CC BY
59
УДК 547.792.3.057
Е. Э. Клен, Г. Ф. Исхакова, Ф. А. Халиуллин, И. Л. Никитина, А. К. Булгаков, Е. К. Алехин
Синтез и биологическая активность тиетансодержащих 5-илиденгидразино-3-бром-1,2,4-триазолов
Башкирский государственный медицинский университет 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел. (347) 274-95-52
Изучены реакции тиетансодержащих 3,5-ди-бром-1,2,4-триазолов с гидразин-гидратом, и синтезированы их 5-гидразинопроизводные, реакциями которых с ароматическими альдегидами и кетонами получены 5-илиденгидразино-3-бром-1,2,4-триазолы, содержащие тиетано-вый, тиетаноксидный и тиетандиоксидный циклы. Структура синтезированных соединений подтверждена данными элементного анализа и ЯМР-, ИК-спектроскопии. Проведен фармакологический скрининг по тесту «гексена-лового сна» и исследована противомикробная активность. Установлено, что ни одно из исследуемых соединений не проявляет противомик-робной активности и не влияет на длительность гексеналового сна.
Ключевые слова: 1,2,4-триазол, тиетан, или-денгидразины, противомикробная активность, моноксигеназная система.
способности триазолов 1а-в в реакциях с гидразин-гидратом.
Нами установлено, что при кипячении соединений 1а-в с 3—5-кратным мольным избытком гидразин-гидрата в среде н-бутанола в течение 1 ч образуются 1-(тиетанил-3)- (2а), 1-(1-оксотиетанил-3)- (2б) и 1-(1,1-диоксотие-танил-3)-3-бром-5-гидразино-1,2,4-триазолы (2в) с выходами 41—82 % (схема 1). Элиминирования тиетандиоксидного цикла не наблюдалось.
On
Br^N Br H2N-NH2
0 n
b^^NH-NH2
1а-в
2а-в
Гетероциклические гидразины и их или-денпроизводные являются потенциальными биологически активными веществами с широким спектром действия. Среди них обнаружены соединения, проявляющие противомикроб-ную, противовирусную, противоопухолевую, психотропную и другие виды активности 1.
С целью синтеза новых биологически активных соединений нами исследованы реакции 3,5-дибром-1,2,4-триазолов, содержащих тие-тановый, тиетаноксидный и тиетандиоксидный циклы, с гидразин-гидратом.
Известно, что взаимодействие 1-(тиета-нил-3)- (1а) 2, 1-(1-оксотиетанил-3)- (1б) 3 и 1-(1,1-диоксотиетанил-3)-3,5-дибром-1,2,4-триа-золов (1в) 4 с различными аминами приводит к замещению атома брома по положению 5 триа-зольного цикла на остаток амина 3. В случае гидразин-гидрата, который является более «жестким» нуклеофильным реагентом, чем амины, возможно как замещение атома брома на остаток гидразина, так и элиминирование тиетандиоксидного цикла, которое наблюдалось нами при взаимодействии 1-(1,1-диоксо-тиетанил-3)-2-хлорбензимидазола 5 с гидразин-гидратом. В этой связи представляет интерес продолжение исследования реакционной
Дата поступления 24.06.08
n = 0 (1a, 2a), 1 (1б, 2б), 2 (1в, 2в)
(1)
Синтезированные гидразины 2а-в представляет собой белые кристаллические порошки, растворимые в растворах разбавленных кислот, ДМСО и ДМФА, не растворимые в диэтиловом эфире. Гидразины 2а,б растворяются в низших спиртах, а соединение 2в не растворяется.
Индивидуальность соединений 2а-в подтверждена данными ТСХ, структура доказана элементным анализом и ИК-спектроскопией.
Наличие в ИК спектрах соединений 2а-в полос поглощения валентных колебаний N—H связей в интервале 3028—3382 см -1 подтверждает замещение атома брома на остаток гидразина. В ИК-спектре соединения 2б наблюдается полоса поглощения валентных колебаний связи S=O при 1078 см -1, что подтверждает сохранность тиетаноксидного цикла. Полосы поглощения симметричных и асимметричных валентных колебаний связей SO2 наблюдаются при 1132 и 1312 см-1, что подтверждает сохранение тиетандиоксидного цикла в соединении 2в.
Для подтверждения строения гидразинов 2а-в, а также с целью поиска новых биологически активных веществ, нами изучены реакции последних с ароматическими альдегидами и кетонами.
г^ж „4=° гго=°"
ВГ N МИ-МИ2 -- Вг' N NN-N=1
2а-в
3а-х
NH-N=^-R Ar
метрической изомерии относительно С=Ы связи Е-изомерия). Однако данные ЯМР спектров свидетельствуют, что образуется только, стерически более устойчивый, Е-изо-мер.
/N\
п = 0 (2а, 3а-з), 1 (2б, 3и-о), 2 (2в, 3п-х) R = И (3а-в,з, и-к, п-с), СИ3 =(3г-ж, л-о, т-х),
Аг = СбИ4°И-2 (3а,и,п), С6И3°И-2, Вг-5 (3б,й,р), C6И4N(CИ3)2-4 (3в,к,с), С|^И2-4 (3г,л,т), СбИ4°И-4 (3д,м,у), С6И4 С1-4 (3е,н, ф), С6И4№2-4 (3ж,о,х) С(С!)=СИ-СбИ4№2-4(3з) (2)
Установлено, что оптимальными условиями для протекания реакций гидразинов 2а,б с ароматическими альдегидами является кипячение в среде этанола при мольном соотношении реагентов 1 : 1.1 в течение 0.5—1.5 ч. В случае реакции с ацетофенонами время реакции необходимо увеличить до 6 ч. Синтезированные 5-илиденгиразинопроизводные 3-бром-1-(тиетанил-3)- (3а-з) и 3-бром-1-(1-оксотиета-нил-3)-1,2,4-триазола (3и-о) образуются с выходами 68—99 % (схема 2).
Взаимодействие гидразина 2в с ароматическими карбонильными соединениями проводят в присутствии каталитических количеств хлористоводородной кислоты из-за его плохой растворимости в среде этанола при мольном соотношении реагентов 1 : 1.1. 3-Бром-5-арил-иденгидразино-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазолы (3п-х) образуются с выходами 50-85 % (схема 2).
Индивидуальность синтезированных соединений подтверждена данными ТСХ, а структура доказана элементным анализом, ЯМР 1Н и ИК-спектроскопией.
В ИК спектрах соединений 3з,ж,о,п,х наблюдаются полосы поглощения валентных колебаний связи С=Ы в области 1598-1654 см-1. Широкая полоса поглощения связи Ы-Н присутствует в интервале 3150-3620 см-1, что подтверждает образование илиденгидрази-нов. Сохранение тиетаноксидного цикла в соединении 3о подтверждает полоса поглощения валентных колебаний связи Б=0 при 1078 см-1. В ИК-спектрах соединений 3п,р,т,у,х регистрируются полосы поглощения симметричных и несимметричных валентных колебаний связей Б02, что подтверждает сохранение тиетан-диоксидного цикла.
5-Илиденпроизводные 3а-х могут существовать в виде двух стереоизомеров за счет гео-
N
H
R N
R' Ar
N H
Ar^ ^ R'
Z- изомер Е - изомер
R = 3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазолил-5
3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триазолил-5 3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазо-лил-5
R' = Н, СН3
Спектры ЯМР 1Н соединений 3в,е содержат сигналы протонов тиетанового цикла в характерных областях. В спектрах ЯМР соединений 3к,н содержатся сигналы протонов тиетаноксидного цикла в виде трех мультипле-тов, химические сдвиги которых свидетельствует о существовании данных сульфоксидов в виде цис-изомеров. Наличие только одного набора сигналов остатка п-диметиламинобен-зальдегида и п-хлорацетофенона, нерасщепленность синглета ЫН-группы свидетельствуют о присутствии только одного стерически более устойчивого Е-изомера.
Сохранение тиетандиоксидного цикла в илиденгидразине 3ф также подтверждается спектром ЯМР 1Н, который содержит сигналы протонов тиетандиоксидного цикла в характерных областях.
Экспериментальная химическая часть
Спектры ЯМР 1Н сняты на приборе Вгикег АМ-300 с рабочей частотой по протонам 300 МГц. В качестве растворителей были использованы дейтерированные хлороформ, диметилсульфоксид. Эталоном для отсчета химических сдвигов служили сигналы растворителей. ИК-спектры синтезированных соединений сняты на приборе «БресоЫ М-80» в виде суспензии в вазелиновом масле (2а,б,в,3ж,з,-о,п,х) и на спектрофотометре Инфралюм ФТ-02 (3и,р,т,у) в таблетках с калия бромидом. Данные элементного анализа синтезированных веществ соответствуют вычисленным значениям. Индивидуальность соединений подтверждена методом ТСХ на пластинах
811и£о1 с использованием в качестве подвижной фазы системы гексан — этанол (4 : 1) и бу-танол — ледяная уксусная кислота — вода (4 : 1 : 2), проявление — парами йода.
Гидразины (2а-в).
Раствор 4 ммоль соединений 1а-в в 25 мл н-бутанола и 1.30 г (20 ммоль) 56.8%-го раствора гидразин-гидрата, кипятят в течение 1 ч. Реакционную смесь упаривают под вакуумом до образования сухого остатка. Полученный осадок промывают водой, сушат.
3-Бром-5-гидразино-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (2а). Выход 75%. Т.пл.= = 175-176 оС (вода). С5Н8ВгЫ58. ИК-спектр, Ппах, см-1: 1654 (С=Ы), 3028, 3142, 3208 (Ы-Н).
3-Бром-5-гидразино-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (2б). Выход 41%. Т.пл. = = 140-142 оС (н-пропанол). С5Н8ВгМ5О8. ИК-спектр, утах, см-1: 1078 (Б=0), 1576 (С=Ы), 3268, 3340, 3382 (Ы-Н).
3-Бром-5-гидразино-1-(1,1-диоксотиета-нил-3)-1,2,4-триазол (2в). Выход 82%. Т.пл.=217-219 оС (изо-бутанол). С5Н8ВгМ5О28. ИК-спектр, утах, см-1: 1132, 1312 (Б02), 1588 (С=Ы), 3040, 3244, 3376 (Ы-Н).
5-Илиденгидразинопроизводные 3-бром-1,2,4-триазолов, содержащих тиетановый (3а-з) и тиетаноксидный (3и-о) циклы. К раствору 4 ммоль соответствующего гидразина 2а,б в 25 мл этанола добавляют 4.4 ммоль соответствующего альдегида или кетона. Реакционную смесь кипятят 0.5 ч (3в), 1 ч (3а,б,з,й,к), 1.5 ч (3и,о), 2 ч (3ж,л,н), 5 ч (3д,е) или 6 ч (3м). Охлаждают, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат.
5-(2-Гидроксифенил)метилиденгидрази-но-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (3 а).
Выход 89%. Т.пл. = 239-240 оС (изо-бутанол). С^Н^Вг^ОБ.
5-(5-Бром-2-гидроксифенил)метилиден-гидразино-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триа-
зол (3б). Выход 86%. Т.пл. = 221-222 оС (изо-бутанол). С^НцВ^^ОБ.
5-(4-Диметиламинофенил)метилиденгид-разино-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол
(3в). Выход 92%. Т.пл. = 250-251 оС (изо-бу-танол). С14Н17ВгМ68. ЯМР *Н-спектр (СDC13), 5, м.д.: 3.06 (6Н, с, Ы(СН3)2), 3.30-3.50 (2Н, м, Б(СН)2), 4.07-4.25 (2Н, м, Б(СН)2), 6.32-6.55 (1Н, м, ЫСН), 6.72 (2Н, д, J 8.8 Гц, 3,5-СНС6Нз), 7.51 (2Н, д, J 8.8 Гц, 2,6-СНС6Н5), 8.00 (1Н, с, Ы=СН), 10.03 (1Н, с, ЫН).
5-[1-(4-Аминофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (3г).
Выход 85%. Т.пл. = 215-217 оС (диоксан-вода). C13H15BrN6S.
5-[1-(4-Гидроксифенил)этилиден]гидра-зино-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (3д). Выход 68%. Т.пл. = 235-237 оС (н-бута-нол). C13H14BrN5OS.
5-[1-(4-Хлорфенил)этилиден]гидразино-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (3е). Выход 75%. Т. пл. = 187-189 оС (этанол). C13H13BrClN5S. ЯМР *Н-спектр (CDCl3), 5, м.д.: 2.29 (3Н, с, =CCH3), 3.22-3.40 (2Н, м, S(CH)2), 4.04-4.20 (2Н, м, S(CH)2), 6.17-6.28 (1Н, м, NCH), 7.42 (2Н, д, J 8.5 Гц, 2,6-СНС6Н5), 7.63 (2Н, д, J 8.5 Гц, 3,5-СНС6Н5), 8.77 (1Н, с, NH).
5-[1-(3-Нитрофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазол (3ж). Выход 89%. Т. пл. = 182-184 оС (н-бутанол). Cí3H13BrN602S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1378, 1504 (NO2), 1612 (C=N), 3350 (N-H).
5-[3-(4-Нитрофенил)-2-хлораллилиден]-гидразино-3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-три-азол (3з). Выход 94%. Т. пл. = 235-237 оС (н-бутанол). C14H12BrClN602S. ИК-спектр, W, см-1: 1378, 1516 (NO2), 1654 (C=N), 3150-3620 (N-H).
5-(2-Гидроксифенил)метилиденгидрази-но-3-бром-1-( 1-оксотиетанил-3)-1,2,4-три-азол (3и). Выход 68%. Т. пл. = 245-246 оС (н-бутанол). C12H12BrN502S.
5-(5-Бром-2-гидроксифенил)метилиден-гидразино-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3й). Выход 71%. Т. пл. = =240-241 оС (диоксан-вода). C12H12Br2N502S.
5-(4-Диметиламинофенил)метилиденгид-разино-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3к). Выход 99%. Т. пл. = 235-237 оС (н-пропанол-вода). C14H17BrN60S. ЯМР *Н-спектр (DMSO-d6), 5, м.д.: 2.95 (6Н, с, N(CH3)2), 3.52-3.75 (2Н, м, S(CH)2), 3.82-4.00 (2Н, м, S(CH)2), 6.20-6.38 (1Н, м, NCH), 6.72 (2Н, д, J 8.6 Гц, 3,5-СНС6Н5), 7.49 (2Н, д, J 8.6 Гц, 2,6-СНС6Н5), 7.90 (1Н, с, N=CH), 11.15 (1Н, с, NH).
5-[1-(4-Аминофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триа-зол (3л). Выход 87%. Т. пл. = 236-238 оС (изо-бутанол). Q^^BrN^S.
5-[1-(4-Гидроксифенил)этилиден]гидра-зино-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-три-азол (3м). Выход 79%. Т. пл. = 240-242 оС (н-бутанол). С13Н14ВШ5О^.
5-[1-(4-Хлорфенил)этилиден]гидразино-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-триазол
(3н). Выход 82%. Т. пл. = 247-249 оС (н-бута-нол). C13H13BrClN5OS. ЯМР *Н-спектр (DMSO-d6 и CCl4), S, м.д.: 2.28 (3Н, с, =CCH3), 3.50-3.72 (2Н, м, S(CH)2), 3.79-4.00 (2Н, м, S(CH)2), 6.20-6.49 (1Н, м, NCH), 7.42 (2Н, д, J 8.6 Гц, 2,6-СНС6Н5), 7.72 (2Н, д, J 8.6 Гц, 3,5-СНС6Н5), 10.43 (1Н, с, NH).
5-[1-(3-Нитрофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(1-оксотиетанил-3)-1,2,4-три-азол (3о). Выход 91%. Т. пл. = 246-248 оС (1,4-диоксан). C13H13BrN603S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1340, 1504 (NO2), 1598 (C=N), 3280-3600 (N-H).
5-Илиденгидразинопроизводные 3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазола (3п-х). Общая методика. К 1.13 г (4 ммоль) гидразина 2в в смеси 50 мл этанола и 12 мл воды добавляют 0.6 мл хлористоводородной кислоты и 4.4 ммоль соответствующего альдегида или кетона. Реакционную смесь кипятят 1 ч (3п,р,х), 1.5 ч (3с) или 5 ч (3т,у,ф). Охлаждают, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат.
5-(2-Гидроксифенил)метилиденгидрази-но-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3п). Выход 74%. Т. пл. = 272-273 оС (ДМФА-вода). C12H12BrN503S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1132, 1312 (SO2), 1654 (C=N), 3028, 3094, 3154, 3688, 3850 (N-H, ОН).
5-(5-Бром-2-гидроксифенил)метилиден-гидразино-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3р). Выход 84%. Т. пл. = = 258-260 оС (н-бутанол). C12H11Br2N503S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1129, 1323 (SO2), 1625 (C=N), 3294-3479 (N-H, ОН).
5-(4-Диметиламинофенил)метилиденгид-разино-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3с). Выход 85%. Т. пл. = 252-253 oC (изо-бутанол). C14H17BrN602S.
5-[1-(4-Аминофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3т). Выход 50%. Т. пл. = 227-229 °C (ДМФА-вода). C13H15BrN602S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1132, 1326 (SO2), 1581 (C=N), 3214, 3278, 3335, 3450 (N-H).
5-[1-(4-Гидроксифенил)этилиден]гидра-зино-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3у). Выход 65%. Т. пл. = 243-245 0C (изо-бутанол). C13H14BrNs03S. ИК-спектр, vmax, см-1: 1132, 1323 (SO2), 1589 (C=N), 3032, 3301, 3381, 3415 (N-H, О-Н).
5-[1-(4-Хлорфенил)этилиден]гидразино-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-три-азол (3ф). Выход 63%. Т. пл. = 237—238 оС (этанол). C13H13BrClN502S. ЯМР *Н-спектр (DMSO-d6), S, м.д.: 2.30 (3Н, с, =CCH3), 4.55-4.80 (4Н, м, 2S(CH)2), 5.65-5.85 (1Н, м, NCH), 7.48 (2Н, д, J 8.6 Гц, 2,6-СНС6Н5), 7.75 (2Н, д, J 8.6 Гц, 3,5-СНС6Н5), 10.55 (1Н, уш. с, NH).
5-[1-(3-Нитрофенил)этилиден]гидрази-но-3-бром-1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазол (3х). Выход 75%. Т. пл. = 263-265 оС (1,4-диоксан). С13Н13Вг^О^. ИК-спектр, vmax, см-1: 1138, 1318 (SO2), 1142, 1588 (NO2), 1612 (С=Ю, 3280, 3304 (N-H).
Экспериментальная биологическая часть
Влияние соединений 3а,д,к,с на моноок-сигеназную систему (МОС) печени оценивали по тесту «гексеналового сна» (ГС), отражающего, преимущественно, активность CYP2B6. Эксперименты выполнены на половозрелых неинбредных мышах-самцах массой 18-22 г, полученных из ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа). Соединения разводили ex tempore в 2% крахмальной взвеси, вводили в дозах 5 и 50 мг/кг внутрижелудочно 2 раза с интервалом 24 ч, через сутки проводили тестирование (табл. 1).
Таблица 1 Влияние соединений 3а,д,к,с на длительность гексеналового сна
№ соединения Доза, мг/кг Количество мышей Длительность гексеналового сна, сек
контроль — 5 63 ± 8
3а 5 7 57 ± 13
50 8 51 ± 6
3д 5 7 97 ± 20
50 8 49 ± 12
3к 5 7 57 ± 8
50 7 52 ± 7
3с 5 7 74 ± 16
50 8 60 ± 14
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA) и Excel 2003 (MS Office 2003, USA). Алгоритм статистического анализа включал следующие этапы: 1. определение нормальности распределения (с использованием показателей асимметрии, эксцесса, критерия Колмогорова-Смирнова); 2. расчет базовых статических показателей, характеризующих вариационные ряды (среднее арифметическое значение, М; стандартная ошибка
средней арифметической, m; варианса (дисперсия), s2; среднее квадратическое отклонение (стандартное отклонение), s; доверительный интервал при уровне значимости p = 0.05); 3. тест Краскела — Уоллиса (Н-крите-рий); 4. оценку достоверности статистических показателей: Q-критерия Дана 7.
Среди изученных соединений ни одно вещество не оказывало статистически значимого МОС-модулирующего эффекта (судя по длительности ГС).
С целью более полного исследования спектра биологического действия синтезированных соединений нами изучена также их противомикробная активность по методу двукратных серийных разведений в питательном бульоне 8. Предварительно готовили раствор, содержащий 100 мг исследуемого соединения в одном миллилитре мясопептонного бульона, с последующим разведением до рабочей концентрации соединения 12.5 мг/мл. В ряд пробирок с последовательными двукратно убывающими концентрациями соединения в бульоне вносили тестовые культуры микроорганизмов (микробная загрузка составляла 2.0 х 10 6 КОЕ/мл), в качестве которых использовались клинические штаммы: E. coli, P. vulgaris, Antracoides, St. aureus, Citrobacter, Enterobacter, Ps. aeruginosa из музея кафедры микробиологии БГМУ. Посевы инкубировали при 37 оС в течение 72 ч и при 25 оС — 48 ч. О противомикробной активности химических
соединений судили по отсутствию роста культур через 1, 2, 3 и 5 сут. В качестве показателя активности использовали минимальную инги-бирующую концентрацию (МИК). В качестве эталона использовался этакридина лактат, МПК которого составляет 0.5 мг/мл.
Ни одно из исследуемых соединений 2а-в, 3а-з,п-х не проявило противомикробной активности в дозе 100 мг/мл.
Литература
1. Negwer M. Organic- chemical drugs and their synonyms.— Berlin: Academie-Verlag, 1987.— Bd. 1-3.- 2470 р.
2. Клен Е. Э., Халиуллин Ф. А., Исхакова Г. Ф. // ЖОрХ.- 2005.- Т. 41, № 12.- 1881.
3. Исхакова Г. Ф. Синтез и свойства серосодержащих производных 1,2,4-триазола Дис. ... к. фарм. наук.- Пермь.- 2004.- 158 с.
4. Клен Е. Э., Исхакова Г. Ф., Халиуллин Ф. А. Синтез 3,5-дибром -1-(1,1-диоксотиетанил-3)-1,2,4-триазола // Науки о человеке: сб. статей.- Томск.- 2002.- 217.
5. Клен Е. Э. Поиск новых биологически активных серосодержащих производных бензимида-зола. Дис. ... к. фарм. наук.- Уфа.- 1996.- 186 с.
6. Новожеева Т. П., Саратиков А. С. // Сиб. ж. гастроэнтерологии и гепатологии.- 1999.-№ 8.- С. 55.
7. Гланц С. Медико-биологическая статистика.-М.: Практика, 1998.- 459 с.
8. Ведьмина Е. А., Фурер Н. Ф. Многотомное руководство по микробиологии и эпидемиологии инфекционных болезней.- М.: Медицина, 1964.- Т. 4.- 322 с.
