СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ а-ХИМОТРИПСИНОЛИЗА РЕГУЛЯРНЫХ ПОЛИЭФИР АМИДОВ НА ОСНОВЕ ФЕНИЛАЛАНИНА, ДИОЛОВ И ТЕРЕФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, ¡999, том 41, № 9, с. 1388-1396

ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ

УДК 541.64:542.954:547.466

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ а-ХИМОТРИПСИНОЛИЗА РЕГУЛЯРНЫХ ПОЛИЭФИР АМИДОВ НА ОСНОВЕ ФЕНИЛАЛАНИНА, ДИОЛОВ И ТЕРЕФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ

© 1999 г. Д. Харадзе*, JI. Кирмелашвили*, Н. Медзмариашвили*, В. Беридзе*, Г. Цитланадзе*, Д. Тугуши*, С. С. Chu**, Р. Кацарава*

*Центр медицинских полимеров и биоматериалов Министерства здравоохранения Грузии,

Грузинский технический университет 380079 Тбилиси, п/я 24

**Fiber and Polymer Science and Biomedical Engineering Programs, Department of Textiles and Apparel,

Cornell University and Ithaca New York 14853^*401

Поступила в редакцию 05.10.98 г. Принята в печать 02.02.99 г.

Тремя различными методами — поликонденсацией активированных терефталатов с ди-л-толуол-сульфонатами ¿шс-(£-фенилаланин)-а,ю-алкилендиэфиров, взаимодействием быс-азлактонов с алифатическими диолами и поликонденсацией калиевых солей 1Ч,1Ч'-терефталоил-бис-£-фенилаланина с 1,2-дибромэтаном синтезированы регулярные полиэфирамиды, содержащие жесткие я-фениле-новые фрагменты в основных цепях макромолекул. Методом потенциометрического титрования в условиях, близких к физиологическому, изучен катализируемый а-химотрипсином специфический гидролиз полученных полиэфирамидных субстратов, а также ряда низкомолекулярных субстратов,, моделирующих элементарное звено полиэфирамида. Показано, что введение в состав молекул жестких и-фениленовых фрагментов вместо гибких полиметиленовых звеньев существенно понижает склонность к специфическому гидролизу как макромолекулярных, так и низкомолекулярных субстратов.

Биоаналогичные гетероцепные полимеры АА-ВВ типа на основе а-аминокислот, получаемые из доступных мономеров в мягких условиях с использованием несложных поликонденсационных методов, привлекает внимание как перспективные биодеградируемые материалы биомедицинского назначения. Этот подход позволяет синтезировать высокомолекулярные полимеры на основе полифункциональных а-аминокислот, таких как лизин, цистин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, или на основе димеризованных форм ос-аминокислот, вводить в основные цепи макромолекул разнообразные гетеросвязи - уретановые, мочевинные, амидные, дисульфидные и сложно-эфирные (см. работу [1] и литературу, цитированную там). Все это дает возможность в широких пределах варьировать строение и конформацию цепей макромолекул и соответственно физико-механические и биохимические свойства полиме-

ров как потенциальных биомедицинских материалов. Кроме того, подобные полимеры представляют интерес в качестве макромолекулярных субстратов для изучения зависимости катализируемого ферментами in vitro гидролиза от строения цепей, что в свою очередь может позволить прогнозировать поведение биодеградируемых материалов in vivo.

Недавно мы показали [1, 2], что регулярные полиэфирамиды (ПЭА) формулы 1, полученные на основе димеризованных форм аминокислоты - бис-(Ь-фенилаланин)-ос,со-алкилендиэфиров и алифатических дикарбоновых кислот (адипиновой и себаци-новой), подвергаются катализируемому а-химотрипсином in vitro гидролизу. В дополнение к наличию легко гидролизуемых сложноэфирных связей и варьированию гидрофильно-гидрофоб-ного баланса, конформационную подвижность

макроцепей следует рассматривать в качестве важнейшего фактора, вносящего вклад в склонность синтетических полимеров к биодеградации [3]. Справедливость этой мысли недавно была подтверждена нами в работе [4], в которой показано, что полимочевины на основе быс-(1,-фенилала-нин)-а,а)-алкилендиэфиров подвергаются in vitro а-химотрипсинолизу со значительно меньшей скоростью, чем соответствующие полиамиды и полиуретаны, по всей видимости, за счет более густой сетки межмолекулярных водородных связей, ограничивающих конформационную подвижность макромолекул. Возможное понижение конформаци-онной подвижности макроцепей было рассмотрено также в качестве одной из вероятных причин уменьшения скорости катализируемого а-химот-рипсином гидролиза эфирной связи при замене в ПЭА типа 1 (у = 4) L-фенилаланинового (Phe) остатка на дипептидный (Phe-Phe) фрагмент [5].

В настоящей работе мы решили гибкую поли-метиленовую цепь дикислотного остатка в ПЭА типа 1 заменить на жесткий и-фениленовый фрагмент и изучить его влияние на катализируемый

а-химотрипсином in vitro гидролиз соответствующих ПЭА типа 2. Для получения ПЭА типа 2 были опробованы три разных метода, однако получены лишь низкомолекулярные полимеры, пригодные, однако, в качестве субстратов для проведения запланированных исследований

-[СО(СН2)/ЮШСНСШ(СН2),ОСОСШН]- , CH2Ph CH2Ph

1

где л: = 2-4,6; у = 4, 8.

-[с04^ьс0ынснс00(сн2)хсх:0снмн]п-

CH2Ph CH2Ph

2

(jc = 2-4; * = L (2a) и DL (26)).

Синтез ПЭА типа 2а по методу А приведен ниже.

яХСО-<^)-СОХ + nTosOH • H2NCHCOO(CH2)^OCOCHNH2 • HOTos 2NEt3- 2a (1)

CH2Ph . CH2Ph

3 4

(jc = 2-4; X = 0-n-C6H4-NO2 (За) и o-C6F5 (36); TosOH = CH3-/j-C6H4-S03H).

Синтез ПЭА типа 26 по методу Б:

PhCH2\___XH2Ph

1 jLypSvJl 1 + "НО(СН2),ОН — 26 (2)

O^O'Xiri/^O о

5

(x = 3,4). V

Получение ПЭА типа 1 и 2 по методу В осуществляли в соответствии со схемой

иК+ X)OC<hHNHCORCONH<CHCOOK+ + пВг(СН2)2Вг — 1 или 2, CH2Ph CH2Ph

где * = 2; R = (СН2)4, * = L (6); R = * = L (7а); R = * = DL (76).

Формулы и обозначения модельных субстратов 8-10 приведены ниже

К'ООССНШСО-К-СОШСНССХЖ' СН2РЬ СН2РЬ

Здесь К = > К' = СН3) * = X (8а) и йЬ (86);

К = (СН2)4, ^ = СН3 (9); Я = К-' =

=-С^™2(10)-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Все растворители и триэтиламин (ТЭА) очищали по стандартным методикам. 1,3-Пропанди-ол и 1,4-бутандиол ("Пика") и 1,2-дибромэтан ("Реахим") очищали перегонкой в вакууме. НСЮ4 (70%), СР3СООН ("Реахим") и полиэтиленгли-коль - ПЭГ 40000 ("Пика") и дибензо-18-краун-6 ("АкМсЬ") применяли без дополнительной очистки. В работе использовали а-химотрипсин ('Т1и-ка") с активностью 50-60 ед/мг. Определение активности: одна единица гидролизует 1 мкмоль этилового эфира Ы-бензоил-^-тирозина ("Иика") за 1 мин при рН 7.8 и 25°С в 0.1 N растворе №С1.

Синтез мономеров

Активированный диэфир За (М = 408.32) [6], ди-и-толуолсульфонаты ¿»мс-(£-фенилаланин)-а,о>ал-килендиэфиров 4 (х = 2, М = 700.83; х = 3, М = = 714.86; х = 4,М = 728.90) [1, 2] и 2,2'-п-фенилен-4,4'-дибензил-А2-5-оксазолинон 5 (М = 424.46) [7] синтезировали и очищали как выше. Активированный диэфир 36 (М = 498.23) получали по методике, описанной ранее для ¿шопентафторфенил-изофталата [6] и очищали перекристаллизацией из хлорбензола; Тпл = 197-199°С. Элементный состав диэфира 36 соответствовал вычисленному. Дикислоты для получения солей 6 (А/ = 516.68) и 76 (А/ = 536.67) синтезировали как ранее [7]. Аналогично получали оптически активную дикисло-ту для приготовления соли 7а - Ы,Ы'-терефталоил-бис-Ь-фенилаланин, которая после перекристаллизации из ледяной уксусной кислоты имела Гпл = = 222-224°С и удельное вращение [а]й = -123 (в ДМАА, с = 5%, I = 10 см). Элементный состав данной дикислоты, ее ИК-спектр и кислотное число соответствовали приписываемой структуре. Соли 6 и 7 готовили нейтрализацией соответствующих дикислот в воде бикарбонатом калия до рН 8.5. Воду упаривали досуха и полученный

белый порошок сушили в вакууме при 120°С до постоянной массы.

Синтез модельных субстратов

Оптический неактивный модельный субстрат - диметиловый эфир Ы,№-терефталоил-быс-О^-фенилаланина 86 (Л/ = 488.54) - синтезировали кипячением бис-азлактона 5 (4 г) в среде абсолютного метанола (40 мл) в течение 5 ч в присутствии НСЮ4 в качестве катализатора. Полученный белый порошок отфильтровывали, сушили и перекристаллизовывали из хлороформа; Тш = = 223-224.5°С. Элементный состав и ИК-спектр соединения 86 (в нуйоле) соответствовали приписываемой структуре.

Оптический активный аналог диметиловый эфир М,Ы'-терефталоил-6ш:-£,-фенилаланина 8а получали по следующей методике: к раствору 6.47 г (0.03 моля) гидрохлорида метилового эфира ¿-фенилаланина (Т^ = 158-160°С, по лит. данным [8] Тш = 159-161°С) и 1.68 г (0.03 моля) КОН в 50 мл воды при охлаждении льдом добавляли раствор 3.04 г (0.015 моля) терефталоилхлорида в 20 мл бензола. Смесь сильно встряхивали и по порциям добавляли еще 1.68 г (0.03 моля) КОН в виде 10%-ного водного раствора. Выпавший белый осадок отфильтровывали, сушили и перекристаллизовывали из смеси хлороформа с гексаном; Тпл = 202-203°С. Элементный состав и ИК-спектр соединения 8а (в нуйоле) соответствовали приписываемой структуре. Удельное вращение [а]с = = -115 (в ДММА, с = 5%, I = 10 см).

Диметиловый эфир Ы,1Ч'-адипоил-6ис-£-фенил-аланина 9 (А/ = 468.55) получали аналогично соединению 8а, используя в приведенной выше методике вместо терефталоилхлорида 2.74 г (0.015 моля) ади-поилхлорида. Выпавший белый осадок отфильтровывали, сушили и перекристаллизовывали из смеси этил ацетата с гексаном; Т^ = 125-127°С. Элементный состав и ИК-спектр соединения 10 (в нуйоле) соответствовали приписываемой структуре. Удельное вращение [ос]0 = -20 (в ДМАА, с = = 5%, I = 10 см).

Ди-и-нитрофениловый эфир 1Ч,М'-терефтало-ил-бмс-0£-фенилаланина 10 (М = 702.68) синтезировали как ранее [5].

Синтез полимеров (общая методика)

Метод А. Взаимодействие активированных ди-эфиров 3 с ди-п-толуолсульфонатом 4 (схема (1)).

К перемешиваемой смеси 10 ммолей 3 и 10 ммо-лей 4 в 5.25 мл сухого ДМАА при комнатной

температуре добавляли 3.1 мл (~22 ммоль) сухого ТЭА (общий объем ДМАА + ТЭА = 8.33 мл, с = = 1.2 моль/л), температуру повышали до 65°С и перемешивали в течение 48 ч. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и выливали в холодную воду. Выпавший порошок отфильтровывали, тщательно промывали водой и сушили в вакууме при 30-40°С. Полученные результаты приведены в табл. 1. Элементный состав полимеров (определяли для образцов 3 и 6, табл. 1) соответствовал вычисленному. ИК-спек-тры (в нуйоле) образцов, полученных через соединения За и 36 полностью идентичны: в спектрах наблюдаются полосы 1660 (амид), 1720 (эфир) и 3350 см-1 (ЫН).

Метод Б. Взаимодействие ¿шс-азлактона 5 с диодами (схема (2)). К перемешиваемой смеси 10 ммоль диола и 4.2446 г (10 ммоль) кристаллического ¿шс-азлактона 5 в 16.6 мл органического растворителя добавляли катализатор и нагревали (использованные диолы, растворители и катализаторы, а также условия реакции даны в табл. 2).

Таблица 2. Синтез ПЭА типа 2а взаимодействием быс-азлактона 5 с диолами (концентрация каждого мономера 0.6 моль/л, продолжительность реакции 15 ч)

Образец, № НО(СН2уЭН со значениями х Реакционная среда Катализатор*, мкл Температура реакции, °С ПЭА типа 26

выход, % ,Дл/г

1 3 о-С6Н4С12 СР3СООН (20) 160 87 0.25

2 4 с6н6 НС104 (20) 80 86 0.10

3 4 с6н6 нсю4 (20) 80 81 0.11

4 4 сбн5мо2 НС104 (20) 120 89 0.22

5 4 о-С6Н4С12 НС104 (20) 120 91 0.27

6 4 *-СбН4С12 НС104 (20) 160 93 0.31

7 4 о-СбН4С12 СР3СООН (20) 160 96 0.40

8 4 о-СбН4С12 СР3СООН (80) 160 97 0.36

* 20 микролитров НСЮ4 (70%) соответствуют 0.23 мкмолям, а 20 микролитров СР3СООН (98%) - 0.25 мкмолям активного

катализатора; мольное соотношение мономер : катализатор = 40 : 1. В случае 80 микролитров - 10: 1. ** Приведенная вязкость в ж-крезоле, Т = 25°С, с = 0.5 г/дл.

Таблица 1. Синтез ПЭА типа 2а взаимодействием активированных диэфиров 3 с ди-и-толуолсульфонатами 4 в среде ДМАА

Образец, № Мономеры ПЭА типа 2а

3 4 со значениями х выход, % Лпр Ои-крезол), дл/л [а]д

1 За 2 91 0.20 -102

2 36 2 88 0.18 -108

3 За 3 92 0.24 -104

4 36 3 87 0.25 -

5 За 4 95 0.28

6 36 4 93 0.30 -

Примечание. Концентрация каждого мономера 1.2 моль/л, температура реакции 65°С, продолжительность 48 ч. * Удельное вращение при 20°С, с = 5%, ДМАА.

Таблица 3. Синтез ПЭА типа 1 и 2 взаимодействием калиевых солей 6 и 7 с 1,2-дибромэтаном в среде МП*

Образец, № Соль Катализатор* * Соотношение ПЭА (х = 2)

соль . С2Н4ВГ2'М°ЛЬ/Л 1 или 2 выход, % Л„р> Дл/Г [a]D

1 6 - 0.60:0.60 1 79 0.18 -18

2" 6 ПЭГ 40000 0.60:0.66 1 85 0.27 -99

3 7а 18-Краун-6 0.60:0.60 2а 94 0.17 -

4 7а 18-Крауи-б 0.60:0.66 2а 93 0.19 -

5 76 - 0.60:0.60 26 87 0.16 -

6 76 ПЭГ 40000 0.60:0.60 26 89 0.22 -

7 76 ПЭГ 40000 0.60:0.60 26 88 0.28 -

8 76 ПЭГ 40000 0.66:0.60 26 82 0.16 -

9 76 18-Краун-6 0.60:0.66 26 87 0.20 -

* Температура реакции 105°С, продолжительность 9 ч.

**. ПЭГ 40000 добавляли в количестве 1 мол. %; дибензо-18-краун-6 - из расчета 2 моля на 1 моль соли. *** Удельное вращение при 20°С, с = 5%, ДМАА.

При нагревании реакционная смесь гомогенизируется (бис-азлактон растворяется) и спустя 30 мин начинается выпадение полимера. Смесь перемешивали при указанной температуре в течение 15 ч и охлаждали до комнатной температуры. Выпавший белый порошкообразный полимер отфильтровывали, сушили, промывали водой (для удаления катализатора) и сушили в вакууме при 30-40°С до постоянной массы. Полученные результаты приведены в табл. 2. Элементный состав полимеров (определяли для образцов 4 и 7, табл. 2) соответствовал вычисленному, ИК-спектры (в нуйоле) - приписываемой структуре.

Метод В. Взаимодействие солей б и 7 с 1,2-ди-бромэтаном (схема 3). К перемешиваемой смеси 10 ммолей 6 или 7 в 16.7 мл ГЧ-метил-2-пирролидона (МП) (с = 0.6 моль/л) добавляли 1.8787 г (10 ммолей) 1,2-дибромэтана при комнатной температуре (в некоторых случаях к реакционной смеси добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ 40000 или ди-бензо-18-краун-6)) после чего смесь нагревали до 105°С. При этом наблюдается растворение солей 6 (или 7), и реакция протекает гомогенно, однако спустя ~1 ч начинается выпадение КВг, не растворимого в МП. Реакционную смесь перемешивали при 105°С в течение 9 ч, охлаждали до комнатной температуры и выливали в холодную воду. Выпавший белый порошок отфильтровывали, тщательно промывали водой и сушили в вакууме при 30-40°С. Полученные результаты приведены в табл. 3. Элементный состав полимеров (опреде-

ляли для образцов 2 и 7, табл. 3) соответствовал вычисленному, ИК-спектры (в нуйоле) - приписываемой структуре.

Измерения

ИК-спектры снимали на приборе "Specord М-80", УФ-спектры - на спектрометре "Specord UV-VIS" (оба "Carl Zeiss", Jena). Удельное вращение (fa]D) измеряли на поляриметре СМ-3 (Загорск). Приведенную вязкость полимеров определяли в ле-крезоле при 25°С и концентрации 0.5 г/дл. Кинетику катализируемого a-химотрипсином гидролиза алкиловых эфиров (как полимерных, так и модельных субстратов) изучали потенциомет-рическим титрованием (автоматический регистрирующий титратор "Radiometer RTS-822") карбоксильных групп, образующихся после гидролиза сложноэфирных групп как описывали ранее [2]. Лишь кинетику расщепления п-нитрофенилового эфира 10 изучали фотометрическим определением (при 430 нм) «-нитрофенола, выделяющегося после гидролиза сложноэфирных групп. Использовали порошкообразные субстраты, просеянные через сито № 01. Все реакции гетерогенны - субстраты в воде не растворяются. В случае ПЭА типа 2 и модельных субстратов 5 и 8 концентрация фермента равна 0.4 мг/мл, количество порошкообразного субстрата - 100 мг. В случае "активных" субстратов 1, 9 и 10 концентрация фермента составляла 0.04, 0.002 и 0.02 мг/мл, а количество субстрата -

10.0, 10.0 и 0.5 мг соответственно. Все субстраты вводили в виде мелкодисперсного порошка, кроме соединения 10, который добавляли в буферный раствор в виде 0.35%-ного раствора в диокса-не (в водной среде субстрат выпадает). Все эксперименты по гидролизу проводили в следующих стандартных условиях: 5 мл раствора (0.1 N NaCl или' фосфатного буфера), рН 8.2 (рН-оптимум фермента), Т = 37°С. В конце эксперимента активность фермента проверяли добавлением специфического субстрата - этилового эфира N-аце-тил-^-тирозина (АТЕЕ, "Sigma"). В каждом случае проводили по три параллельных опыта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Синтез полимеров

Поликонденсация активированных диэфиров 3 с ди-л-толуолсульфонатами 4 (метод А). Ранее мы показали [1, 2], что высокомолекулярные, гибко-цепные ПЭА типа 1 и их аналоги на основе других гидрофобных а-аминокислот, обладающие пленкообразующими свойствами, могут быть получены поликонденсацией ди-и-нитрофениловых эфиров алифатических дикарбоновых кислот с солями типа 4 в среде органического растворителя в присутствии ТЭА по уравнению (1). Оптимальными для данного процесса были найдены следующие условия: реакционная среда ДМАА, концентрация мономеров (каждого) 1.2 моль/л, температура 65°С, продолжительность 48 ч. В этих условиях были синтезированы ПЭА с приведенной вязкостью до 3.49 дл/г (Mw до 1.7 х 105 (ГПХ)) [1].

Исходя из этих данных, мы решили использовать указанный метод и для синтеза "жестких" ПЭА типа 2. Однако, поликонденсацией активированного ди-и-нитрофенилтерефтала За с солями 4 в приведенных оптимальных условиях были получены лишь низкомолекулярные, порошкообразные ПЭА формулы 2а (табл. 1).

Использование более активного [6, 9] пента-фторфенилового аналога соединения 36 не привело к значительному увеличению вязкостных характеристик полимера. Это можно связать со значительно меньшей активностью ароматичес-. ких диэфиров по сравнению с их алифатическими аналогами [10]. Такая разница в активности диэфиров, по-видимому, особо сказывается в поликонденсационных процессах с участием солей типа 4, протекающих со значительно более низкими скоростями по сравнению со свободными диаминами (ср., например, данные работ [1] и [6]). Отметим, что ПЭА Типа 2а, полученные по данной схеме, оптически активны (табл. 1).

Взаимодействие бкс-азлактона 5 с диодами (метод Б). Синтез ПЭА реакцией 2,2'-и-фенилен-бис-азлактона (2,2'-и-фенилен-4,4'-диизобутил-бис-А2-5-оксазолинона) с гександиолом-1,6 в среде хлороформа по уравнению (2), впервые был описан в работе [11]. Взаимодействием указанных соединений получен лишь низкомолекулярный полимер с логарифмической вязкостью, не превышающей 0.14 дл/г (м-крезол, 25°С). Использование кислотных или основных катализаторов, или повышение температуры реакции не привело к заметному увеличению молекулярной массы ПЭА. Более того, было показано, что третичные основания, использованные в качестве каталитических добавок, ведут к побочной реакции образования М,М'-ди-ацил-пиперазин-2,5-диона.

Для синтеза ПЭА типа 26 мы изучили аналогичную реакцию между бис-азлактоном 5 и диолами (х = 3 и 4), используя различные ароматические углеводороды (бензол, нитробензол и о-дихлорбен-зол) в качестве реакционной среды. Найдено, что в отсутствие катализатора, независимо от природы использованного растворителя, реакция между указанными соединениями не протекает даже при температурах до 160°С, и исходный бмс-азлактон 5 был выделен практически с количественным выходом. И лишь после введения кислотного катализатора (НСЮ4, СР3СООН) получены сравнительно низкомолекулярные, порошкообразные ПЭА типа 26 (табл. 2). ПЭА типа 26 с максимальной вязкость10 (Пор = 0.4 дл/г) синтезирован при взаимодействии 5 с 1,4-бутандиолом в среде о-дихлорбензола при 160°С с использованием СР3СООН в качестве катализатора. ПЭА типа 26, полученные по данной схеме, оптически неактивны, что закономерно, поскольку рацемичен сам исходный быс-азлактон.

Взаимодействие 1,2-дибромэтана с калиевыми солями 1^,1У-диацил-быс-фенилаланина 6 и 7 (метод В). Поликонденсация ос,о>-дибромалканов с калиевыми солями дикарбоновых кислот в среде МП при 105°С успешно была использована в работах [12, 13] для получения ряда функциональных полиэфиров. Мы решили применить этот подход для синтеза ПЭА типа 2 на основе калиевых солей 7 и 1,2-дибромэтана. В ряде случаев катализаторами реакции служили ПЭГ 40000 и ди-бензо-18-краун-6. Из данных табл. 3 видно, что использование небольшого избытка 1,2-дибром-этана (до 10 мол. %) приводит к некоторому увеличению, а использование избытка соли дикис-лоты - к понижению вязкости ПЭА типа 2. Добавление ПЭГ 40000 увеличивает вязкость ПЭА, не оказывая значительного влияния на их выход. Введение краун-эфира, напротив, повышает выход ПЭА, не влияя существенно на их вязкость.

Таблица 4. Результаты а-химотрипсинолиза полимерных и модельных субстратов (5 - количество порошкообразного субстрата, мг; Е - содержание фермента в 5 мл раствора, мг; У0 - начальная скорость реакции, мкмоль/мин, А - расход ИаОН, мкмоль/70 мин)

Субстрат S Е Vo/E А

1 дг = 2,у = 4[1] 1 дс = 2,у = 4 (табл. 3, образец 2) 10 0.2 0.13 -

10 0.2 0.16 ±0.3 -

2а

х = 2 (табл. 1, образец 1) 100 2.0 - 1-2

х = 3 (табл. 1, образец 4) 100 2.0 - 1-2

х = 4 (табл. 1, образец 6) 100 2.0 - 1-2

26

х = 3 (табл. 2, образец 1) 100 2.0 - 1-2

х = 4 (табл. 2, образец 7) 100 2.0 - 1-2

5 100 2.0 - 1-2

8а 100 2.0 - 1-3

86 100 2.0 - 1-2

9 10 0.01 142 ±15** -

10 0.5* 0.1 43 ±8 -

* Добавляли в виде 3.5%-ного раствора в диоксане. ** Для близких по строению модельных субстратов CH3CONHCH(CH2Ph)COO(CH2)xOCOCH(CH2Ph)NHCOCH3 были определены следующие значения Vq/Е: 128 (х = 2), 156 (jc = 3), 188 (дг = 4) [2].

В целом, приведенная вязкость ПЭА типа 2, полученных по данной реакции, не превышает 0.28 дл/г. Изменение природы дикислоты, т.е. переход от производных терефталевой кислоты - солей 7, к производной адипиновой кислоты - соли 6, к образованию высокомолекулярных ПЭА типа 1, по данной реакции, не привело. Отметим, что, согласно данным элементного анализа и ИК-спектроско-пии, полученный ПЭА типа 1 идентичен полимеру, синтезированному ранее [1, 2] по реакции, аналогичной приведенной на схеме (1) - взаимодействием ди-и-нитрофениладипината с солью 4 (х = 2). Близки и значения удельного вращения: [oc]D = —20 [1,2] и [ot]o = -18 (табл. 3). Значения [а]0 образца ПЭА типа 2а, полученного по данной схеме через соль 7а и по схеме (1) поликонденсацией соедине-

ния За с солью 4 (jc = 2), также близки (ср. данные табл. 1 и 3).

Изучение а-химотрипсинолиза ПЭА и модельных субстратов

Для оценки склонности ПЭА субстратов типа 1 и 2 к катализируемому а-химотрипсином гидролизу мы применяли метод потенциометрического титрования карбоксильных групп, высвобождающихся после гидролиза сложноэфирных связей [1,2]

-R'-COO-R2- + Н20 — -R'-COOH + HO-R2-

-R'-COOH + NaOH — -Ri-COONa + Н20

Таким образом, количество израсходованной щелочи соответствует количеству гидролизованных эфирных групп (моль/моль).

Цель настоящей работы - лишь характеристика общей тенденции синтезированных эфирных субстратов претерпевать in vitro а-химотрипсино-лиз. В рамках поставленной задачи гидролиз неактивных субстратов удобнее характеризовать расходом щелочи за определенный промежуток времени, а гидролиз активных - величиной VJE, поскольку в данных случаях количество фермента и субстратов варьируемо, чтобы добиться регистрируемых скоростей гидролиза. Поэтому а-химотрипсинолиз ПЭА типа 2 и модельных субстратов 5 и 8 оценивали расходом NaOH за 70 мин (один полный цикл автоматического титратора "Radiometer RTS-822"), а а-химотрипсинолиз субстратов 1, 9 и 10 - величиной VJE.

Было установлено, что в описанных выше условиях гидролиз ПЭА типа 2 в заметной степени не происходит, причем независимо от метода синтеза и оптических свойств ПЭА (расход NaOH/70 мин 1-3 мкмоль находится в пределах ошибки эксперимента, табл. 4). В то же время образец ПЭА типа \ (х = 2, у - 4), полученный по методу В, претерпевает гидролиз практически в той же степени, что и порошкообразный аналог, полученный ранее [2] взаимодействием ди-и-нитрофениладипината с солью 4 (jc = 2, у = 4). Причины низкой склонности ПЭА типа 2 к а-химотрипсинолизу могут быть следующие: эффекты макроцепей (ощутимые, например, при сравнении ПЭА типа 1 и соответствующих модельных субстратов [2]), ингиби-рование D-аминокислотными фрагментами (в случае ПЭА типа 2а их возникновение возможно в результате частичной рацемизации), конформаци-онная жесткость самих терефталамидных фрагментов, и непродуктивное связывание, сильно тормозящее реакцию в случае малоактивных алкиловых

эфиров (т.е. алкоксидных уходящих групп). Чтобы хоть в первом приближении ответить на эти вопросы, был синтезирован ряд модельных субстратов и поставлены дополнительные эксперименты.

В первую очередь изучили склонность к а-хи-мотрипсинолизу низкомолекулярных субстратов 8, моделирующих элементарные звенья ПЭА типа 2 и свободных от эффектов цепей. Указанные соединения, однако, как и полимерные субстраты (полученные на основе как ¿, так и БЬ фенил ал а-нина) не подвергаются а-химотрипсинолизу с заметной скоростью в условиях эксперимента. В то же время модельный субстрат 9, полученный на основе алифатической адипиновой кислоты, расщепляется с высокой скоростью: значение У^Е составляет ~50% от величины того же параметра, определенного для специфического субстрата -АТЕЕ, что согласуется с полученными ранее нами данными [2].

Низкая склонность производных терефтале-вой кислоты 8 могла быть связана с низкой активностью метиловых эфиров [10], обусловленной слабой метоксильной уходящей группой. Поэтому был изучен а-химотрипсинолиз циклического субстрата - бис-азлактона 5, проявляющего высокую электрофильную реакционную способность (например, в реакциях с аминами [7, 14]), сопоставимую с активностью и-нитрофенило-вых эфиров карбоновых кислот (ср. данные работ [9] и [14]). Было, однако, найдено, что данное вещество также не подвергается катализируемому а-химотрипсином гидролизу с заметной скоростью в условиях эксперимента.

Стабильность субстрата 5, помимо описанных выше тормозящих факторов, могла быть связана с жесткостью азлактонного цикла, препятствующей взаимодействию его карбонильной группы с активным центром фермента. Для прояснения этого вопроса мы решили изучить а-химотрипсинолиз нециклического субстрата 10, сопоставимого с 5 по реакционной способности [9, 14]. Гидролиз соединения 10 изучали фотометрическим измерением текущей концентрации «-нитрофенола, выделяющегося при гидролизе (при = 430 нм).

Эксперимент проводили в фосфатном буфере с рН 8.2. Для компенсации и-нитрофенола, выделяющегося за счет химического гидролиза в слабощелочной среде, в кювету сравнения помещали фосфатный буфер с таким же количеством субстрата (без фермента). Было найдено, что субстрат 10 подвергается а-химотрипсинолизу со скоростью 43 ± 8 мкмоль/мин (мг фермента). Таким образом, наличие ¿»-аминокислотных фраг-

ментов, возможно, и понижает скорость гидролиза, но не приводит к полной ее остановке. Следовательно, если ингибирование ¿»-аминокислотными фрагментами имеет место, то оно носит обратимый характер. В подтверждение этого приведем результат, полученный нами ранее [1]: ПЭА типа 1 на основе ¿»¿-фенил ал анина (х = 4, у = 4) расщепляется а-химотрипсином со скоростью, составляющей около 25% от скорости расщепления чистого ¿-изомера.

Чтобы удостоверится, что выделение «-нитрофенола происходит за счет каталитического гидролиза, а не в результате аминолиза соединения 10 свободными аминогруппами белка (как это имеет место при изучении ферментативного гидролиза и-нитрофениловых эфиров в среде ДМСО [15]), в контрольных опытах использовали денатурированный а-химотрипсин (фермент денатурировали кипячением в среде буфера в течение 5 мин). В присутствии денатурированного фермента выделение и-нитрофенола с заметной скоростью в условиях эксперимента не происходило, что свидетельствует о ничтожном вкладе реакции аминолиза.

В заключение отметим, что скорость а-химо-трипсинолиза субстрата 10 все же не так высока, как следовало бы ожидать с учетом высокой активности и-нитрофениловых эфиров - она сопоставима со скоростью гидролиза субстрата 9 с малоактивной метоксильной уходящей группой. Таким образом, введение ароматического и-фе-ниленового фрагмента вместо алифатических полиметиленовых цепей приводит к существенному понижению склонности эфирных субстратов (как полимерных, так и низкомолекулярных) к катализируемому а-химотрипсином гидролизу. Полученные данные позволяют сделать предположение, что это связано не только с понижением конформационной подвижности молекул, но и с непродуктивным связыванием [15], обусловленным повышенной гидрофобностью 1Ч-ацильного остатка. В целом полученные результаты согласуются с данными, приведенными в работе [15], согласно которым в процессах а-химотрипсино-лиза эфиры 1Ч-бензоил-а-аминокислот значительно менее активны, чем их 1^-ацетильные аналоги.

Настоящее исследование стало возможным вследствие гранта ОВ1-116 фонда США для гражданских исследований в странах бывшего СССР.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Katsarava R., Beridze V., Arabuli N.. Kharadze D., Chu C.C., Won C.Y. // J. Polym. Sei., Polym. Chem. (in press).

2. Arabuli N., Tsitlanadze G., Edilashvili L., Kharadze D., Goguadze Ts., Beridze V., Gomurashvili Z„ Katsara-vaR. // Makromol. Chem. Phys. 1994. B. 195. № 6. S. 2279.

3. Gilbert RD., Stannet V., Pitt C G., Schindler A. // Development in Polymer Degradation-4 / Ed. by Grassie N. Glasgow, UK: Chemistry Departament, The University, 1982. P. 259.

4. Kartvelishvili Т., Tsitlanadze G., Edilashvili L., Ja-paridze N., Katsarava R. // Makromol. Chem. Phys. 1997. B. 198. № 7. S. 1921.

5. Харадзе Д.П., Омиадзе Т.Н., Цитланадзе Г.В., Го-гуадзе ЦЛ., Арабули Н.М., Гомурашвили ЗД., Кацарава РД. // Высокомолек. соед. А. 1994. Т. 36. №9. С. 1462.

6. Кацарава Р., Харадзе Д.П., Авалишвили JIM. // Chimia Stosovana (Polish J. Appl. Chem.). 1986. V. 30. №2. P. 187.

7. Katsarava R., Kharadze D., Kirmelashvili L., Zaalish-vili M. Ц Acta Polymeries 1985. B. 36. № 1. S. 29.

8. Aldrich Catalogue Handbook of Fine Chemicals. 1996-1997.

9. Katsarava R., Kharadze D., Bendiashvili Т., Ur-man Ya.G., Slonim Ya.L, Cefelin P., Yanout V. // Acta Polymeries 1988. B. 39. № 9. S. 523.

10. Gordon V., Miller J.G., Day A.R. // J. Am. Chem. Soc. 1948. V. 70. № 5. P. 1946.

11. Cleaver C.S., Pratt B.C. H J. Am. Chem. Soc. 1955. V. 77. №6. P. 1541.

12. Sepulchre M.-O., Sepulchre M., Spasski N., Djonlagic J., Jacovic V.S. И Makromol. Chem. 1991. B. 192. № 5. S. 1073.

13. Sepulchre M.-O., ldrissi H.E., Sepulchre M„ Spasski N. // Makromol. Chem. 1993. B. 194. № 3. S. 677.

14. Хосруашвили T.A., Кирмелашвили Л.И., Харадзе Д.П., Кацарава РД. // Сообщ. АН ГССР. 1989. Т. 136. № 2. С. 329.

15. Клесов АЛ., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: МГУ, 1980. Ч. 2.

Synthesis and a-ChymotrypsinoIysis of Regular Poly(ester amides) Based on Phenylalanine, Diols, and Terephthaiic Acid

D. Kharadze*, L. Kirmelashvili*, N. Medzmariashvili*, V. Beridze*, G. Tsitlanadze*, D. Tugushi*, C. C. Chu**, and R. Katsarava*

*Center of Medical Polymers and Biomaterials, Ministry of Public Health of Georgia; Georgian Technical University,

P/B 24, Tbilisi, 380079 Georgia **Fiber and Polymer Science and Biomedical Engineering Programs, Department of Textiles and Apparel, Cornell University, and Ithaca, New York 14853-4401, USA

Abstract—Regular po!y(ester amides) containing rigid p-phenylene fragments in the backbone were synthesized by three different methods including (A) polycondensation of activated terephthalates with bis(L-pleny-lalanine)-a,a>-alkylene diester di-p-toluenesulfonates, (B) interaction of bisazlactones with aliphatic diols, and (C) polycondensation of N,N'-terephthaloyl- bis-L-phenylalanine potassium salts with 1,2-dibromoethane. Specific a-chymotrypsin-induced hydrolysis of the obtained poly(ester amide)s and some low-molecular-mass substrates, modeling the elementary unit of poly(ester amides), was studied by the method of potentiometric titration under nearly physiological conditions. Introduction of the rigid p-phenylene fragments instead of flexible poly(methylene) units markedly decreases the susceptibility of both low-molecular-mass substances and macromolecules to the specific hydrolysis.