Научная статья на тему 'Синхронной и асинхронной секреции медиатора принимают участие одни и те же синаптические везикулы'

Синхронной и асинхронной секреции медиатора принимают участие одни и те же синаптические везикулы Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
203
37
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Область наук
Ключевые слова
ВЕЗИКУЛЯРНЫЕ ПУЛЫ / ВЫЗВАННАЯ СИНХРОННАЯ И АСИНХРОННАЯ СЕКРЕЦИЯ МЕДИАТОРА / ДВИГАТЕЛЬНОЕ НЕРВНОЕ ОКОНЧАНИЕ / ИОНЫ СА2+ / SR2+ / BA2+ / ЭКЗОЦИТОЗ И ЭНДОЦИТОЗ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Григорьев, П.Н., Зефиров А.Л.

В опытах на двигательных нервных окончаниях кожно-грудинной мышцы лягушки с использованием внутриклеточного микроэлектродного отведения постсинаптических сигналов и флуоресцентной конфокальной микроскопии изучали процессы вызванной секреции медиатора и экзои эндоцитоза синаптических везикул при высокочастотном раздражении (20 имп/с) в присутствии во внеклеточном растворе различных двухвалентных катионов (Са 2+, Sr 2+ или Ва 2+). В электрофизиологических экспериментах в Са-растворе регистрировалась практически только синхронная секреция медиатора, в Sr-растворах высокая интенсивность как синхронной, так и асинхронной секреции, а в Ва-растворе наблюдалось практически только асинхронное выделение медиатора. В опытах с флуоресцентным красителем FM 1-43 показано, что везикулы, прошедшие цикл экзоцитоза-эндоцитоза при синхронной секреции медиатора (Са-растворы), способны вовлекаться в асинхронный экзоцитоз в Ва-растворах. И, наоборот, везикулы, которые первоначально участвовали в асинхронной секреции (Ва-растворы), способны в последующем участвовать в синхронной секреции (Са-растворы). В экспериментах с изолированной загрузкой красителем везикул рециклирующего и резервного пулов показано, что оба пула везикул принимают участие как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора. Сделано заключение, что источником для обоих видов вызванной секреции медиатора служат одни и те же синаптические везикулы.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Григорьев, П.Н., Зефиров А.Л.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Синхронной и асинхронной секреции медиатора принимают участие одни и те же синаптические везикулы»

УДК 612.816

В синхронной и асинхронной секреции медиатора принимают участие одни и те же синаптические везикулы

П. Н. Григорьев, А. Л. Зефиров*

Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ, 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 *E-mail: zefiroval@rambler.ru Поступила в редакцию 16.02.2015

РЕФЕРАТ В опытах на двигательных нервных окончаниях кожно-грудинной мышцы лягушки с использованием внутриклеточного микроэлектродного отведения постсинаптических сигналов и флуоресцентной конфокальной микроскопии изучали процессы вызванной секреции медиатора и экзо- и эндоцитоза си-наптических везикул при высокочастотном раздражении (20 имп/с) в присутствии во внеклеточном растворе различных двухвалентных катионов (Са2+, Sr2+ или Ва2+). В электрофизиологических экспериментах в Са-растворе регистрировалась практически только синхронная секреция медиатора, в Sr-растворах -высокая интенсивность как синхронной, так и асинхронной секреции, а в Ва-растворе наблюдалось практически только асинхронное выделение медиатора. В опытах с флуоресцентным красителем FM 1-43 показано, что везикулы, прошедшие цикл экзоцитоза-эндоцитоза при синхронной секреции медиатора (Са-растворы), способны вовлекаться в асинхронный экзоцитоз в Ва-растворах. И, наоборот, везикулы, которые первоначально участвовали в асинхронной секреции (Ва-растворы), способны в последующем участвовать в синхронной секреции (Са-растворы). В экспериментах с изолированной загрузкой красителем везикул рециклирующего и резервного пулов показано, что оба пула везикул принимают участие как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора. Сделано заключение, что источником для обоих видов вызванной секреции медиатора служат одни и те же синаптические везикулы.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА везикулярные пулы, вызванная синхронная и асинхронная секреция медиатора, двигательное нервное окончание, ионы Са2+, Sr2+, Ba2+, экзоцитоз и эндоцитоз синаптических везикул. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПКП - потенциал концевой пластинки.

ВВЕДЕНИЕ

Секреция медиатора в химическом синапсе осуществляется порциями (квантами) посредством слияния мембраны синаптической везикулы с пресинапти-ческой мембраной. Процесс слияния может происходить в покое (спонтанная секреция), а также в ответ на пресинаптический потенциал действия и вход ионов Са2+ в нервное окончание через потенциал-зависимые Са-каналы (вызванная секреция). В вызванной секреции медиатора выделяют два компонента -синхронный, при котором высвобождение квантов медиатора осуществляется в течение нескольких миллисекунд после потенциала действия, и асинхронный, который продолжается десятки и сотни миллисекунд [1-3]. В большинстве синапсов основным компонентом является синхронная секреция медиатора, посредством которой при низкочастотном раздражении может освобождаться более 90% квантов [4, 5]. Однако при увеличении частоты раздражения отмечается рост доли асинхронной секреции

медиатора [6]. Один из экспериментальных подходов к изменению соотношения синхронной и асинхронной секреции - использование растворов, содержащих ионы различных щелочноземельных металлов. Так увеличение доли асинхронной секреции происходит при замене ионов Са2+ на Sr2 и Ва2+ [2, 7, 8]. Считают, что синхронность освобождения квантов медиатора реализуется благодаря нескольким пре-синаптическим механизмам, таким, как быстрое кратковременное открытие Са-каналов в ответ на деполяризацию мембраны, свойства белковой «машины» секреции, запускающей выделение квантов медиатора только при высокой внутриклеточной концентрации кальция, а также малое расстояние между Са-каналом и Са-сенсором экзоцитоза [9]. Механизмы асинхронной секреции медиатора остаются недостаточно изученными. Предполагают, что Са2+-сенсор асинхронной секреции располагается на большем расстоянии от Са-канала и характеризуется другой динамикой связывания ионов Са2+ [10-13].

В то же время можно предположить, что везикулы, участвующие в синхронной и асинхронной секреции медиатора, различны и могут представлять самостоятельные популяции. Такое предположение не лишено оснований. Во-первых, изучение процессов экзо-и эндоцитоза синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях позволило выделить два функционально различных пула (рециклирующий и резервный). Рециклирующий пул представлен доки-рованными в области активных зон везикулами, он быстро истощается при высокочастотной активности и восполняется за счет мобилизации везикул и быстрого эндоцитоза. Резервный, более крупный, пул везикул участвует в восстановлении рециклирующе-го пула при высокочастотном раздражении, включается в процесс секреции позднее и восполняется посредством медленного эндоцитоза [14, 15]. Во-вторых, получены данные, позволяющие предположить существование обособленных популяций везикул, обеспечивающих спонтанную [16, 17] и асинхронную секрецию медиатора [18, 19], но не участвующих в вызванной, синхронной секреции. В настоящей работе с использованием электрофизиологического подхода и флуоресцентной конфокальной микроскопии делается попытка оценить идентичность пулов везикул, принимающих участие в синхронной и асинхронной секреции, в двигательном нервном окончании.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследования, растворы

Эксперименты проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы травяных лягушек (Rana temporaria) в зимний (декабрь-февраль) период. Работа проведена в соответствии с международными правилами работ с использованием экспериментальных животных. Использовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в мМ): 115.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2.4 NaHCO3; рН поддерживали на уровне 7.2-7.4; температура 20°С. Все исследования проводили только на поверхностно расположенных синапсах. Наряду со стандартным раствором (Са-раствор) использовали растворы, в которых CaCl2 был заменен на SrCl2 или BaCl2 в концентрации 1.8 мМ (Sr-, Ва-растворы). Вызванную секрецию медиатора и экзоцитоза везикул инициировали длительным высокочастотным (20 имп/с) раздражением двигательного нерва прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1-0.2 мс сверхпорогововой силы, подаваемыми с помощью стимулятора DS3 (Digitimer Ltd., Великобритания). Сокращения препарата блокировали поперечным рассечением мышечных волокон. Использовали реактивы фирмы Sigma (США).

Электрофизиология

Многоквантовые потенциалы концевой пластинки (ПКП) и одноквантовые асинхронные сигналы регистрировали с помощью стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-10 МОм, заполненных 3 М раствором KCl. Микроэлектрод вводили в мышечное волокно в области нервных окончаний под визуальным контролем. Уровень мембранного потенциала покоя контролировали при помощи милливольтметра. Эксперименты, в которых происходило уменьшение мембранного потенциала покоя, не учитывались. Оцифровывание сигналов производили с помощью платы АЦП Ла-2USB. Для регистрации и анализа сигналов применяли оригинальную компьютерную программу Elph (разработчик А.В. Захаров).

Количественная оценка синхронной секреции медиатора

Для количественного расчета квантового состава ПКП использовали модифицированный метод вариаций, детально описанный нами ранее [20]. Для этого рассчитывали площадь каждого ПКП в серии. Далее на графике динамики снижения площади ПКП при высокочастотном раздражении находили участок, в котором средняя площадь ПКП практически не менялась (обычно 10-30 с раздражения). По колебаниям площади ПКП в этом участке можно рассчитать квантовую величину, т.е. среднюю величину площади ПКП, производимую одним квантом медиатора (q):

q = a2/<V>,

(1)

где о - дисперсия площади ПКП, <V> - средняя площадь ПКП на данном участке.

Далее можно определить квантовый состав каждого ПКП в серии:

m. = V./q,

(2)

где т. - квантовый состав ьго ПКП, V. - площадь 1-го ПКП.'

Количественная оценка асинхронной секреции медиатора в Са- и Sr-растворах

Асинхронную секрецию медиатора оценивали путем подсчета количества одноквантовых сигналов, возникающих после ПКП, в период между раздражениями (50 мс), рассчитывая их частоту (количество квантов в секунду). Одноквантовые сигналы подсчитывали как автоматически, так и при визуальном просмотре регистраций.

Количественная оценка асинхронной секреции медиатора в Ва-растворах

Раздражение в Ва-растворах вызывает квантовую секрецию большого количества медиатора, приводящую к развитию устойчивой деполяризации концевой пластинки, что подтверждено биохимическими методами [21]. Высокочастотное раздражение в Ва-растворах приводит к появлению огромного количества асинхронно возникающих однокванто-вых сигналов, которые накладываются друг на друга и не поддаются подсчету [7, 22]. Поэтому секрецию медиатора (частота одноквантовых асинхронных потенциалов) оценивали по производимому асинхронными сигналами деполяризационному изменению мембранного потенциала с коррекцией на нелинейность их суммации с использованием формулы [22]:

V

1

1-V/(E-е) а-т>

(3)

где V - деполяризация постсинаптической мембраны, мВ, Е - мембранный потенциал покоя, мВ, a - средняя амплитуда асинхронных одноквантовых сигналов, мВ, т - временная постоянная асинхронных одноквантовых сигналов, мс, е - равновесный аце-тилхолиновый потенциал (« -15 мВ).

Флуоресцентная микроскопия

Процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул изучали с использованием флуоресцентного красителя FM 1-43 (SynaptoGreen С4, фирма Sigma, США) в концентрации 6 мкМ. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза (после стимуляции экзоцитоза) оказывается внутри образующихся синаптических везикул («загружается» в нервные окончания) [23]. Поскольку процессы эндоцитоза продолжаются и некоторое время после окончания экзоцитоза, в наших экспериментах краситель присутствовал в растворе как во время раздражения (20 имп/с), так и в течение 5 мин после его окончания. Далее препарат отмывали в растворе без красителя в течение 20 мин для устранения связанного с поверхностной мембраной красителя. В этом случае в нервном окончании наблюдались ярко светящиеся пятна, отражающие скопления синаптических везикул, содержащих краситель в области активных зон. Стимуляция эк-зоцитоза предварительно загруженных везикул вызывает освобождение («выгрузку») красителя из нервных окончаний [23]. Флуоресценцию наблюдали с помощью моторизованного микроскопа BX51W1 (Olympus, Германия), оснащенного конфокальным сканирующим диском DSU и CCD-камерой OrcaR2 (Hamamatsu, Япония), совмещенной с персо-

нальным компьютером через специализированный софт Olympus CelrP. Оптика для анализа свечения FM 1-43 включала набор светофильтров Olympus U-MNB2 и водно-иммерсионный объектив Olympus LUMPLFL 60хw (1.0 NA). Свечение анализировали в центральном участке нервного окончания протяженностью 20 мкм. Интенсивность свечения оценивали, используя программу ImagePro, в относительных единицах (о.е.) свечения пикселя за вычетом фоновой флуоресценции. Фоновое значение флуоресценции определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 х 50 пикселей в участке изображения без нервных окончаний [12, 24, 25]. Профиль свечения в нервной терминали рассчитывали как среднюю интенсивность свечения рядов пикселей, расположенных перпендикулярно продольной оси терминали с шагом в 1 пиксель.

Статистический анализ проводили с использованием программы Origin Pro. Количественные результаты исследования представлены в форме среднее значение ± стандартная ошибка, n - число независимых опытов. Статистическую значимость определяли с помощью критерия Стьюдента и ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Секреция медиатора при высокочастотном раздражении в Ca-, Sr- и Ва-растворах

При высокочастотном раздражении в Са-растворе регистрировались многоквантовые ПКП (синхронная секреция медиатора), сопровождавшиеся редкими одноквантовыми асинхронными сигналами (рис. 1А). Квантовый состав первого многоквантового ПКП в серии составлял 321 ± 120 квантов (n = 6). В процессе высокочастотного раздражения наблюдалось снижение квантового состава, который к концу 3-й минуты раздражения составлял 44.3 ± 9.0% (n = 6) от исходного уровня (рис. 1Б). Асинхронная секреция в течение первой секунды высокочастотного раздражения была незначительной (5.9 ± 1.4 кванта с-1, n = 7), но к концу 3-й минуты раздражения возрастала до 40.0 ± 9.7 с-1 (n = 7) (рис. 1Б). После окончания раздражения одноквантовые асинхронные сигналы исчезали в течение 1 с. Произведенные расчеты показали, что за 3 мин раздражения в Са-растворе посредством синхронной секреции высвобождается 880251 ± 275892 квантов (n = 6), а асинхронной -6751 ± 1476 квантов (n = 7).

В Sr-растворе при высокочастотном раздражении также регистрировались многоквантовые ПКП, за которыми следовали одноквантовые асинхронные сигналы (рис. 1А). Исходный квантовый состав оказался значительно ниже, чем в Ca-растворе -4.7 ± 0.8 кванта (n = 4). К окончанию первой мину-

n =

л

Са-раствор

Sr-раствор

J

Ва-раствор

МП_/"

8 мВ

8 с

400

300

200

^ 100

60

40

20

60

120

180

Время раздражения, с

П П

ос р,

о о-°о

200

П П

ос 150 о. -

100 го

50

0 60 120 180 240 Время раздражения, с

3 2 в о

—-о——

6000

ос р,

4000 s с

2000

0 10 20 30 Время раздражения, с

Рис. 1. Синхронная и асинхронная вызванная секреция медиатора при высокочастотном раздражении в Ca-, Sr-, Ва-растворах. A - примеры регистрации потенциалов концевой пластинки (ПКП) и асинхронных одноквантовых сигналов при высокочастотном (20 имп/с) раздражении в Ca-, Sr-, Ва-растворах (1.8 мМ). Стрелками указаны ПКП, звездочками - асинхронные одноквантовые сигналы. Заметно, что в Ва-растворах при раздражении развивается стойкая деполяризация мембраны мышечного волокна (МП). Б - динамика усредненного (по всем экспериментам) квантового состава ПКП (темные линии, оси ординат - слева) и усредненной частоты одноквантовых асинхронных сигналов (светлые кружки, оси ординат - справа) в процессе высокочастотного раздражения

Б

4

0

0

ты раздражения квантовый состав ПКП возрастал до 34.3 ± 9.1 (n = 4) и поддерживался на относительно стабильном уровне до окончания стимуляции (рис. 1Б). В Sr-растворе асинхронная секреция оказалась более значимой, чем в Са-растворе. В первую секунду раздражения частота одноквантовых сигналов составляла 32.6 ± 5.8, а к концу 3-й минуты - 185.2 ± 10.7 квантов/с (n = 5) (рис. 1Б). После окончания раздражения одноквантовые асинхронные сигналы исчезали в течение 1 с. Оказалось, что за 3 мин раздражения в Sr-растворе количество выделенных синхронной и асинхронной секрецией квантов медиатора составляет 126359 ± 29687 (n = 4) и 31633 ± 1912 (n = 5) соответственно. Возникающая в Са- и Sr-растворах асинхронная секреция медиатора не приводила к изменению мембранного потенциала покоя.

Высокочастотное раздражение двигательного нерва в Ва-растворе вызывало появление одно-трех-квантовых ПКП и огромного количества асинхронных одноквантовых сигналов. Квантовый состав ПКП быстро возрастал к 2-3 с и последовательно снижался к окончанию раздражения до 1.85 ± 0.47 (n = 7) (рис. 1Б). Продолжительное раздражение

в течение первых нескольких секунд приводило к деполяризации мышечных волокон с уровня покоя -45 ± 2.9 мВ до -37 ± 3.1 мВ (п = 7), сохранявшейся все время раздражения. После окончания раздражения мембранный потенциал в течение 3-7 с возвращался к исходному уровню. Расчет по формуле 3 (см. раздел «Экспериментальная часть») позволил заключить, что такая деполяризация может вызываться асинхронными одноквантовыми сигналами с частотой 6131 ± 455 с-1 (п = 7). Дальнейшие расчеты показали, что 30-секундное раздражение в Ва-растворе приводит к освобождению синхронной секрецией 1224 ± 180 квантов (п = 7), а асинхронной - 189648 ± 41712 квантов (п = 7).

Представленные данные свидетельствуют о том, что при высокочастотном раздражении в Са-растворах практически все кванты медиатора освобождаются синхронно (примерно 99.2%), а доля асинхронной секреции незначительна. Применение Sr-растворов приводит к уменьшению доли синхронно освобождающихся квантов до 80% и увеличению асинхронно освобождающихся до 20%. В Ва-растворах обнаружено практически только асинхронное выделение квантов (примерно 99.4%).

л

I

т

т *

га т н

и ш

X X

с

о *

400000

300000

200000

100000

Са-раствор

а-раствор

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Са-раствор

0 15 30

Время раздражения, с

45

I 11 1 ИИ

Ва-раствор

Г I 1111 VII

Рис. 2. Эндоцитоз синаптических везикул в Са- и Ва-растворах. Л - кумулятивные кривые количества освобожденных синхронных и асинхронных квантов медиатора в Са- и Ва-растворах в процессе высокочастотного раздражения (построены, исходя из данных, представленных на рис. 1Б). Заметно, что 180000 квантов медиатора (штриховая линия) освобождаются при раздражении в Са- и Ва-растворах примерно за 30 с. Б - примеры регистрации флуоресценции одного и того же участка нервного окончания, последовательно загруженного красителем FM 1-43 при высокочастотном раздражении продолжительностью 30 с в Са- и Ва-растворах (подробнее в тексте). Снизу показаны профили свечения нервного окончания. Заметно, что расположение пятен совпадает (указаны стрелками)

Б

0

В дальнейшем для изучения процессов экзо- и эн-доцитоза синаптических везикул при синхронной и асинхронной секреции медиатора мы применяли Са- и Ва-растворы.

Экзо- и эндоцитоз синаптических везикул при синхронной и асинхронной секреции медиатора

Эффективность эндоцитоза синаптических везикул оценивали по загрузке красителя FM 1-43 при длительном высокочастотном раздражении в Са- и Ва-растворах. Известно, что эффективность захвата красителя FM 1-43 определяется интенсивностью процессов экзоцитоза синаптических везикул и секреции медиатора. Поэтому для загрузки красителя в Са- и Ва-растворах необходимо, чтобы за время раздражения освобождалось одинаковое количество квантов медиатора. Анализ кумулятивных кривых (сумма квантов, освободившихся синхронно и асинхронно, рис. 2А) показал, что 180000 квантов медиатора в Са- и Ва-растворах освобождаются примерно за 30 с раздражения. Именно такую продолжительность раздражения использовали для загрузки красителя в наших опытах. В этих условиях в Са- и Ва-растворах наблюдались ярко светящиеся пятна (интенсивность свечения нервных термина-лей - 0.114 ± 0.008 (п = 23) и 0.119 ± 0.011 о.е. (п = 20) соответственно) (рис. 2Б, 3В). Полученные данные свидетельствуют о том, что как при синхронном,

так и асинхронном экзоцитозе везикул идут эффективные процессы рециклизации с образованием новых синаптических везикул посредством эндоцитоза.

Следующие эксперименты были направлены на оценку способности везикул, участвующих в асинхронной секреции медиатора, подвергаться синхронному экзоцитозу.

Для этого нервные окончания предварительно загружали FM 1-43 в Ва- или Са-растворе (стимуляции асинхронного или синхронного экзоцитоза соответственно), а затем сравнивали динамику выгрузки красителя при высокочастотном раздражении в Са-растворе (стимуляция синхронного экзоцитоза). Показано (рис. 3Б), что в этих условиях динамика выгрузки красителя была одинаковой. Через 1 мин раздражения предварительно загруженных нервных окончаний в Ва- и Са-растворах интенсивность свечения снижалась до 80.1 ± 1.2 (п = 7) и 76.0 ± 1.2% (п = 7) соответственно, а через 15 мин - до 55.9 ± 2.2 (п = 7) и 55.3 ± 5.4% (п = 7) соответственно, а флуоресцирующие пятна исчезали (рис. 2В). Таким образом, синаптические везикулы, участвовавшие в асинхронном экзоцитозе и секреции медиатора, были способны подвергаться синхронному экзоци-тозу.

В нескольких экспериментах проводили детальный анализ светящихся пятен в нервных окончаниях одного и того же препарата, возникающих при стимуляции синхронной и асинхронной секреции. Для этого

л

Ca- или Ва-раствор + FM 1-43

Раздражение 20 имп/с

Са-раствор Отмывка

Наблюдение, Са-раствор Раздражение 20 имп/с

1 мин

0.5 мин

5 мин

20 мин

15 мин

о4

и,

и J н

е J

с

е р

о л -fr л

т с о н в и с н е т н

X

1009080706050

—I-1-1-1-1-1-1-1-1—

3 6 9 12 15

-о-

0 мин

1 мин

5 мин

Время раздражения, мин

Рис. 3. Экзоцитоз синаптических везикул, загруженных красителем в Са- и Ва-растворах. А - схема эксперимента. Нервные окончания загружались красителем в Са- или Ва-растворе, а затем выгружались в Са-растворе. Б - динамика спада интенсивности флуоресценции (выгрузка красителя) нервных окончаний, предварительно загруженных в Са- (черные квадратики) и Ba- (белые кружочки) растворах, в % от первоначальной величины. В -примеры регистрации флуоресценции из Б

Б

В

0

сначала анализировали пятна, возникающие при загрузке красителя в Са-растворе. Затем краситель выгружали (раздражение в течение 15 мин) и нервные окончания повторно загружали красителем в Ва-растворе с анализом пятен. Пространственный анализ светящихся пятен одного и того же нервного окончания в Ca- и Ва-растворах выявил их идентичность (рис. 2Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что как при синхронном, так и асинхронном экзоцитозе везикул процессы рециклизации происходят в одних и тех же участках нервного окончания, прилегающих к активным зонам.

Оценка участия везикул рециклирующего и резервного пула в асинхронной секреции медиатора

В данной части работы производили изолированную загрузку везикул либо рециклирующего, либо резервного пулов красителем FM 1-43 в Са-растворе с последующей оценкой способности их участия в асинхронной секреции медиатора. Для загрузки везикул рециклирующего пула использовали кратковременное (12 с) высокочастотное (20 имп/с) раздражение [26]. При этом в нервном окончании

появлялись слабосветящиеся пятна, отражающие скопления везикул рециклирующего пула в области активных зон. В последующем анализировали динамику выгрузки красителя при стимуляции синхронной (Са-раствор) и асинхронной (Ва-раствор) секреции медиатора. Различий в динамике снижения свечения не выявлено. Так, через 1 мин стимуляции в Са- и Ва-растворах интенсивность свечения нервных терминалей падала до 74.2 ± 4.3 (п = 4) и 72.2 ± 3.4% (п = 5) соответственно, а через 5 мин -до 60.8 ± 4.3 (п = 4) и 61.4 ± 4.3% (п = 5) соответственно (рис. 4Б,В).

Для загрузки резервного пула использовали модификацию протокола [26]. Первоначально проводили высокочастотное раздражение препарата в Са-растворе с FM 1-43 продолжительностью 3 мин. Данный протокол приводит к окрашиванию везикул рециклирующего и резервного пулов. После отмывки препарата снова производили высокочастотное раздражение, но в течение 25 с, что приводило к выбросу красителя везикулами рециклирующего пула. В результате оставшиеся в нервном окончании окрашенные синаптические везикулы принадлежали преимущественно резервному пулу [26].

Л

Са-раствор, FM 1-43 Са-раствор Са- или Ва-раствор

| ) Раздражение 20 имп/с | Отмывка Раздражение 20 имп/с

1 , 1 мин 0.2 мин 5 мин 5 мин - 20 мин 5 мин, наблюдение

£ 100- ии ц н О V В

—■— -О- Са-раствор Ва-раствор Са-раствор Ва-раствор

е ц с е К 0 мин

\

о у

л

ф

с о н в и с н е т н

X

80

60.

1 мин

3 мин

12 3 4 Время раздражения, мин

Б

0

5

Г Са-раствор, FM 1-43 Са-раствор Са-раствор Са- или Ва-раствор

Раздражение 20 имп/с Отмывка Раздражение Отмывка Раздражение

1 мин

3 мин

5 20 мин мин

0.42 мин

20 мин 15 мин, наблюдение

Д

100

80

60

40

■—Са-раствор Ва-раствор

9

—1— 12

—1— 15

0 мин

1 мин

5 мин

Са-раствор

Ва-раствор

Время раздражения, мин

Е

Рис. 4. Экзоцитоз синаптических везикул рециклирующего и резервного пулов в Са- и Ва-растворах. Л - схема эксперимента по избирательной окраске и изучению экзоцитоза везикул рециклирующего пула. Б - динамика спада интенсивности флуоресценции нервных терминалей с предварительно окрашенным рециклирую-щим пулом при высокочастотном раздражении в Са- (черные квадратики) и Ва-растворах (белые кружочки). В - примеры регистрации флуоресценции нервных терминалей из Б. Г - схема опыта по избирательной окраске и изучению экзоцитоза везикул резервного пула. Д - динамика спада интенсивности флуоресценции нервных терминалей с предварительно окрашенным резервным пулом при высокочастотном раздражении в Са- (черные квадратики) и Ва-растворах (белые кружочки). Е - примеры регистрации флуоресценции нервных терминалей из Д

Последующее высокочастотное раздражение окрашенных препаратов в Са-растворе (стимуляция синхронной секреции медиатора) и Ва-растворе (стимуляция асинхронной секреции медиатора) приводило к идентичному падению свечения нервных окончаний (рис. 4Д). Через 1 мин стимуляции в Са- и Ва-растворах интенсивность свечения нервных терми-налей снижалась до 83.1 ± 2.2 (n = 7) и 76.9 ± 4.1% (n = 6) соответственно, а через 15 мин - до 44.3 ± 2.9 (n = 7) и 42.3 ± 2.7% (n = 6) соответственно (рис. 4Д,Е). Представленные данные свидетельствуют о том, что везикулы как рециклирующего, так и резервного пулов способны наряду с синхронной секрецией участвовать и в асинхронной секреции медиатора.

ОБСУЖДЕНИЕ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Недавно появились экспериментальные данные, указывающие на различия в механизмах синхронной и асинхронной секреции медиатора. Предположили, что запуск обоих видов вызванной секреции медиатора может осуществляться в области различных пресинаптических Са-каналов [9, 19, 27] с использованием различных белковых молекул, обеспечивающих процессы докирования и слияния синаптиче-ских везикул. Наиболее вероятными кандидатами на роль Са-сенсора синхронной секреции являются Са-связывающие белки синаптотагмины 1, 2, 9, а асинхронной секреции - синаптотагмин 7 и Doc2 [9]. В процессах регуляции синхронной секреции принимают участие белки комплексины и синаптобревин 2, а асинхронной - VAMP4 и синапсин 2 [28-30]. Эти данные поднимают вопрос об идентичности пулов везикул, принимающих участие в синхронной и асинхронной секреции.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что одни и те же синаптические везикулы способны участвовать как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора с одинаковыми процессами ре-циклизации. На это указывает способность везикул, прошедших цикл экзоцитоз-эндоцитоз, при синхронной секреции медиатора (Са-растворы) вовлекаться в асинхронный экзоцитоз в Ва-растворах (рис. 4). И наоборот, везикулы, которые первоначально участвовали в асинхронной секреции (Ва-растворы), способны в последующем участвовать в синхронной секреции (Са-растворы) (рис. 3Б,В). Эффективный захват красителя при стимуляции секреции в Ва-растворах (рис. 2Б, 3Б) свидетель-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Katz В., Miledi R. // Proc. R. Soc. Lond. В. 1965. V. 161. P. 483-495.

2. van der Kloot W., Molgo J. // Physiol. Rev. 1994. V. 74. № 4. P. 899-991.

ствует о том, что асинхронный выброс медиатора, так же как и синхронный, осуществляется посредством полного экзоцитоза везикул с последующим образованием новых везикул за счет эндоцитоза. Синхронный и асинхронный экзоцитоз происходит в одних и тех же участках нервного окончания в области активных зон, о чем свидетельствует полная идентичность расположения и конфигурации светящихся пятен при стимуляции секреции в Са- и Ва-растворах (рис. 2Б).

Способность везикул, относящихся к различным функциональным пулам нервного окончания, участвовать в асинхронной секреции медиатора была проверена в опытах с изолированной загрузкой красителем везикул рециклирующего и резервного пулов. Показано, что динамика выгрузки красителя из везикул как рециклирующего, так и резервного пулов при синхронной и асинхронной секреции медиатора абсолютно идентична, а интенсивность свечения снижалась до одинакового уровня (рис. 4Б,Д). Следовательно, оба пула везикул в одинаковой степени принимают участие как в синхронной, так и в асинхронной секреции медиатора. Наши исследования не подтвердили предположение некоторых авторов, что в нервном окончании может существовать обособленная популяция везикул, обеспечивающая асинхронную секрецию медиатора [18, 19], но не участвующая в вызванной, синхронной секреции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные нами данные позволяют считать, что источником для обоих видов вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе служат одни и те же синаптические везикулы. Можно предполагать, что синаптическая везикула содержит набор белков, необходимый как для синхронной, так и для асинхронной секреции, а выбор вида вызванной секреции, в котором будет принимать участие синаптическая везикула, определяется динамикой ионов Са2+ около везикулы, а также расположением везикулы по отношению к кальциевому каналу и свойствами Са-сенсоров экзоцитоза. •

Авторы выражают благодарность А.В. Захарову за помощь в анализе экспериментальных данных.

Работа поддержана РФФИ (грант № 14-04-01232-а) и РНФ (№ 14-15-00847).

3. Khuzakhmetova V., Samigullin D., Nurullin L., Vyskocil F., Nikolsky E., Bukharaeva E. // Int. J. Dev. Neurosci. 2014. V. 34. P. 9-18.

4. Rahamimoff R., Yaari Y. // J. Physiol. 1973. V. 228. P. 241-257.

5. Atluri P., Regehr W. // J. Neurosci. 1998. V. 18. P. 8214-8227.

6. Зефиров А.Л., Мухамедьяров М.А. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 1041-1059.

7. Зефиров А.Л., Григорьев П.Н. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2009. Т. 95. № 3. С. 262-272.

8. Bukharaeva E.A., Samigullin D., Nikolsky E.E., Magazanik L.G. // J. Neurochem. 2007. V. 100. № 4. P. 939-949.

9. Kaeser P.S., Regehr W.G. // Annu. Rev. Physiol. 2014. V. 76. P. 333-363.

10. Cummings D.D., Wilcox K.S., Dichter M.A. // J. Neurosci. 1996. V. 16. № 17. P. 5312-5323.

11. Sun J., Pang Z.P., Qin D., Fahim A.T., Adachi R., Sudhof T.C. // Nature. 2007. V. 450. P. 676-682.

12. Зефиров А.Л., Григорьев П.Н. // Бюл. эксп. биологии и медицины. 2008. Т. 146. № 12. С. 608-612.

13. Burgalossi A., Jung S., Meyer G., Jockusch W.J., Jahn O., Taschenberger H., O'Connor V.M., Nishiki T., Takahashi M., Brose N., Rhee J.S. // Neuron. 2010. V. 68. № 3. P. 473-487.

14. Rizzoli S.O., Betz W.J. // Nat. Rev. Neurosci. 2005. V. 6. № 1. P. 57-69.

15. Захаров А.В., Петров А.М., Котов Н.В., Зефиров А.Л. // Биофизика. 2012. Т. 57. № 4. С. 42-50.

16. Ramirez D.M., Kavalali E.T. // Curr. Opin. Neurobiol. 2011. V. 21. № 2. P. 275-282.

17. Sara Y., Virmani T., Deak F., Liu X., Kavalali E.T. // Neuron. 2005. V. 45. № 4. P. 563-573.

18. Otsu Y., Shahrezaei V., Li B., Raymond L.A., Delaney K.R., Murphy T.H. // J. Neurosci. 2004. V. 24. № 2. P. 420-433.

19. Peters J.H., McDougall S.J., Fawley J.A., Smith S.M., Andre-sen M.C. // Neuron. 2010. V. 65. № 5. P. 657-669.

20. Зефиров А.Л., Захаров А.В., Мухаметзянов Р.Д., Петров А.М., Ситдикова Г.Ф. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2008. Т. 94. № 2. С. 129-141.

21. Silinsky E.M. // Pharmacol. Rev. 1985. V. 37. P. 81-131.

22. Silinsky E.M. // J. Physiol. 1978. V. 274. P. 157-171.

23. Betz W.J., Bewick G.S., Ridge R.M. // Neuron. 1992. V. 9. № 5. P. 805-813.

24. Zefirov A.L., Abdrakhmanov M.M., Mukhamedyarov M.A., Grigoryev P.N. // Neuroscience. 2006. V. 143. № 4. P. 905-910.

25. Зефиров А.Л., Григорьев П.Н., Петров А.М., Минлебаев М.Г., Ситдикова Г.Ф. // Цитология. 2003. Т. 45. № 12. С. 34-41.

26. Gaffield M.A., Rizzoli S.O., Betz W.J. // Neuron. 2006. V. 51. № 3. P. 317-325.

27. Wen H., Linhoff M.W., Hubbard J.M., Nelson N.R., Stensland D., Dallman J., Mandel G., Brehm P. // J. Neurosci. 2013. V. 33. № 17. P. 7384-7392.

28. Raingo J., Khvotchev M., Liu P., Darios F., Li Y.C., Ramirez

D.M., Adachi M., Lemieux P., Toth K., Davletov B., Kavalali

E.T. // Nat. Neurosci. 2012. V. 15. P. 738-745.

29. Sudhof T.C., Rothman J.E. // Science. 2009. V. 323. P. 474-477.

30. Medrihan L., Cesca F., Raimondi A., Lignani G., Baldelli P., Benfenati F. // Nat. Commun. 2013. V. 4. № 1512. P. 1-13.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.