Научная статья на тему 'Управляемый деполяризацией кальций-независимый экзои эндоцитоз синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки'

Управляемый деполяризацией кальций-независимый экзои эндоцитоз синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
413
98
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Область наук
Ключевые слова
ДВИГАТЕЛЬНОЕ НЕРВНОЕ ОКОНЧАНИЕ / ЭКЗОЦИТОЗ / ЭНДОЦИТОЗ / КАЛЬЦИЙ / ПОСТОЯННЫЙ ДЕПОЛЯРИЗУЮЩИЙ ТОК / КАДМИЙ

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Абдрахманов М. М., Петров А. М., Григорьев П. Н., Зефиров А. Л.

В экспериментах на кожно-грудинной мышце лягушки с использованием внеклеточного микроэлектродного отведения миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) и флуоресцентной микроскопии (краситель FM1-43) исследовали влияние деполяризации постоянным током мембраны нервных окончаний на секрецию медиатора и процессы экзои эндоцитоза синаптических везикул. Показано, что в контроле деполяризация мембраны нервного окончания вызывает выраженное повышение частоты МТКП (секреции квантов медиатора) и экзоцитоза (выгрузка FM1-43 из предварительно загруженных красителем синаптических везикул), которое связано с увеличением внутриклеточной концентрации Са2+ при открытии потенциал-зависимых Са-каналов. При блокировании Са-каналов и связывании внутриклеточных ионов Са2+ (совместное действие ионов Cd2+ и EGТА-АМ) деполяризующий ток слабо увеличивал частоту МТКП и экзоцитоз везикул. Процессы эндоцитоза (загрузка FM1-43 во вновь образующиеся синаптические везикулы) как в контроле, так и при совместном действии ионов Cd2+ и EGТА-АМ протекали пропорционально количеству синаптических везикул, подвергнувшихся экзоцитозу. Высказано предположение, что в двигательном нервном окончании лягушки кроме Са-зависимого экзои эндоцитоза синаптических везикул существует Са-независимый экзои эндоцитоз, который может активироваться непосредственно деполяризацией мембраны.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Абдрахманов М. М., Петров А. М., Григорьев П. Н., Зефиров А. Л.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Управляемый деполяризацией кальций-независимый экзои эндоцитоз синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки»

УДК 612.816

Управляемый деполяризацией кальций-независимый экзо-и эндоцитоз синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки

М. М. Абдрахманов, А. М. Петров*, П. Н. Григорьев, А. Л. Зефиров Казанский государственный медицинский университет, 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 *E-mail: fysio@rambler.ru Поступила в редакцию 04.04.2013

РЕФЕРАТ В экспериментах на кожно-грудинной мышце лягушки с использованием внеклеточного микро-электродного отведения миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП) и флуоресцентной микроскопии (краситель FM1-43) исследовали влияние деполяризации постоянным током мембраны нервных окончаний на секрецию медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул. Показано, что в контроле деполяризация мембраны нервного окончания вызывает выраженное повышение частоты МТКП (секреции квантов медиатора) и экзоцитоза (выгрузка FM1-43 из предварительно загруженных красителем синаптических везикул), которое связано с увеличением внутриклеточной концентрации Са2+ при открытии потенциал-зависимых Са-каналов. При блокировании Са-каналов и связывании внутриклеточных ионов Са2+ (совместное действие ионов Cd2+ и ЕОТА-АМ) деполяризующий ток слабо увеличивал частоту МТКП и экзоцитоз везикул. Процессы эндоцитоза (загрузка FM1-43 во вновь образующиеся синаптические везикулы) как в контроле, так и при совместном действии ионов Cd2+ и ЕОТА-АМ протекали пропорционально количеству синаптических везикул, подвергнувшихся экзоцитозу. Высказано предположение, что в двигательном нервном окончании лягушки кроме Са-зависимого экзо- и эндоцитоза синаптических везикул существует Са-независимый экзо- и эндоцитоз, который может активироваться непосредственно деполяризацией мембраны.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА двигательное нервное окончание, экзоцитоз, эндоцитоз, кальций, постоянный деполяризующий ток, кадмий.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЕОТА-АМ - этиленгликоль-бис(Р-аминоэтил)-^^№,№-тетраацетоксиметиловый эфир; МТКП - миниатюрные токи концевой пластинки.

ВВЕДЕНИЕ

Основной функцией пресинаптических нервных окончаний в химическом синапсе является высвобождение порций (квантов) медиатора посредством экзоцитоза синаптических везикул. Экзоцитоз сопровождается процессами эндоцитоза, т.е. образованием новых везикул, которые вновь заполняются медиатором и могут повторно участвовать в освобождении медиатора [1, 2]. Считается, что в естественных условиях процессы экзо- и эндоцитоза активируются за счет повышения внутриклеточной концентрации Са2+ при открытии потенциал-зависимых Са-каналов плазматической мембраны [3-5].

Са-зависимость вызванного потенциалом действия экзоцитоза синаптических везикул связана со спе-

циализированными белками - синаптотагминами I, II, IX, которые являются основными сенсорами ионов Са2+ [6]. Спонтанный (асинхронный) экзоцитоз также зависит от Са2+ и определяется действием внутриклеточного Са2+ на синаптотагмин I и Doc2b [7, 8]. Влияние ионов Са2+ на эндоцитоз носит более сложный характер [9, 10]. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ может как запускать и ускорять эндоцитоз [11], так и ингибировать его [3, 9]. Регуляция эндоцитоза ионами Са2+ может опосредоваться кальцинейрином, Са-кальмодулин-зависимой фосфатазой и связыванием Са2+ с синаптотагмином [12, 13].

Однако существует предположение, что секреция медиатора может контролироваться собственно изменением мембранного потенциала нервного оконча-

ния без входа Са2+ [14, 15]. В ганглионарных нейронах деполяризация Са-независимо усиливает экзоцитоз [16], а последующий эндоцитоз не зависит от повышения внутриклеточной концентрации Са2+ и имеет быструю динамику [17].

В представленной работе с использованием элек-трофизиологического и флуоресцентного методов изучена роль деполяризации в процессах секреции медиатора и экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании.

экспериментальная часть

Объект исследования, растворы

Опыты проведены на изолированных нервномышечных препаратах кожно-грудинной мышцы озерных лягушек (Rana ridibunda) в зимний (декабрь-февраль) период. Лягушек содержали в холодильнике при температуре 50С и за 2 ч до опыта переносили в лабораторию. Работа проведена в соответствии с международными правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Использовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в мМ): 115.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2.4 NaHCO3; рН поддерживали на уровне 7.2-7.4, а температуру - 200С. Все опыты проводили только на поверхностно лежащих нервных окончаниях. Для блокирования потенциала действия нервного окончания в перфузирующий раствор добавляли те-тродотоксин в концентрации 1 мкМ. В ряде случаев для блокирования Са-каналов нервного окончания использовали раствор Рингера с добавлением ионов Cd2+ в концентрации 0.2 мМ. Для связывания внутриклеточных ионов Са2+ препарат обрабатывали в течение 1 ч проникающей через мембрану формой кальциевого хелатора EGТА (EGТА-АМ) в концентрации 50 мкМ. Все использованные вещества фирмы Sigma (США). Опыты выполнены при постоянной перфузии 5 мл/мин, объем ванночки - 10 мл.

Электрофизиология

Миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) регистрировали при помощи внеклеточных стеклянных микроэлектродов, заполненных 2 М раствором NaCl, с диаметром кончика около 1 мкм и сопротивлением 1-5 МОм. Электрод подводили к нервному окончанию на расстоянии 20-40 мкм от последнего миелинового сегмента. Сигналы усиливались с помощью внеклеточного усилителя и при использовании L-CARD 1250 преобразовывались в цифровую форму. Частоту МТКП определяли по среднему интервалу времени между соседними сигналами (в имп/с).

Флуоресцентная микроскопия

В экспериментах использовали флуоресцентный краситель FM1-43 (SynaptoGreen С4, Invitrogen, США) в концентрации 6 мкМ. Маркер обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся синаптических везикул («загружается» в нервное окончание) [18]. Флуоресценцию наблюдали с помощью CCD-видеокамеры Orca II (Hamamatsu, Япония) и моторизованного микроскопа Olympus BX51 (Германия, программное обеспечение Се1ГР), оснащенного конфокальной системой DSU и объективом Olympus LUMPLFL 60хw. Анализ свечения термина-лей проводили в центральном и дистальном участках нервного окончания. Интенсивность свечения оценивали, используя программу ImagePro, в относительных единицах свечения пикселя за вычетом фоновой флуоресценции. Фоновое значение флуоресценции определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 х 50 пикселей в участке изображения без нервного окончания [19].

Деполяризация нервного окончания

Для деполяризации нервного окончания использовали две стеклянных микропипетки с диаметром кончиков 2-5 мкм, заполненных 2 М раствором NaCl. Одну (деполяризующую) пипетку под визуальным контролем подводили к претерминальному участку нервного окончания, а вторую - на расстоянии 1 мм от первой к мышечному волокну, на котором располагается нервное окончание. Стимулирующие пипетки подсоединялись к синхронизируемому через компьютер стимулятору DS3 (Digitimer Ltd.), который служил источником тока. Ток в цепи контролировали с помощью микроамперметра.

Статистический анализ проводили при помощи программы Origin Pro. Количественные результаты представлены в форме - среднее значение ± стандартная ошибка, n - число независимых опытов. Статистическую значимость определяли с использованием критериев Стьюдента и ANOVA.

результаты

Электрофизиология. Секреция медиатора при деполяризации нервных окончаний

При внеклеточной концентрации Са2+, равной 1.8 мМ, частота МТКП составляла 0.23 ± 0.03 имп/с (n = 25). Деполяризация мембраны постоянным током приводила к быстрому увеличению частоты МТКП (рис. 1А), которое сохранялось в течение всего периода пропускания тока (до 40-50 мин). Увеличение частоты МТКП зависело от силы тока (рис. 1Б). Так, при действии постоянного тока силой 2 мкА часто-

А

Са2+

Са2+ + Cd2+

Са2+ + Cd2++EGTA-AM

0.5 с

імД

у

п.

і—

:S

га

н

О

н

и

га

3"

і

га

m

х

га

5

5

U

га

О.

О

н

га

s

4 ш

5

- - Са2+

Са2+ + Cd2+ + EGTA-AM

12000

10000.

8000

6000

4000

2000f------------------------

Сила тока, мкА

10 15 20 25

Время, мин

30

В

Б

0

0

5

Рис. 1. Влияние деполяризующего тока на секрецию медиатора. А — изменение частоты МТКП при действии деполяризующего тока (4 мкА) в контроле, в присутствии ионов Cd2+, на фоне действия EGТА-АМ и Cd2+. Б — зависимость частоты МТКП (имп/с) от силы деполяризующего тока (мкА). Штриховой линией указаны значения частоты МТКП при силе деполяризующего тока 4 мкА. В - кумулятивные кривые, иллюстрирующие секрецию медиатора при воздействии деполяризующего тока (4 мкА), с течением времени. По оси ординат - сумма квантов медиатора, по оси абсцисс - время от начала деполяризации. Штриховой линией обозначены координаты точек, соответствующих одинаковой сумме квантов медиатора

та МТКП увеличивалась до 2.9 ± 0.3 имп/с (п = 10, р < 0.01), а при 4 и 6 мкА - до 6.1 ± 0.4 (п = 10, р < 0.01) и 12.9 ± 0.5 имп/с (п = 10, р < 0.01) соответственно (рис. 1А,Б).

Добавление в перфузирующий раствор ионов Cd2+ (0.2 мМ) приводило к увеличению частоты МТКП до 2.22 ± 0.04 имп/с (п = 20, р < 0.01). При этом эффект деполяризации на частоту МТКП сохранялся, но был менее выражен (рис. 1А,Б). Так, при пропускании деполяризующего тока силой 2, 4 и 6 мкА частота МТКП возрастала до 2.8 ± 0.3 (п = 10, р < 0.05),

3.8 ± 0.4 (п = 10, р < 0.01), 5.2 ± 0.4 (п = 10, р < 0.01) имп/с соответственно (рис. 1А,Б).

Часовая экспозиция в EGТА-АМ не изменяла значимо частоту МТКП, которая составляла при этом 0.20 ± 0.03 имп/с (п = 16, р > 0.05). Предварительная обработка нервно-мышечного препарата EGТА-АМ (см. «Экспериментальную часть») приводила к исчезновению стимулирующего эффекта ионов Cd2+ (0.2 мМ) на частоту МТКП (рис. 1А,Б). Частота МТКП в этих условиях (0.21 ± 0.02 имп/с (п = 20, р > 0.05))

не отличалась от контрольных значений. Однако стимулирующий эффект деполяризации на частоту МТКП сохранялся, хотя и был меньше, чем в контроле или на фоне действия Cd2+ (рис. 1Б). Деполяризующий ток 2, 4 и 6 мкА увеличивал частоту МТКП до 0.9 ± 0.2 (п = 10, р < 0.05), 1.5 ± 0.2 (п = 10, р < 0.01),

2.8 ± 0.3 (п = 10, р < 0.01) имп/с соответственно.

Темп и временной ход секреции медиатора при деполяризации нервного окончания постоянным током мы анализировали с использованием кумулятивных кривых (рис. 1В). В этом случае строили зависимость суммы всех возникших МТКП от времени деполяризации. На рис. 1В представлены кумулятивные кривые секреции медиатора при деполяризации нервного окончания током величиной 4 мкА в течение 30 мин. При 5-минутной деполяризации в контроле из нервных окончаний освобождается примерно столько же квантов медиатора (1800-2000), сколько и при 25-минутной деполяризации нервного окончания, обработанного EGТА-АМ, и в присутствии ионов Cd2+ в окружающей среде (рис. 1В).

Л

Са2+ Ток 4 мкА Ток 4 мкА Ток 4 мкА

Са2+ Са2+ + Cd2++ Са2+ + Cd2++

EGTA-AM EGTA-AM

^ 100

х

I

ф

и

ф

а

о

е

65

30

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0 мкА, Са2+

№ 1

№ 2 ‘"Ц

‘ 4 ♦ i ; ; 4 мкА,

Са2+ + Cd2++ EGTA-AM

№ з:

4-Н4_, | . 4 мкА, Са2+ 8 12 16

Г

Ток 4 мкА

Са2+

Ток 4 мкА

Са2+ + Cd2++ EGTA-AM

Са2+

Б

1

2

3

4

В

Рис. 2. Эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул, вызванный деполяризацией мембраны нервного окончания. А — флуоресцентные изображения нервных окончаний, инкубируемых с FM1-43 (25 мин) в покое (1), при деполяризации током в контроле (в течение 5 мин (2)), на фоне действия EGТА-АМ и ионов Cd2+ в течение 5 (3) и 25 мин (4). Б — интенсивность флуоресценции нервных окончаний, предварительно инкубируемых с FM1-43 в разных условиях. В - динамика снижения яркости флуоресценции нервных окончаний (выгрузки FM1-43) при деполяризации в контроле (4 мкА, Са2+) и на фоне действия EGТА-АМ и Cd2+ (4 мкА, Са2+ + Cd2+ + EGТА-АМ). На графике приведена кривая (0 мкА, Са2+) изменения флуоресценции в покое без деполяризации. По оси ординат - интенсивность флуоресценции (100% - свечение до действия тока); по оси абсцисс - время действия тока (мин). Штриховыми линиями (№ 1, 2, 3) обозначены значения флуоресценции, соответствующие времени 6, 8 и 11 мин. Г - флуоресцентные изображения нервных окончаний, снятые в моменты времени 0, № 1, 2, 3

Флуоресцентная микроскопия. Деполяризация нервного окончания и процессы эндоцитоза синаптических везикул

Инкубация нервно-мышечного препарата в стандартном растворе Рингера с FM1-43 (5-40 мин) приводила к появлению неспецифического свечения нервного окончания (рис. 2А) из-за связывания красителя с мембраной [18-20]. При этом средняя интенсивность свечения нервного окончания составила 0.075 ± 0.005 отн. ед. (п = 32) (рис. 2Б). При деполяризации нервного окончания в течение 5 мин постоянным током силой 4 мкА в стандартном растворе Рингера с FM1-43 можно было обнаружить интенсивно светящиеся пятна, расположенные вдоль нервного окончания. Эти пятна представ-

ляют собой скопление везикул, прошедших цикл экзоцитоз-эндоцитоз и захвативших флуоресцентный краситель (рис. 2А). В этом случае средняя интенсивность свечения нервного окончания составила 0.16 ± 0.01 отн. ед. (п = 27, р < 0.05) (рис. 2Б). При совместном действии EGТА-АМ и ионов Cd2+ и деполяризации мембраны постоянным током силой 4 мкА (5 мин) загрузки красителя в нервное окончание не происходило (неспецифическое свечение нервного окончания 0.08 ± 0.004 отн. ед., п = 30, р >0.01) (рис. 2А,Б). Однако при более длительном воздействии постоянного тока (25 мин) вдоль нервного окончания появлялись светящиеся пятна (0.17 ± 0.01 отн. ед., п = 25, р < 0.05), отражающие протекание эндоцитоза (рис. 2А,Б).

Динамика экзоцитоза синаптических везикул при деполяризации нервных окончаний

Для непосредственной оценки экзоцитоза синаптических везикул мы анализировали динамику уменьшения свечения предварительно загруженных флуоресцентным маркером нервных окончаний [18-20]. Сначала с помощью деполяризации током 4 мкА в течение 5 мин производилась загрузка FM1-43, после периода покоя (1 ч) на окрашенные нервные окончания повторно воздействовали деполяризующим током (4 мкА), вызывающим освобождение красителя (путем экзоцитоза) из синаптических везикул и снижение флуоресценции нервных окончаний (рис. 2В,Г). Следует отметить, что в стандартном растворе Рин-гера светящиеся пятна сохранялись в течение длительного времени (рис. 2В,Г). На фоне действия постоянного тока (4 мкА) наблюдалось достаточно быстрое и выраженное уменьшение свечения предварительно загруженных нервных окончаний (рис. 2В,Г). К 2 мин деполяризации флуоресценция снижалась до 58 ± 3% (п = 10, р < 0.01), а через 12-15 мин - примерно до 30% от исходного уровня. Если после загрузки красителя препараты выдерживали в EGТА-АМ, а потом мембрану нервного окончания подвергали деполяризации постоянным током в присутствии Cd2+, то снижение интенсивности флуоресценции нервного окончания (выгрузка) происходило существенно медленнее (рис. 2В,Г). Так, после воздействия тока в течение 2 мин флуоресценция падала до 95 ± 2% (п = 10, р < 0.01), а по прошествии 12-15 мин светимость пятен сохранялась на уровне примерно 70% от первоначальной.

ОБСУЖДЕНИЕ

В большинстве работ по изучению процессов экзо-и эндоцитоза деполяризацию мембраны вызывают с помощью раствора с повышенным содержанием ионов калия [1, 20, 21]. Однако это изменяет равновесный потенциал К+ и все сопряженные с транспортом ионов К+ процессы (например, работу Па/К-АТР-азы), а также может ингибировать процессы эндоцитоза синаптических везикул [22]. В нашей работе для оценки роли мембранного потенциала в экзо- и эндоцитозе синаптических везикул мы использовали метод деполяризации мембраны нервного окончания постоянным током, который лишен описанных побочных эффектов.

Са-независимый экзоцитоз

Проведенные нами исследования показали, что при внеклеточной концентрации ионов кальция, равной 1.8 мМ, деполяризация мембраны нервного окончания постоянным током вызывает увеличение квантовой секреции медиатора (частота МТКП) и до-

статочно быстрой и выраженной выгрузке FM1-43 (рис. 1Б, 2В). Все это свидетельствует о том, что деполяризация мембраны нервного окончания стимулирует экзоцитоз синаптических везикул за счет открытия потенциал-зависимых Са-каналов, входа ионов Са2+ в нервные окончания и активации механизма слияния [1, 6, 23].

Следующая задача состояла в оценке значения ионов Са2+ в вызванном деполяризацией экзоцитозе синаптических везикул. Для этого можно было попробовать стимулировать деполяризацией экзоцитоз в бескальциевой среде, однако удаление внеклеточного Са2+ чревато нарушением архитектуры сайтов экзоцитоза, фазового состояния мембраны, структуры мембранных белков и блокирует эндоцитоз синаптических везикул [10, 24]. Поэтому все эксперименты были проведены при нормальной внеклеточной концентрации ионов Са2+.

Ионы Cd2+ в концентрации 0.2 мМ являются эффективными и универсальными блокаторами потенциал-зависимых Са-каналов всех ^-, П-, Р^-, И-, Т-) типов [25]. В двигательных нервных окончаниях холоднокровных обнаружены потенциалзависимые Са-каналы L-, П-, Р^- и Т-типов [26]. В опытах с применением Cd2+ показано, что деполяризация вызывает увеличение частоты МТКП, хотя и существенно менее выраженное, чем в контроле (рис. 1Б). Интересно, что сами ионы Cd2+ вызывают некоторое увеличение секреции медиатора (рис. 1Б), что характерно и для других двухвалентных и трехвалентных катионов [27]. Возможно, Cd2+ действует на чувствительный к Са2+ метаботропный рецептор, активация которого запускает сигнальный каскад, связанный с фосфолипазой С. В результате в нервном окончании образуется диацилглицерин (стимулирующий протеинкиназу С и белок экзоци-тоза Munc13) и инозитолтрисфосфат, увеличивающий внутриклеточную концентрацию Са2+ за счет выхода из эндоплазматического ретикулума [28]. Можно предположить, что ионы кадмия проникают внутрь нервного окончания, где стимулируют увеличение цитозольного уровня Са2+ за счет выброса его из депо [29].

Ранее нами было показано, что два буфера, связывающих внутриклеточные ионы Са2+ - EGТА-АМ и BAPТA-AM (1,2-бис(2-аминофенокси)этан-П,П,П',№-этилендиаминтетраукусной кислоты те-траацетоксиметиловый эфир), - в одинаковой степени угнетают вызванное гиперкалиевым раствором увеличение частоты МТКП (угнетают увеличение частоты МТКП, вызванное раствором с повышенным содержанием ионов калия), что свидетельствует о схожей эффективности хелатирования ими цитозольного Са2+ [30]. Для того чтобы убрать описанный

выше эффект Cd2, мы использовали EGТА-АМ. Действительно, на фоне хелатирования внутриклеточного Са2+ отсутствовал стимулирующий эффект ионов Cd2+ на частоту МТКП (рис. 1Б). В то же время на фоне действия EGТА-АМ и блокирования входа Са2+ из внеклеточной среды деполяризующий ток приводил к слабому, но статистически значимому увеличению частоты МТКП (рис. 1Б). В этих условиях с помощью флуоресцентной микроскопии также обнаружена эффективность постоянного тока (4 мкА) в стимулировании экзоцитоза синаптических везикул, что проявлялось в уменьшении свечения предварительно загруженных нервных окончаний (рис. 2В). Все эти наблюдения свидетельствуют о существовании наряду с классическим Са-зависимым экзоцитозом и не зависящего от внеклеточного Са2+ экзоцитоза синаптических везикул. Гипотетически этот вариант экзоцитоза запускается, вероятно, деполяризацией мембраны во время пресинаптического потенциала действия и является частью вызванной секреции медиатора.

Са-независимый эндоцитоз

Процессы экзо- и эндоцитоза тесно связаны и происходят в соотношении один к одному, поэтому оценку интенсивности эндоцитоза нужно проводить при одинаковой интенсивности экзоцитоза. На основе полученных данных мы определили, что при деполяризации в течение 5 мин и силе тока 4 мкА в контроле из нервного окончания освобождается столько же квантов, как и за 30 мин деполяризации нервного окончания, предварительно обработанного EGТА-АМ и при одновременном добавлении ионов Cd2+ в окружающую среду (рис. 1В). Это подтвердили результаты опытов с использованием маркера эндоцитоза FM1-43. В указанных условиях в нервных окончани-

ях появлялись светящиеся пятна примерно такой же интенсивности, как и в контроле (рис. 2А,Б). Можно предположить, что компенсаторный эндоцитоз может активироваться не только за счет увеличения внутриклеточной концентрации Са2+ при открытии потенциал-зависимых Са-каналов плазматической мембраны [12, 13], но и непосредственно деполяризацией мембраны нервного окончания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаруженная зависимость экзоцитоза и эндоцито-за от мембранного потенциала нервного окончания создает дополнительные возможности для регуляции секреции медиатора и синаптической передачи. Молекулярные мишени непосредственного воздействия деполяризации на экзо- и эндоцитоз синаптических везикул не установлены. Но в последних исследованиях потенциал-зависимость обнаруживается у многих сигнальных молекул (протеинкиназ А и С, фосфатазы фосфоинозитидов, сопряженных с G-белками пресинаптических ауторецепторов), воздействующих на механизм экзо- и эндоцитоза синаптических везикул [17, 31-33]. Не исключается также, что сенсором изменения мембранного потенциала являются непосредственно Са-каналы плазматической мембраны, которые могут передавать сигнал о деполяризации на SNARE-комплекс и белки эндоцитоза [14, 34].

Работа поддержана РФФИ (гранты № 11-04-00568_а, 12-04-31550_мол_а, 12-04-33195_мол_а_вед), Минобрнауки РФ (НШ-4670.2012.4, МК-108.2013.4) и государственным контрактом Минобрнауки РФ (ФЦП).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Зефиров А.Л., Петров А.М. Синаптическая везикула

и механизм освобождения медиатора (экзо-эндоцитозный везикулярный цикл). Казань: Арт-кафе, 2010. 356 с.

2. Heuser J.E., Reese T.S. // J. Cell Biol. 1973. V. 57. № 2.

Р 315-344.

3. Зефиров А.Л., Абдрахманов М.М., Григорьев П.Н. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2005. Т. 91. № 7. С. 821-831.

4. Ceccarelli B., Hurlbut W.P // J. Cell Biol. 1980. V. 87. № 1.

P. 297-303.

5. Ramaswami M., Krishnan K.S., Kelly R.B. // Neuron. 1994.

V. 13. № 2. P. 363-375.

6. Pang Z.P., Sudhof T.C. // Curr. Opin. Cell Biol. 2010. V. 22.

P. 496-505.

7. Xu J., Pang Z.P., Shin O.H., Sfldhof T.C. // Nat. Neurosci. 2009. V. 12. № 6. P. 759-766.

8. Groffen A.J., Martens S., Dlez Arazola R., Cornelisse L.N., Lozovaya N., de Jong A.P., Goriounova N.A., Habets R.L., Takai Y., Borst J.G., et al. // Science. 2010. V. 327. P 1614-1618.

9. Cousin M.A., Robinson PJ. // Trends Neurosci. 2001. V. 24.

P. 659-665.

10. Zefirov A.L., Abdrakhmanov M.M., Mukhamedyarov M.A., Grigoryev PN. // Neuroscience. 2006. V. 143. № 4. P. 905-910.

11. Balaji J., Armbruster M., Ryan T.A. // J. Neurosci. 2008. V. 28. P. 6742-6749.

12. Wu X.S., McNeil B.D., Xu J., Fan J., Xue L., Melicoff E., Adachi R., Bai L., Wu L.G. // Nat. Neurosci. 2009. V. 12.

P. 1003-1010.

13. Yao J., Kwon S.E., Gaffaney J.D., Dunning F.M., Chapman E.R. // Nat. Neurosci. 2011. V. 15. P. 243-249.

14. Parnas H., Segel L., Dudel J., Parnas I. // Trends Neurosci. 2000. V. 23. № 2. P 60-68.

15. Silinsky E.M., Watanabe M., Redman R.S., Qiu R., Hirsh J.K., Hunt J.M., Solsona C.S., Alford S., MacDonald R.C. // J. Physiol. 1995. V. 1. № 482. P. 511-520.

16. Zhang C., Zhou Z. // Nat. Neurosci. 2002. V. 5. № 5. P. 425-430.

17. Zhang C., Xiong W., Zheng H., Wang L., Lu B., Zhou Z. // Neuron. 2004. V. 42. № 2. P. 225-236.

18. Betz W.J., Bewick G.S., Ridge R.M. // Neuron. 1992. V. 9. № 5. P. 805-813.

19. Petrov A.M., Naumenko N.V., Uzinskaya K.V., Giniatullin A.R., Urazaev A.K., Zefirov A.L. // Neuroscience. 2011. V. 186. P. 1-12.

20. Зефиров А.Л., Григорьев П.Н., Петров А.М., Минлеба-ев М.Г., Ситдикова Г.Ф. // Цитология. 2003. Т. 45. № 12.

C. 1163-1171.

21. Ramirez D.M., Kavalali E.T. // Curr. Opin. Neurobiol. 2011.

V. 21. № 2. P. 275-282.

22. Зефиров А.Л., Абдрахманов М.М., Григорьев П.Н., Петров А.М. // Цитология. 2006. Т. 48. № 1. С. 34-41.

23. Angleson J.K., Betz W.J. // J. Neurophysiol. 2001. V. 85. № 1. P. 287-294.

24. Зефиров А.Л., Мухамедзянов Р.Д., Минлебаев М.Г., Чера-нов С.Ю., Абдрахманов М.М., Григорьев П.Н. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2002. Т. 88. С. 191-204.

25. Zheng N., Raman I.M. // J. Neurosci. 2009. V. 29. № 31.

P. 9826-9838.

26. Нуруллин Л.Ф., Ценцевицкий А.Н., Маломуж А.И., Никольский Е.Е. // ДАН. 2013. Т. 449. № 3. С. 360-363.

27. van der Kloot W., Molgo J. // Physiol. Rev. 1994. V. 74. № 4.

P. 899-991.

28. Vyleta N.P., Smith S.M. // J. Neurosci. 2011. V. 31. № 12.

P. 4593-4606.

29. Braga M.F., Rowan E.G. // Gen. Pharmacol. 1994. V. 25. № 8. P. 1729-1739.

30. Зефиров А.Л., Григорьев П.Н. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2008. Т. 146. № 12. С. 608-612.

31. Chen X., Zhang X., Jia C., Xu J., Gao H., Zhang G., Du X., Zhang H. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 46. P. 39760-39767.

32. Dekel N., Priest M.F., Parnas H., Parnas I., Bezanilla F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 1. P. 285-290.

33. Murata Y., Okamura Y. // J. Physiol. 2007. V. 583. P. 875-989.

34. Zheng H., Fan J., Xiong W., Zhang C., Wang X., Liu T., Liu H., Sun L., Wang Y., Zheng L., et al. // Biophys. J. 2009. V. 96.

P. 2449-2456.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.