CC BY
49
УДК 547.831.8
А. А. Ботева, О. П. Красных, М. Ю. Томилов, М. И Вахрин, Е. Б. Бабушкина, Т. Ф. Одегова
Синтез и противомикробная активность метил 3-ароил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов
Пермская государственная фармацевтическая академия 614990 г. Пермь, ул. Ленина, 48; тел.: (342) 212-34-45; факс: (342) 212-94-76
Описывается синтез небольшой библиотеки соединений, содержащих 4-хинолоновый фрагмент, и результаты изучения их противомикроб-ной активности в отношении штаммов S. aureus АТСС 6538-Р, E.coli АТСС 25922.
Ключевые слова: метил 3-ароил-4-оксо-1,4-ди-гидро-2-хинолинкарбоксилаты, противомикроб-ная активность.
Размер финансовых и временных затрат на создание нового лекарственного препарата заставляет ценить полученные результаты не только как таковые — т. е. собственно лекарство, — но и всю совокупность информации, которая суммируется в ходе работ. В связи с этим перспективным направлением остается поиск новых применений известным лекарственным препаратам или их ближайшим аналогам. Яркий пример тому — «возрождение» талидамида 1 2. Работа с известной базовой структурой («скэффолдом») в этом случае позволяет с большей вероятностью прогнозировать токсичность соединений и фармакоки-нетические аспекты их поведения. Этот момент является весомым аргументом поиска биологической активности в ряду соединений, являющихся прямыми аналогами известных лекарств, по сравнению с внедрением соединений, имеющих совершенно новые структуры,
данные по токсичности и фармакокинетике которых на животных не системны, а на людях — отсутствуют. Поскольку новое приложение не обязательно должно быть напрямую связано с известным механизмом действия, модификации базовой структуры полезно проводить не в соответствии с известными КССА (количественное соотношение «структура — активность»).
4-Хинолоны применяются в клинической практике более 20 лет как успешные высокоэффективные антибактериальные препараты 3. Многие научные коллективы работают над созданием библиотек производных 4-хиноло-нов в связи с перспективностью исследования их биологической активности и поиском новых ее видов, кроме широко известных противо-микробной и противоопухолевой 4. Несмотря на это, наблюдается низкое разнообразие заместителей в 4-хинолоновом фрагменте 5. Используя известный метод получения 4-хи-нолонов реакцией термического декарбонили-рования замещенных пирролдионов 6, мы синтезировали небольшую библиотеку 4-хиноло-нов, содержащих различные заместители в положениях 3, 6, 7, 8, и провели исследования противомикробной активности полученных соединений.
O OH
COOCH
+
3
NH2
COOCH
°H'N
1a-c
3
(COCl)2
H3COOC N O
2a-c
R2
ai -co
H2O
R
HO
3a-c
R
OH
H3COOC N O
2
R1= n-BrC6H4_ R2=CH3 (b) R'= n-ClC6H4, R2=Br (c)
O
■Y
O
H3COOC N
АИК
Дата поступления 17.04.07
OO
H3COOC N
H
4a-c
O
O
R
R
R
2
R
2
R
2
R
2
R
R
Противомикробная активность синтезированных 4-хинолонов определялась методом двухкратных серийных разведений с последующим определением минимальной ингибирую-щей концентрации (МИК), которая устанавливалась по отсутствию видового роста микроорганизма в пробирке 7. Результаты испытаний представлены в табл. 1. Синтезированные соединения не активны или проявляют назкую бактериостатическую активность. Среди имеющегося ряда можно выделить 6 наиболее активных соединений (4d, g, I, п, p, t), причем активность носит избирательный характер. Хинолоны, активные на культуре C.albicans (4g, I, п, p, t), не активны на культурах S.aureus и Е.coli. И, наоборот, хинолон 4d, активный на Е.coli, не активен на C.albicans.
Таблица 1
Противомикробная активность соединений 4
O O
Rs O
№ R3 R2 R6 R7 R8 ПМА, МИК (мкг/мл)
S. aureus B.coli C.albicans
4а Ph OMe I H H 1000 1000 500
4b n-BrCKH, OMe Ме Н Н Н/а* Н/а
4c n-ClC6H4 OMe Br H H 1000 Н/а Н/а
4d Ph OMe H H H 1000 125 Н/а
4e Ph OMe OMe H H 1000 500 500
4f Ph OMe Cl H H 1000 1000 Н/а
4g Ph OMe Br H H 1000 1000 125
4h Ph OMe F H H Н/а Н/а Н/а
4i Ph OMe CO2Et H H 500 1000 1000
4j Ph OMe H H Ме Н/а 1000 Н/а
4k Ph OMe H Me Me 1000 Н/а 1000
41 Ph Ph H H H 1000 1000 250
4m Ph Ph OMe H H 1000 1000 500
4n Ph OH CO2H H H 1000 1000 125
4o n-MeC6H4 OMe Н Н Н Н/а Н/а
4p n-MeOC6H4 OMe H H H 1000 1000 250
4q n-EtOC6H4 OMe H Me Me Н/а Н/а Н/а
4r n-ClC6H4 OMe H H H Н/а Н/а Н/а
4s n-ClC6H4 OMe H Me Me 1000 Н/а 1000
4t n-BrC6H4 OMe H H H 1000 500 125
4u n-BrC^ OMe H H Me Н/а Н/а
4v n-NO,CKH4 OMe H H H Н/а Н/а Н/а
4w C4H3S OMe H H H 1000 1000 1000
4x C4H3S OMe Me H H Н/а Н/а 1000
4y C4H3S OMe Br H H 1000 500 500
4z C4H3S OMe F H H Н/а 1000 500
4aa C4H3S OMe CO2Et H H Н/а 1000 1000
* Н/а — не активно
Использованный нами метод получения 4-хинолонов 4а—с заключается во внутримолекулярной циклизации ацил(имидоил)кетена (АИК), генерируемого в результате термолиза замещенных метил-4,5-диоксо-4,5-дигидро-1^-пиррол-2-карбоксилатов 2а—с. Соединения 2а—с получаются с хорошими выходами при ацилировании метил-2-ариламино-4-оксо-Z-2-бутеноатов 1а—с оксалилхлоридом. Однако, являясь высокореакционными соединениями, диоксопирролкарбоксилаты 2 легко реагируют с водой, что приводит к образованию побочных метил 2,4-дигидрокси-5-оксо-2,5-дигидро-1^-пиррол-2-карбоксилатов 3а—с, которые были использованы для идентификации соединений 2.
Полученные данные отображены в виде диаграммы на рис. 1. В пяти группах столбцов показано количество веществ в процентах в зависимости от активности, проявляемой по отношению к соответствующему микроорганизму. Как видно из диаграммы, наблюдается некоторая селективность в отношении C.albicans, что может быть свидетельством перспективности исследования активности хи-нолонов в отношении дрожжевых грибков.
60
5S Я
а 50
к я ч <u О о
о m н о (U
Я
Ч
О «
20
10 —
4040,7 40 -Н
30 —
н/а
>100 100 50 25 12 Активность, МИК, мкг/мл □ St.aur ■E.Coli C.albicans
Рис. 1. Количество соединений в зависимости от активности к микроорганизмам
Экспериментальная химическая часть
ИК-спектры синтезированных соединений записаны на приборе «Specord-M80» в вазелиновом масле. ' Спектры ЯМР 1Н сняты на спектрометрах BS-567A с рабочей частотой 100МГц (внутренний стандарт — ГМДС), Bruker DRX-400 (внутренний стандарт — ТМС).
Контроль протекания реакций и чистоты синтезируемых соединений осуществляли с помощью ТСХ на пластинах Sorbfil. Характеристики синтезированных соединений и выходы приведены в табл. 2. Результаты элементного анализа соответствуют вычисленным значениям (С, Н, N, Hal).
Синтез соединений 4d—g, o, p, r, t, v описан в 6. Вещества 4h—i, w—aa описаны в статье, находящейся в печати, вещества 4j—m, q, s, u будут описаны позднее.
Общая методика синтеза метил-2-арил-амино-4-оксо-^-2-бутеноатов 1а—с. Смесь эк-вимолярных количеств метилового эфира аро-илпировиноградной кислоты и замещенного n-анилина кипятили в бензоле с насадкой Дина-Старка в интервале 2—21 ч. Растворитель упаривали, осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали. Выходы и физико-химические константы полученных соединений представлены в табл. 2.
Общая методика синтеза метил-4,5-диок-со-4,5-дигидро-1Н-пиррол-2-карбоксилатов 2а-с и метил-2,4-дигидрокси-5-оксо-2,5-ди-гидро-1 Н-пиррол-2-карбоксилатов 3а—с. К соединению 1 в абсолютном хлороформе прикапывали оксалилхлорид с избытком 5% и кипятили, защищая от влаги атмосферного воздуха,в течение 1.5—2 ч. Половину растворителя отгоняли, выпавший осадок соединения 2 отфильтровывали и промывали абсолютным хлороформом. Маточный раствор выпаривали, остаток перекристаллизовывали из смеси дихлорметан — гексан и получали производные 3.
Общая методика синтеза замещенных метил-3-(гет)ароил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хи-нолинкарбоксилатов 4. Соединение 2 выдерживали в абсолютном бифенилоксиде в интервале температур 180—220 оС в течение 15—40 мин в зависимости от заместителей. Выпавший при охлаждении осадок промывали гексаном, перекристаллизовывали.
Общая методика синтеза 1,4-дигидро-4-оксо-3,6-хинолиндикарбоновой кислоты 4n. 0.5 г (1.3 ммоль) вещества 4i в 1.5 мл 20% раствора гидроксида натрия в смеси вода — метанол 1 : 1 нагревали до кипения. После охлаждения раствор нейтрализовали серной кислотой (1 : 4), выпавший осадок отфильтровали, промыли водой, сушили.
Экспериментальная биологическая часть
Соединения 4 исследованы на наличие противомикробной активности (ПМА). В качестве растворителя использовали ДМФА.
Определение бактериостатической активности проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде 7. Для всех исследуемых соединений были определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в отношении фармакопейных штаммов: S. aureus АТСС 6538-Р, E. coli АТСС 25922, C. а^^т АТСС 885-653. Посевы производили в мясопептонный бульон,
0
Таблица 2
Физико-химические и спектральные характеристики синтезированных соединений
Соединение Выход, % Т. пл., разл., оС (растворитель) ИК-спектр (V, см 1) Спектры ЯМР 1Н, 5, м.д. (Л, Гц)
1а 71 143-145 (толуол) 1725 (СООСН3), 1600 (С6Н5СО, С=С) 3.76 (с, 3И, ОСИ3), 6.47 (с, 1И, СИ), 6.75 (д, Л = 8.8, 2Н, 2', 6'-Н), 7.44-7.55 (м, 3Н, 4-И, 3', 5'-Н), 7.61 (дд, 3Л = 9.4, 4Л = 2.0, 2Н, 3,5-Н), 7.94-7.96 (м, 2Н, 2,6-Н), 11.94 (с, 1Н, ЫИ)
1Ь 51 106-107 (толуол) 1736 (СООСН3), 1592 (ДгСО, С=С) 2.29 (с, 3Н, СН3), 3.67 (с, 3И, ОСИ3), 6.20 (с, 1И, СИ), 6.82 (д, Л = 7.4, 2Н, 3,5-Н); 7.04 (д, Л = 8.3, 2Н, 2', 6'-Н), 7.48 (д, Л = 8.4, 2Н, 3',5'-Н), 7.71 (д, Л = 8.4, 2Н, 2,6-Н); 11.90 (с, 1Н, ЫИ)
1с 54 191-193 (толуол) 1745 (СООСН3), 1615 (ДгСО), 1600 (С=С) 3.65 (с, 3И, ОСИ3), 6.25 (с, 1И, СИ), 7.24-7.33 (м, 4И, ДгИ), 6.73 (д, Л = 8.4, 2Н, 3,5-Н), 7.29 (д, Л = 8.3, 4Н, ДгН), 7.74 (д, Л = 9.3, 2Н, 3,5-Н), 11.74 (с, 1И, ЫИ)
2а 70 196-197 (хлороформ) 1770 (С2=О), 1740, 1720 (СООСН3, С3=О), 1630 (ДгСО), 1600 (С=С)
2Ь 44 180-181 (хлороформ) 1780 (С2=О), 1748, 1728 (СООСН3, С3=О), 1640 (ДгСО), 1584 (С=С)
2с 50 140-142 1780 (С2=О), 1720 (СООСН3, С3=О), 1680, 1640, 1590
3а 1 167-169 с разл. (хлороформ, петролейный эфир) 3475, 3220ш. (ОН), 1720 (СООСН3 С2=О), 1690 (С2=О), 1630 (ДгСО) 3.74 (с, 3Н, ОСН3), 5.01 (с, 1Н, ОН), 7.15 (д, Л = 8.7, 2Н, 2',6'-И), 7.47-7.51 (м, 2Н, 3',5'-И), 7.59-7.63 (м, 1Н, 4-Н), 7.73-7.76 (м, 2Н, 3,5-Н), 7.88-7.90 (м, 2Н, 2,6-Н)
3Ь 3 157-158 (дихлорметан, гексан) 3584, 3200 (ОН), 1760, 1708 (СООСН3 С2=О), 1676 (С2=О), 1632 (ДгСО), 1592 (С=С) 2.32 (с, 3Н, СН3), 3.70 (с, 3Н, ОСН3), 5.00 (с, 1Н, ОН), 7.45-7.72 (м, 8Н, ДгН)
3с 14 166-168 (дихлорметан) 3390 (ОН), 1760, 1725 (СООСН3 С2=О), 1675 (С2=О), 1625 (ДгСО), 1595 (С=С) 3.73 (с, 3Н, ОСН3), 5.00 (с, 1Н, ОН), 7.10-7.80 (м, 8Н, ДгН)
4а 98 263-265 (диоксан) 3300 (ЫИ), 1730 (СООСН3), 1685 (РЬСО), 1600 (С4=О) 3.75 (с, 3Н, ОСН3), 7.47-7.51 (м, 2Н, 3', 5'-И), 7.60-7.62 (м, 1Н, 8-Н), 7.80-7.85 (м, 3Н, 2', 4', 6'-И), 8.08 (дд, 3Л = 8.8, 4Л = 2.4, 1Н, 7-Н), 8.36 (д, Л = 2.0, 1Н, 5-Н), 12.51 (с, 1Н, ЫИ)
4Ь 90 237-238 (диоксан) 1736 (СООСН3), 1676 (ДгСО), 1600 (С4=О, С=С) 2.42 (с, 3Н, СН3), 3.75 (с, 3Н, ОСН3), 7.60-7.89 (м, 7Н, ДгИ), 12.32 (с, 1Н, ЫИ)
4с 40 248-250 (диоксан) 1750 (СООСН3), 1685 (ДгСО), 1600 (С4=О, С=С) 3.77 (с, 3Н, ОСН3), 7.54-7.57 (м, 2Н, 3',5'-И), 7.84-7.86 (м, 2Н, 2',6'-И), 7.96 (с, 2Н, 7,8-Н), 8.14 (д, 4Л = 4.0, 1Н, 5-Н), 12.61 (с, 1Н, ЫИ)
4п 88 >300 3590, 3300, 3160 (ОИ, ЫИ), 1730 пл., 1685, 1678, 1660 (СООН, СОРЬ), 1630 (С4=О), 1600 (С=С) 7.47-7.51 (м, 2Н, 3',5'-И), 7.60-7.62 (м, 1Н, 4'-Н), 7.84-7.86 (м, 2Н, 2',6'-И), 8.09 (д, 3Л = 8.0, 1Н, 8-Н), 8.24 (дд, 3Л = 8.0, 4Л = 4.0, 1Н, 7-Н), 8.65 (д, 4Л = 4.0, 1Н, 5-Н), 12.47, 12.68 (2с, 2Н, ЫИ, ОН)
рН 7.0 с различной концентрацией испытуемых соединений. Культуры выращивали в пробирках на скошенной агаризированной среде (мясопептонный агар). Для определения противомикробной активности использовали тест-культуру в логарифмической или ранней стационарной фазе роста, т. е. для большинства видов микроорганизмов — 18-часовую культуру. Для приготовления рабочей взвеси микробов производили смыв выросшей культуры изотоническим раствором хлорида натрия и устанавливали плотность микробной взвеси по стандарту мутности 5 единиц. Далее из полученной микробной взвеси (500 млн м т/мл) готовили рабочий раствор бактерий с концентрацией 5 млн м т/мл. Данную взвесь микробов вносили в количестве 0.1 мл в пробирки с серийными разведениями изучаемого препарата. Таким образом, микробная нагрузка при определении ПМА составила 250 000 м т/мл.
Учет результатов для бактерий производили через 18—20 ч выдержки контрольных и опытных пробирок в термостате при температуре 37 оС, а для грибов 25 оС. МИК устанавливали по отсутствию признаков роста микробов на питательной среде: последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МИК препарата в отношении данного штамма. Бактериостатический
эффект исследуемых соединений сравнивали с действием цефепима (цефалоспорин IV поколения) 8. Противогрибковая активность сопоставлялась с действием флуконазола 9. Результаты исследований приведены в табл. 1.
Литература
1. Teo S. K., Stirling D. I., Zeldis J. B. // Drug discovery today.- 2005.- V. 10, 2.- P. 107.
2. The drug repositioning summit: finding new routes to success. October 16-17, 2006, Cambridge Healthtech Institute, Philadelphia
3. Падейская Е. Н. // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.- Т.48, № 9.- С. 28.
4. Quinolone Antimicrobial Agents / Ed. by D. C. Hooper and E. Rubinstein.- Washington: ASM Press, 2003.
5. Kuznetsov V., Gorohovsky S., Levy A., Meir S., Shkoulev V., Menashe N., Greenwald M., Aizikovich A., Ofer D., Byk G., Gellerman G. // Molecular Diversity.- 2004.- V. 8.- P. 437.
6. Масливец А. Н., Красных О. П., Смирнова Л. И., Андрейчиков Ю. С. // ЖОрХ.-1989.- Т. 25, № 5.- С. 1045.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.- Москва: ЗАО «ИИА «Ремедиум», 2000.- 264 с.
8. Падейская Е. Н., Яковлев В. П. Антимикробные перпараты группы фторхинолонов в клинической практике.- М.: Лагота, 1998.- 351 с.
9. Падейская Е. Н., Мнацакаян В. Э. // Хим. фарм. ж.- 1993.- Т. 27, №6.- С. 19.
