Синтез поликатионного пептидного аналога олигодезокситимидиловой кислоты Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 547.466 + 547.854.4

СИНТЕЗ ПОЛИКАТИОННОГО ПЕПТИДНОГО АНАЛОГА ОЛИГОДЕЗОКСИТИМИДИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

Кван Чул Хюн

(кафедра химии природных соединений)

Осуществлен синтез нового пептидного поликатионного аналога олигодезокситимидиловой кислоты на основе д-орнитинового декамера, а именно: 5-К-(Ь-фенилаланил)-дека-5-К-[2'-К-(тиминил-1-аланил)-Ь-орнитил-Ьгаланина.

В последнее десятилетие возросло число работ в области синтеза аналогов олигонуклеотидов как в целях применения их в качестве потенциальных терапевтических средств для антисенсовой терапии, так и для молекуляр-но-биологических исследований [1]. Однако несмотря на большой успех в этой области и на множество модификаций структур олигонуклеотидов, остается актуальной задачей создание новых аналогов олигонуклеотидов, обладающих необходимыми антисенсовыми свойствами (высокой специфичностью и прочностью связывания с комплементарными последовательностями, устойчивостью к нуклеазной деградации, способностью проникать через клеточную мембрану, отсутствием токсичности и др.).

Среди наиболее перспективных аналогов олигонуклеотидов выделяются полиамидные аналоги ДНК, в которых сахарофосфатный остов заменен на электронейтральную псевдопептидную цепь. Эти аналоги получили название «пептидонуклеиновых кислот» (ПНК) (рис. 1) [2]. Несмотря на лидирующее положение этих аналогов среди других модифицированных олигонуклеотидов, они имеют некоторые недостатки, ограничивающие их применение в медицинской практике, такие как, например, слишком высокая устойчивость к действию протеолитических ферментов

организма и связанная с этим повышенная токсичность. Поэтому поиск новых структур олигонуклеотидов, в кото -рых углеводофосфатная цепь была бы заменена на другую, устойчивую к действию нуклеаз, но способную подвергаться протеолизу под действием ферментов, является важной задачей этой области исследований.

В продолжение исследований [3] в настоящей работе проводили разработку метода синтеза олигонуклеопепти-да (ОНП) (рис. 1), в котором сахарофосфатный остов заменен на истинную пептидную цепь. В задачу входило исследование олигомеров орнитина, содержащих остатки нуклеоаминокислоты - Ь-3-(тимин-1-ил)аланина (Та1).

В настоящей работе описан синтез нового аналога де-кадезокситимидиловой кислоты, содержащего пептидную цепь на основе дека-а-орнитина, в котором á-аминогруп-пы модифицированы остатками нуклеоаминокислоты Та1 (рис. 2). Кроме того, с N-конца пептид фланкировали Phe, с С-конца - Ala. Присутствие катионных групп в ОНП частично нейтрализует отрицательный заряд олигонуклео-тидов и тем самым улучшает проникновение в клеточную мембрану.

Первый этап нашей работы заключался в получении оптически активного Ь-3-(тимин-1-ил)аланина. Следующий

я. J

\

-К-— \

У

HC

H3C

H

о

T

о

о

P

о

T

T

T

о

о

HC

H3C

Рис. 1

NH,-Phe^'

la-OH

Рис. 2

этап работы включал синтез протяженных гомонуклео-пептидов орнитина. Как правило, при синтезе достаточно длинных пептидов используют твердофазный метод синтеза н(ТФМС) [4]. Схема синтеза представлена на рис. 3.

В качестве твердофазного носителя использовали смолу, содержащую 4-(гидроксиметил)фенилацетамидометиль-ную якорную группировку (PAM) [5], модифицированную аланином. Наращивание полипептидной цепи проводили, начиная от С-концевого остатка по направ-лению к N-концу. Для синтеза использовали трет-бути-локсикарбонильную (ВОС)-стратегию, которая в настоящее время наиболее широко применяется наряду с (FMOQ-стратегией, использующей щелочелабильную -флуоренилметилоксикарбонильную (FMOC) N-защитную группу [6] и позволяющей применять кислотолабильные группы для защиты боковых функций аминокислот. BOC группу вводили в Ь-3-(тимин-1-ил)аланин с помощью ди-трет-бутилпирокарбоната [7]. Эта защитная группа легко отщепляется безводной трифторуксусной кислотой либо 4 н. раствором HCl в диоксане. Пептидный синтез проводили в ручном варианте. Реакции сочетания выполняли с использованием гексафторфосфата О-(бензотриа-зол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU) [8]. Были применены 5-кратные избытки карбоксильной компоненты. Полноту реакции сочетания на каждом шаге проверяли при помощи теста Кайзера [9]. Полученные пептиды отщепляли от полимерного носителя трифторметан-сульфокислотой. Затем пептиды подвергали очистке гель-фильтрацией на сефадексе и на ВЭЖХ. Чистота конечного соединения доказывалась данными аминокислотного анализа гидролизата пептида, который показал наличие всех аминокислотных остатков в соотношении, соответствующем составу пептида.

Экспериментальная часть

2-Ы-(Тимин-1-ил)аланин [11]. Разделение рацемата на оптические антиподы и получение BOC производного L-изомера проводили по ранее описанным методикам [12].

2-Ы-ЕЫОС-5-Ы-БОС-Ь-орнитин. В двугорлой колбе, снабженной обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, суспендировали 3,25 г (14 ммоль) тонко измельченного d-BOC-L-орнитина в 33 мл сухого метиленхлори-да и при энергичном перемешивании вносили 4,7 мл (27,2 ммоля) диизопропилэтиламина. Затем добавляли 3,5 мл (28 ммоль) триметилхлорсилана и кипятили раствор в течение 1,5 ч. После охлаждения реакционной смеси на бане со льдом добавляли 2,4 г (9,З ммоля)

FMOC-хлорида в один прием, перемешивали в течение 20 мин при охлаждении и оставляли в течение 1,5 ч нагреваться до комнатной температуры. Упаривали растворитель на роторном испарителе и распределяли остаток между 30 мл эфира и 100 мл 2,5%-го раствора бикарбоната натрия. Водную фазу промывали (2x10 мл) эфиром, а эфирные вытяжки экстрагировали водой (2x10 мл). Объединенные водные слои подкислили 1 н. соляной кислотой до рН 2 и экстрагировали (3x30 мл) этилацета-том. Этилацетатные вытяжки сушили сульфатом натрия, фильтровали, удаляли растворитель и остаток перекрис-таллизовывали из смеси этилацетат-петролейный эфир (1:5). Выход: 2,6 г (63% от теоретического) Тш = 109-116°. Масс-спектр m/z+: 454, рассчитано 454,5.(C25H30N2O6). 1H ЯМР (ацетон) 5 7,85 (d, 2H, H4, H5), 5 7,72 (d, 2H, Hp H8), 5 7,42 (m, 2H, 3H, H6), 5 7,94 (m, 2H, H2, H7), 5 6,55 (sbr, 4H, NH-CHCOOH-), 5 5,79 (sbr, 1H, NH-CHCOOC(CH3)3), 5 4,37 (d, 2H, CH2OCONH-), 5 4,27 (m, 2H, CH-(COOH)NH- и H9), 5 3,14 (m, 2H, CH2-NH-CHCOOC(CH3)3), 5 2,00-1,40 (4H, CH2CH2-CHCOOH), 5 1,41 (s, 9H, C(CH3)3OCO).

Дека-2-К-[2'-К^МОС-Ь-орнитил]-Ь-аланил-РАМ-полимер

Подготовка растворов и реагентов для ТФМС. Раствор № 1: 50% CF3COOH/CH2CI2. Раствор № 2: 1,36 г FMOC-Orn(BOC) в 30 мл DMF (0,1 М), содержащий 0,075 мл N-метилморфолина. Раствор № 3: 0,967 г HBTU/30 мл DMF (0,085 М). Раствор № 4: 0,95 мл уксусного ангидрида + 1,1 мл N-метилморфолина в 30 мл DMF.

Протокол твердофазного синтеза.

1) Снятие ВОС-группы (раствор № 1, 5 мл, 2x2 мин).

2) Промывка СН2С12 (10 мл, 1x1 мин).

3) Промывка DMF/CH2CI2 (10 мл, 2x1 мин).

4) Процедура сочетания: к полимеру прибавляют последовательно по 3 мл раствора № 2 и раствора № 3, встряхивают в течение 30 мин.

5) Тест Кайзера: после 4-й стадии небольшое количество смолы вносили стеклянным шпателем в пробирку и промывали смесью ЕЮН:АсОН (1:1). Добавляли по капле 1 -го, 2-го и 3-го реагентов для теста Кайзера и нагревали 5 мин при 100o. О полноте прохождения реакции судили по отсутствию окрашивания смолы и раствора в синий цвет.

6) Промывка DMF / СН2С12 (10 мл, 2x1 мин).

7) Ацетилирование Ac2O (раствор №4, 5 мл, ЗО мин).

8) Промывка DMF/CH2CI2 (10 мл, 2x1 мин).

После снятия Вос-группы получили пептидилполимер следующего строения: 5-N-(2-N-FMOC-Orn)10-Ala-Pam. Аминокислотный анализ: Ala 1,30 (1), Orn 9,75 (10).

Модификация олигоорнитина включала реакцию образования пептидных связей между a-аминогруппами ор-нитиновых остатков и карбоксилом тиминилаланина. Предварительно к FMOC-защищенному декаорнитилала-нилполимеру для уточнения расчета данных аминокислотного анализа был присоединен остаток Boc-фенилала-нина, после чего FMOC-группы были удалены в обычных условиях.

O

FMOC___

м

вое'"'

+ NH2-Al,

1) HBTU + N-метилморфолин I ДМФА

2) 5G% CT3COOH

NH

" 1) HBTU + N-метилмор фолин I ДМФА FMOC-Orn(BOC)-OH

. 2) 5G% CT3COOH

BOC-Phe

HBTU + N- метилмор ф олин I ДМФА

NH

2G % Пиперидин

h^

BOC-Tal

HBTU + ^метилморфолин ДМФА

1G% TFMSA I CF3COOH

,-Phe-" '

5-К-(Ь-фенилаланил)-дека-5-К-[2'-К-(тиминил-1-аланил)-Ь--орнитил]-Ь-аланина

К 50 мг 5-N-(2-N-FMOC-Orn)10-Ala-Pam присоединили остаток BOC-Phe-OH процедурой сочетания с HBTU. FMOC-группы снимали, как описано выше. Затем к Boc-Fhe-пептидилполимеру присоединяли Boc-Tal-ОН, используя 50-ти кратный избыток реагентов (5-кратный в расчете на одну свободную аминогруппу). Boc-группы снимали обработкой пептидилполимера трифторуксусной кислотой, содержащей 5% триптофана. Отщепление пептида от РАМ полимера проводили обработкой 50 мг последнего смесью TFA и TFMSA (9:1) в течение 1 ч. Упаривали на роторном испарителе. После этого ОНП был очищен на смоле Sephadex G-10 в 1 M AcOH. Окончательная очистка пептида выполнялась на ВЭЖХ. Полученную сложную смесь пептидов удалось разделить при использовании 0,05-0,1%-й гептафтормасляной кислоты (HFBA) в качестве добавки к ацетонитрилу. Очистку проводили на колонке Diasorb 130 C1(/T (250x15 мм, 7,5 ц) с использованием линейного градиента следующей системы: 0,2% TFA + 0,1% HFBA в воде (система 1) - 0,1% TFA + 0,05% HFBA в ацетонитриле (система 2), от 0 до 30% системы 1 в системе 2 в течение 20 мин. Детекция выполнялась при 215 и 260 нм. Выход пептида 0,2 ммоль (10% от теоретического). Аминокислотный анализ: Fhe 1,00 (1), Tal 9,5 (10), Orn 10,5 (10), Ala 1,03 (1)

Таким образом, в результате проведенного исследования осуществлен синтез пептидного аналога олигодезок-ситимидиловой кислоты на основе олигоорнитина, модифицированного тиминилаланином. В настоящее время изучаются комплементарные свойства полученного аналога с соответствующей последовательностью природной адениловой кислоты. Автор выносит благодарность за научное руководство докт. хим. наук Г.А. Коршуновой и канд. хим. наук Н.В. Сумбатян.

Работа выполнялась при поддержке РФФИ (грант № 0004-48312).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zamecnik D.C., Stephenson ML // Froc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

1978. 75. Р. 280.

2. Nielsen E., Egholm, M, Berg, R.N., Buchard, O. II Science 1991.

254. F. 1497.

3. Sumbatyan N., Heun K.-C., Korshunova G. First International

Feptide Symposium IFS 97 Frogram & Abstracts. F. 104.

4. MerrifieldR.B. Il J. Amer. Chem. Soc. 1963. 85. F. 2149.

5. Tam J.P., Kent S.B. H., Wang I.W., Merrifield R.B. II Synthesis

1979. 12. F. 955.

6. Fields C.G., Noble R.L. II Int. J. Fept. Frot. Res. 1990. 35. F. 161.

7. Позднев В.Ф. II ХПС. 1974. С. 764.

8. Fields C.G., Lloyd D.H., Mac Donald R.L., Otteson K.M., Noble

R.L. II Feptide Res. 1991. 4. F. 95.

9. Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger G.D., Cook P.I. II Anal.

Biochem. 1970. 34. F. 594.

10. Tam J.P., Heath W.F., Merrifield R.B. II J. Amer. Chem. Soc. 1986. 1GS. F. 5242.

11. Doel M.T., Jones A.S., Taylor N. II Tetrahedron Lett. 1969. F. 2285.

12. Швачкин Ю.П., Воскова Н.А., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Купцова О.С., Яковлева И.В. II 1977. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 18. С. 482.

OH

о

HN

о

HN

9

о

10

о

NH

H

10

о

о

о

NH

Рис. 3

Поступила в редакцию 04.07.00