциональных отношений на уровне регуляции гомеостаза, осуществляемой единой регуляторной полифункциональной системой крови (калликреин-кининовой (ККС), фибринолитической и свертывающей) [1]. Динамичные отношения компонентов кининовой системы делают возможными ее быструю мобилизацию и вовлечение в патологический процесс любой этиологии и локализации [2].
Гуморальные системы организма существуют в тесном взаимодействии, в частности, калликреин (К) крови, кроме кининогеназной функции и стимуляции полиморфно-ядерных лейкоцитов, регулирует активность других протеолитических систем, например, фибринолитической [2]. Последняя представлена плазмином (П) и его неактивной формой - плазмино-геном (ПГ). Поскольку именно указанные системы контролируют жидкое состояние крови и функции сосудистой стенки, весьма важно выяснить их состояние при развитии онкологической патологии.
Многочисленные экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют об участии ККС в патогенезе самых различных заболеваний, в том числе онкологических. Тем не менее нельзя относить кини-новую систему к специальным факторам патогенеза. Регуляторная биологически активная система может стать участником патологических событий в организме только при условии нарушения ее нормальной физиологической функции. Патогенетические функции К плазмы крови наиболее ярко проявляются при недостаточности его ингибиторов, в первую очередь С1-инактиватора и а-2-макроглобулина. Нарушение баланса протеиназа-ингибитор часто является причиной патологического процесса [3].
Цель исследования - изучение кининовой и фиб-ринолитической систем сыворотки крови крыс-
самцов в динамике формирования перевитой в легкое опухоли С-45.
Материалы и методы
Исследовалась сыворотка крови 110 взрослых белых нелинейных крыс-самцов массой 200-220 г в динамике формирования перевитой в легкое опухоли С-45, а также 30 интактных животных. Перевивку производили путем введения в подключичную вену 0,5 мл взвеси, содержащей 2 млн опухолевых клеток, полученных от 5 крыс-самцов с традиционно перевитой саркомой С-45 в подкожную жировую клетчатку. Средняя продолжительность жизни самцов крыс с эктопическим ростом С-45 - 7 недель.
Изучены активность К, П, содержание их предшественников - прекалликреина (ПК) и ПГ, активность универсального ингибитора а-2-макроглобулина (а-2М) и кининразрушающего фермента - кининазы-1 (карбоксипептидазы М).
Определение компонентов ККС и системы плазми-ноген-плазмин (ПГ-П) в сыворотке крови крыс опытной группы проводили на 3 и 6-й неделе развития опухоли. На 3-й неделе после перевивки опухолевого материала у животных отмечались гистологически верифицированные опухолевые узлы; 6-я неделя - окончание терминальной стадии развития опухоли и жизни животных. Взятие крови осуществлялось утром, натощак, в одно и то же время после декапитации животного. Активность компонентов ККС и системы ПГ-П определяли унифицированными спектрофотометрическими методами, разработанными или модифицированными в лаборатории вазоактивных полипептидов Московского института биологической и медицинской химии [4, 5]. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ 81аЙ8Йса 6.0. Достоверность различий между количест-
венными показателями вычисляли по ^критерию Стъю-дента [6] и угловому преобразованию Фишера [7].
Результаты и обсуждение
Результаты исследования показали, что изменения активности компонентов ККС и системы ПГ-П сыворотки крови были неоднозначны в динамике опухолево-
го процесса в легких крыс. Так, на 3-й неделе наблюдений выявлена активация ККС, выраженная в достоверном увеличении количества ПК - на 43,6 %, активности К - в 2 раза, снижении активности а-2-М - на 53,7, ки-ниназы-1 - 54 % по сравнению с показателями у интакт-ных животных. Содержание ПГ к 3-й неделе развития опухоли снижалось на 80,7 %, активность П увеличивалась в 31 раз по отношению к норме (таблица).
Изменения ККС и ПГ-П в сыворотке крови крыс-самцов с перевитой в легкое С-45
Срок исследования К, мед/мл ПК, мед/мл Кининаза-1, мкмоль/мл a-2-М, ИЕ/мл ПК/К К/-а-2М К/кининаза-1 ПГ, КЕ/мл П, КЕ/мл ПГ/П П/а-2М
Интактные 43,80± ±1,05 191,6± ±2,2 0,700± ±0,032 4,446± ±0,12 4,4± ±0,05 10,0± ±0,23 62,6± ±0,13 2,093± 0,06 0,186± 0,01 11,2± 0,341 0,04± 0,01
3 нед.С-45 92,10± ±3,14* 275,1± ±4,3* 0,322± ±0,018* 2,057± ±0,11* 3,0± ±0,02 45,0± ±0,31 286,0± ±1,87 0,403± 0,03* 5,828± 0,09* 0,1± 0,001 2,83± 0,04
6 нед.С-45 98,20± ±2,82* 109,1± ±3 1** 0,327± ±0,012* 1,820± ±0,08** 1,1± ±0,01 54,0± ±0,38 300,3± ±1,72 0,155± 0,01** 0,868± 0,04** 0,2± 0,017 0,50± 0,02
Примечание. Изменения достоверны по отношению: * - к интактным животным; ** - к предыдущему сроку исследования.
Исходя из наших результатов, можно полагать, что к 3-й неделе после перевивки С-45 ККС активно задействована в сохранении и углублении уже состоявшихся нарушений проницаемости сосудистой стенки. Об этом же свидетельствует и активация ПК, которая осуществляется на поверхности сосудистого эндотелия [8].
Известно, что основной функцией кининов в плазме крови является регуляция гемодинамики и тонуса сосудов [2, 3]. При моделировании опухолевого процесса резкое возрастание активности К и одновременное достоверное снижение активности кининазы-1, вероятно, позволяют брадикинину более длительно осуществлять свое биологическое действие. Коэффициент активности К/кининаза-1 увеличивался в 4,6 раза (по сравнению с контролем) на 3-й неделе от момента перевивки опухоли, что подтверждает «поломку» в равновесии ККС и изменение ее нормальной функции при формировании перевитой опухоли, т.е. является подтверждением вовлечения в патологический процесс.
Нашими макро- и микроскопическими исследованиями ткани легких, а также состояния фибринолити-ческой системы установлено, что организм в этот период находится в состоянии гипокоагуляции с развитием геморрагического синдрома [9]. Тотальные кровоизлияния и образующиеся гематомы создают идеальные условия для «заселения» территории легких не только опухолевыми, но и эндотелиальными клетками из «разобранных» сосудов и как следствие стимуляции неоангиогенеза, формирования вторичной опухоли. Действительно, на 3-й неделе после перевивки на территории легких нами обнаружены очаги опухолевого роста. Есть основания считать, что усиленное генерирование брадикинина в первые недели развития перевивной опухоли является критическим событием в регуляции состояния сосудистого эндотелия и модулировании многих других процессов, определяющих функции сосудов, а также влияющих на развитие онкологической патологии.
Кроме кининогеназной функции, К плазмы крови способен непосредственно активировать ПГ, стимули-
руя освобождение П, что мы и наблюдали в динамике формирования перевитой опухоли С-45. Было установлено уменьшение на 3 -й неделе от момента перевивки опухоли коэффициента соотношения ПГ/П в 112 раз по отношению к норме. Свободный П, кроме выполнения своих основных функций, участвует в самых разнообразных биологических процессах, в том числе неопла-зии и неоваскуляризации [8]. Активация системы фиб-ринолиза в первые недели после перевивки С-45 предполагает образование в крови за короткий период времени большого количества продуктов деградации фибриногена, обладающих выраженной фибринолитиче-ской и повреждающей активностью [10].
В реакции организма на повреждающее действие протеиназ основная роль отводится ингибиторам про-теолиза - а-2-М, а-1-протеиназному ингибитору и а-1-антихимотрипсину [11]. Врожденный или приобретенный дефицит ингибиторов может привести к углублению процесса повреждения тканей и (или) развитию неопластического процесса. Обнаруженное нами на 3-й неделе развития опухоли снижение активности ингибитора К и П а-2-М, ответственного за выведение про-теиназ из плазмы крови через ретикулоэндотелиаль-ную систему, способствует максимальному проявлению биологических свойств и кининогеназного эффекта указанных ферментов, пролонгирует этот эффект. Известно, что именно комплекс а-2-М с П резко активирует секрецию мононуклеарами ингибиторов про-теиназ широкого спектра, в первую очередь а-2-М [12]. Координированная регуляция активности К и П в этом случае нарушается, ферментные каскады вовлекаются в патологический процесс на фоне нарушения сосудистой проницаемости, что необходимо для опосредованного воздействия опухолевого материала на стенку сосуда и ткань органа-мишени. Современные исследователи полагают, что как свободные, так и связанные формы К являются информативными маркерами злокачественных опухолей [13]. В нашем эксперименте соотношения активности фермента с его предшественником и ингибитором подтверждают экспрессию ККС: коэффициент ПК/К уменьшился на 30 %, а коэффици-
ент К/а-2-М возрос в 4,5 раза по отношению к норме (таблица). Благоприятные условия активации ККС на этом этапе развития онкологической патологии могут создаваться активной секрецией гидролаз [14], образующих поля отрицательно заряженных поверхностей на сосудистом эндотелии и клетках крови. Поступающие в кровь токсины, активная выработка антител и образование иммунных комплексов также способствуют мобилизации ККС. Мы предполагаем, что на 3-й неделе после перевивки опухоли увеличение фенестр под действием брадикинина, ослабление межклеточных контактов и деградация межклеточного матрикса под влиянием протеолиза способствуют миграции клеток сосудистого эндотелия на территорию органа-мишени и участию их в построении новых капилляров.
На 6-й неделе исследования, т.е. терминальной стадии развития опухоли, содержание ПК и ПГ достоверно снижен на 57 и 92,6 % по сравнению с нормой, активность К и П оставалась повышенной в 2,2 и 4,7 раза. В этот срок отмечены признаки истощения ККС, что не только выражалось в достоверном снижении содержания ПК при сохранении высокой активности К, но и подтверждалось снижением коэффициента их соотношения в 4 раза, увеличением коэффициента К/а-2М в 5,4 раза по отношению к интактным животным. Коэффициент активности К/кининаза-1 оставался высоким (увеличивался в 4,8 раза) по сравнению с фоновыми соотношениями. Система ПГ-П сохраняла однонаправленные изменения в течение всего исследования. В терминальной стадии опухолевого процесса коэффициент ПГ/П снижался в 56 раз, П/а-2М был повышен в 12,5 раза по сравнению с нормой, что демонстрирует активацию фибринолитической системы на протяжении всего срока жизни животных. В настоящее время существенно пересмотрен механизм активации и роль ККС в регуляции гемостаза. Ранее эта система рассматривалась в основном как начальный этап гемокоагулирующего каскада. Сейчас стало ясно, что она инициирует фибринолиз [8], что согласуется с нашими результатами. Калликреин непосредственно активирует плазминоген почти с той же эффективностью, что и урокиназный активатор ПГ (u-PA). Кроме того, плазменный К уже охарактеризован как кинетически эффективный активатор u-РА [8].
Эти системы настолько неразрывно связаны, что в последнее время их стали называть единой контактной системой. Если учесть, что П при образовании в больших количествах подавляет С-1-инактиватор (главный ингибитор К) [15], остается предположить, что именно К и П как непосредственно, так и опосредованно являются «виновниками» событий в сосудистом русле, приводящих к нарушению сосудистой проницаемости и миграции клеток при изучении перевитой опухоли С-45.
Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что при моделировании неопластического процесса in vivo нарушается баланс в метаболизме важнейших составляющих единой полисистемы крови - кининовой и фибринолитической. Проявлением этого нарушения является гиперпродукция
Поступила в редакцию_
ключевых ферментов указанных систем (К и П) на фоне снижения активности их ингибитора, что позволяет им стать участниками патологических событий в организме наряду со специальными факторами патогенеза. Последнее приводит к повышению сосудистой проницаемости и выходу опухолевых, а позднее и эн-дотелиальных клеток на территорию органа-мишени -в данном случае легкого, что способствует стимуляции неоангиогенеза и формированию вторичной опухоли.
Литература
1. Mоreel M, Leroy A. Clinical, cellular and molecular aspects of
cancer invasion // Physiol. Rev. 2003. Vol. 83. P. 337 - 376.
2. Пасхина Т.С. Метаболизм кининов и современные пер-
спективы его изучения // Кинины и кининовая система крови: сб. науч. тр. М., 1976. С. 3 - 11.
3. Дзизинский А.А., Гомазков О.А. Кинины в физиологии и
патологии сердечно-сосудистой системы. М., 1976. 207 с.
4. Пасхина Т.С., Кринская А.В. Упрощенный метод опре-
деления калликреиногена и калликреина в сыворотке (плазме) крови человека в норме и при некоторых патологических состояниях // Вопросы медицинской химии. 1974. Т. 20, вып. 6. С. 660 - 663.
5. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Унифицированный метод
определения активности альфа-1-антитрипсина и аль-фа-2-макроглобулина в сыворотке (плазме) крови человека // Вопросы медицинской химии. 1979. Т. 25, вып. 4. С. 494 - 500.
6. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработ-
ка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. М., 1990. 127 с.
7. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распо-
знавания патологических процессов. М., 1978. 132 с.
8. Яровая Г.А., Блохина Т.Б., Нешкова Е.А. Контактная
система. Новые представления о механизмах активации и биорегулирующих функциях // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 1. С. 16-29.
9. Морфологические изменения в легком самцов-крыс в
динамике злокачественного роста перевитой опухоли / Е.М. Франциянц [и др.] // Современные проблемы общей и частной патологической анатомии: материалы всерос. науч. конф. СПб., 2009. С. 144 - 145.
10. Levi M., Van der Poll T., Buller H.K. Bidirectional Relation
Between Inflammation and Coagulation // Circulation. 2004. Vol. 109. Р. 698-2704.
11. Ikari Y., Mulvihill E., Shwartz S.M. Alpha-1-proteinase inhibi-
tor, alpha-1-antichymotrypsin and alpha-2-macroglobulin are the antiapoptotic factors of vascular smooth muscle cells // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 11798-11803.
12. Жабин С.Г., Зорин Н.А., Мусатов М.И. Влияние плаз-
мина и его комплексов с альфа-2-антиплазмином и альфа-2-макроглобулином на секрецию ингибиторов протеиназ и плазминогена периферическими моно-нуклеарными клетками // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41, вып. 3. С. 34-37.
13. Боброва Т.С. Семейство калликреиновых генов челове-
ка: биология и роль в развитии рака яичников и других заболеваний // Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РМН. 2006. Т. 17, № 4. С. 3 - 11.
14. Yousef G.M., Scorilas A., Diamandis E.P. Genomic organi-
zation, mapping tissue expression and hormonal regulation of trypsin-like serine protease (TLSP PRSS20), a new member of the human kallikrein gene family // Genomics. 2000. Vol. 63. P. 88 - 96.
15. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. М., 2000. 253 c.
_20 августа 2009 г.
