CC BY
33
оригинальные статьи
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.017.1.083
Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М., Атауллаханов Р.И.
СИНЕРГИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ В ОТВЕТ НА ОДНОВРЕМЕННУЮ АКТИВАЦИЮ ПАРАМИ АГОНИСТОВ РАЗЛИЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва
Изучен эффект сверх аддитивного усиления выработки цитокинов дендритными клетками мыши (синергизм) при парных воздействиях через рецепторы врожденного иммунитета: TLR4, TLR9 и NOD2 в широком диапазоне концентраций агонистов этих рецепторов от 0,05 до 5 мкг/мл. Максимальный коэффициент синергизма (отношение отклика от парного воздействия к сумме откликов одиночных воздействий) наблюдали для выработки IL-12 при сочетании TLR4 и NOD2-агонистов — 12,8, при сочетании TLR4 и TLR9 — 7,1, при сочетании TLR9 и NOD2 — 5,8. Причем во всех случаях эффект наблюдали в области малых концентраций агонистов — 0,05—0,5 мкг/мл. Все парные сочетания изученных агонистов также давали значительный синергизм выработки MIP-1a: коэффициент синергизма при сочетании TLR4 и NOD2-агонистов — 4,5, при сочетании TLR4 и TLR9 — 4,8, при сочетании TLR9 и NOD2 — 2,9. Для выработки TNF и MCP-1 коэффициенты синергизма были ниже — в диапазоне 1,3—2,8, а для выработки RANTES и IL-1 синергизм практически не наблюдали.
Ключевые слова: дендритные клетки; цитокины; синергизм; рецепторы врожденного иммунитета; IL-12; MIP-1a.
Для цитирования: Пичугин А.В., Багаев А.В, Лебедева Е.С, Чулкина М., Атауллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(2): 118-123. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123
Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M., Ataullakhanov R.I.
SYNERGISTIC CYTOKINE PRODUCTION BY MURINE DENDRITIC CELLS IN RESPONSE TO THEIR SIMULTANEOUS ACTIVATION WITH PAIRS OF AGONISTS OF DIFFERENT INNATE IMMUNE RECEPTORS
«State research center Institute of immunology» FMBA, 115478, Moscow, Russia
The phenomenon of super-additive (synergistic) cytokine production by murine dendritic cells in response to their simultaneous activation with pairs of agonists of different innate immune receptors was studied. Paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists, each used in a wide range of concentrations (from 0.05 to 5 |jg/ml), were examined. Synergistic production of cytokines was represented as a synergy factor (SF), calculated as the ratio of response induced by certain pair of agonists to a sum of response rates induced by each of these two agonists, used alone. According to production of IL-12 by dendritic cells, maximum SF were observed after activation with TLR4 + NOD2 (SF = 12.8), and TLR4 + TLR9 (SF = 7.1), and TLR9 + NOD2 (SF = 5.8) agonists combinations. In all, the synergism was mostly observed when low concentrations (0.05—0.5 jg/ml) of agonists were used. All pairs of agonists studied also gave considerable synergy in induction of MIP-1a, showing SF 4.5, 4.8 and 2.9 with TLR4 + NOD2, or TLR4 + TLR9, or TLR9 + NOD2 agonists combinations, respectively. A synergism was less prominent in production of TNF-a (SF = 1.3) and MCP-1 (SF = 2.8). Just additive, but not synergistic productions were observed as regards to RANTES and IL-1, when dendritic cells were activated using the pairs of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists.
Keywords: dendritic cells; cytokines; synergy; congenital immunity receptors; IL-12, MIP-1a
For citation: Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M., Ataullakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simultaneous activation with pairs of agonists of different innate immune receptors. Immunologiya.2017; 38(1): 118-123. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123
For correspondence: Menzhinskaya Irina Vladimirovna, cand. Med. Sci., senior researcher of laboratory of clinical immunology «VI. Kulakov Scientific center for obstetrics, gynecology and Perinatology». Ministry of Health of Russia, E-mail: i_men-zinskaya@oparina4.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work was performed with financial support from grant RSF15-15-00102.
Received 07.10.17 Accepted 03.11.17
введение
Известно несколько классов рецепторов врожденного иммунитета, которые позволяют клеткам реагировать на контакт практически с любым микроорганизмом или его
Для корреспонденции: Пичугин Алексей Васильевич, канд. физ-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: pichalvas@ gmail.com
компонентами, а также узнавать о повреждении собственных тканей организма и адекватно реагировать на эти повреждения. К рецепторам врожденного иммунитета относят TLR рецепторы (toll-like receptors), NLR (NOD-like receptors), RLR (RIG-like receptors) и некоторые другие семейства рецепторов [1, 2].
В литературе детально описаны внутриклеточные сигнальные пути, начинающиеся с активации отдельных рецепторов врожденного иммунитета и завершающиеся активацией NF-kB, AP-1, IRF и других транскрипционных
факторов, которые управляют экспрессией определенных групп генов и последующей продукцией кодируемых этими генами белков [3].
Однако от одного инфекционного агента сигналы идут сразу по нескольким рецепторам, например грамнегативная бактерия вызывает ответ TLR2 и NOD2 от пептидогликана бактериальной стенки, TLR4 — от липополисахарида, TLR5 — от флагелина, TLR9 — от неметилированных участков CG бактериальной ДНК [4].
Одновременная активация нескольких рецепторов врожденного иммунитета может приводить к различным последствиям: усилению ответа, подавлению ответа, изменению спектра ответных сигналов. Синергизм выработки цитокинов при взаимодействии данных пар рецепторов ранее наблюдали в разных сочетаниях и условиях [5—7]. В литературе высказывают гипотезу о том, что несколько сигналов улучшают специфичность распознавания инфекционного агента [8]. Однако область изучения взаимодействия сигналов от рецепторов врожденного иммунитета только зарождается и содержит много нерешенных проблем, которые важны как для фундаментального понимания клеточной регуляции, так и для практического применения — разработки более эффективных лекарственных препаратов.
Мы изучали парные воздействия через три рецептора — TLR4, TLR9 и NOD2 — на выработку цитокинов дендрит -
original article
ными клетками мыши. Целью нашей работы было систематическое изучения явления усиления при варьировании концентраций агонистов в широком диапазоне (от 0,05 до 5 мкг/мл) каждого агониста и выявления зон синергизма выработки широкого спектра цитокинов (IL-1, IL-10, IL-12, MCP-1, MIP-1a, TNF, RANTES, IFN-y).
Материал и методы
В работе использованы следующие лиганды рецепторов врожденного иммунитета: агонист ^Я9-рецептора ODN 1826 (Кат. № tlrl-1826, Invivogene), фармацевтический агонист ^К4-рецептора иммуномакс («Иммафарма», Россия) [9], агонист NOD2-рецептора L18-MDP (Кат. № tlrl-lmdp, Invivogene). Рекомбинантный гранулоцитарный макрофа-гальный колониестимулирующий фактор мыши (GM-CSF) (Кат. № 576306, Biolenend).
Концентрацию цитокинов определяли наборами фирмы BD Biosciences: Mouse TNF Flex Set (Кат. № 558299), Mouse IL-12/IL-23p40 Flex Set (Кат. № 560151), Mouse IL-10 Flex Set (Кат. № 558296), Mouse MCP-1 Flex Set (Кат. № 558300), Mouse IL-1a Flex Set (Кат. № 560157), Mouse MIP-1a (CCL3) Flex Set (Кат. № 558449), Mouse RANTES Flex Set (Кат. № 558345).
Для культивирования клеток использовали полную среду (ПС), составленную из DMEM с 25 мМ HEPES с добавле-
пг/мл 3000 -1
пг/мл 8000
TNF
пг/мл
8000 и
Рис. 1. Усиление выработки цитокинов дендритными клетками костномозгового происхождения при одиночном воздействии агонистов TLR4 (1 — А), TLR9 (2 — 0) и NOD2 (3 — о) рецепторов: а — IL-12, б — RANTES, е — MIP-1a, г — MCP-1, д — TNF, е — IL-1, ж — IL-10, з — IFN-y.
По оси абсцисс — концентрация агониста в культуральной среде, мкг/мл, по оси ординат — концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. ДККМ инкубировали в количестве 30 000 на лунку 96-луночного планшета в течение 24 ч в присутствии различных концентраций агонистов TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов и определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
пг/мл
Рис. 2. Иллюстрация принципа подсчета коэффициента синергизма выработки цитокинов дендритными клетками при парных воздействиях двух агонистов рецепторов врожденного иммунитета на примере TNF.
1 — агонист NOD2 рецептора 0,05 мкг/мл, 2 — агонист TLR4 рецептора, 0,05 мкг/мл, 3 — сумма столбцов 1 + 2; 4 — измеренная концентрация TNF при одновременном воздействии агониста NOD2 рецептора, 0,05 мкг/мл и агониста TLR4 рецептора, 0,05 мкг/мл. Коэффициент синергизма: 4097/2737=1,5.
По оси ординат — концентрация TNF в культуральной среде за вычетом уровня в контроле, без добавления лигандов, равного 28 пг/мл. ДККМ инкубировали в количестве 30 000 на лунку 96-луночного планшета в течение 24 ч в присутствии различных сочетаний агонистов TLR4 и NOD2-рецепторов и определяли концентрацию TNF в культуральной среде.
нием коктейля заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ ¿-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ Р-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы «ПанЭко»).
Мышей линии BALB/c в возрасте 8—10 нед, получен-
ных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария Института иммунологии ФМБА. Дендритные клетки получали in vitro дифференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии GM-CSF. Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в полной среде с добавлением 10 нг/мл GM-CSF, на 3-и сутки половину среды удаляли и добавляли новую с 10 нг/мл GM-CSF, как описано в литературе [10]. На 7-е сутки снимали неадгезионные клетки, которые содержали 75—80% дендритных клеток, определенные как CDll + MHCII + клетки.
Дендритные клетки инкубировали в лунках 96-луночного плейта в количестве 30 000 клеток в 100 мкл в ПС в течение 24 ч при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в присутствии различных сочетанных агонистов. Все образцы были раскапаны в дублях. После окончания инкубации отбирали 50 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки и замораживали при -20°C до момента анализа (не более 2 нед).
Концентрацию цитокинов определяли методом CBA FLEX BD Biosciences на приборе BD FACSAria II с использованием программного обеспечения BD FACS Diva 6 и пакета FCAP Array Software v. 1.0.1.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета Statistica v. 7.0 (StatSoft Inc.), достоверность отличий оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона— Манна—Уитни (Wilcoxon—Mann—Whitney test, WMW).
Результаты
Выработка цитокинов дендритными клетками при воздействии одиночных агонистов. На первом этапе мы определили выработку цитокинов при воздействии агони-
Рис. 3. Выработка IL-1 (а—в) и RANTES (г—е) дендритными клетками мыши костномозгового происхождения при парном воздействии агонистов TLR4 и NOD2 рецепторов (а, г), TLR4 и TLR9 рецепторов (б, д) и TLR9 и NOD2 рецепторов (в, е).
По оси абсцисс — концентрация агониста в культуральной среде, мкг/мл, по оси ординат — концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. ДККМ инкубировали в количестве 30 000 на лунку 96-луночного планшета в течение 24 часов в присутствии различных концентраций агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 рецепторов и определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде.
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 4. Выработка TNF (а—в) и MCP-1 (г—е) дендритными клетками мыши костномозгового происхождения при парном воздействии агонистов TLR4 и NOD2 рецепторов (а, г), TLR4 и TLR9 рецепторов (б, д) и TLR9 и NOD2 рецепторов (в, е).
По оси абсцисс — концентрация агониста в культуральной среде, мкг/мл, по оси ординат — концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. ДККМ инкубировали в количесте 30 000 на лунку 96 луночного планшета в течение 24 ч в присутствии различных концентраций агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 рецепторов и определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде.
Рис. 5. Выработка MIP-1 (а—в) и IL-12 (г—е) дендритными клетками мыши костномозгового происхождения при парном воздействии агонистов TLR4 и NOD2- рецепторов (а, г), TLR4 и TLR9 рецепторов (б, д) и TLR9 и NOD2 рецепторов (в, е).
По оси абсцисс — концентрация агониста в культуральной среде, мкг/мл, по оси ординат — концентрация цитокина в культуральной среде, пг/мл. ДККМ инкубировали в количестве 30 000 на лунку 96-луночного планшета в течение 24 ч в присутствии различных концентраций агонистов TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов и определяли концентрацию цитокинов в культуральной среде.
оригинальные статьи
стов TLR4-, TLR9- и NOD2-pe^nropoB в широком диапазоне концентраций: от 0,05 до 5 мкг/мл (рис. 1). Агонист NOD2-рецептора, L18-MDP, практически не стимулировал выработку ни одного из исследованных цитокинов, даже при максимальной концентрации 5 мкг/мл. Агонист TLR9-рецептора, ODN CpG1826, в концентрации 0,5 мкг/мл начинал стимулировать выработку некоторых цитокинов: IL-12, RANTES, а при концентрации 5 мкг/мл этот спектр дополнялся выработкой MIP-1a, MCP-1 и TNF.
Максимальный спектр выработки цитокинов: 6 (IL-12, RANTES, MIP-1a, MCP-1, TNF, IL-1) из 8 исследованных, давал агонист ^Я4-рецептора, иммуномакс, причем выработка двух из них, RANTES и TNF, уже при концентрации лиганда 0,05 мкг/мл была сопоставима с максимальной. Только два из исследованных цитокинов (IL-10, IFN-y) практически не вырабатывались при воздействии на TLR4-, TLR9- и NOD2-рецепторы.
Феномен синергизма. Из литературы [5—7], а также по нашим предварительным экспериментам известно, что при одновременном воздействии через рецепторы врожденного иммунитета ответ клеток по выработке цитокинов может нелинейно усиливаться.
Целью данной работы было систематическое изучение эффекта синергизма при парных сочетаниях агонистов TLR4-, TLR9- и NOD2-рецепторов в диапазоне концентраций агонистов от 0,05 до 5 мкг/мл по выработке широкого спектра цитокинов: IL-1, IL-10, IL-12, MCP-1, MIP-1a, TNF, RANTES, IFN-y.
Для количественной оценки эффекта мы использовали определение коэффициента синергизма, принцип измерения которого представлен на рис. 2. А именно, мы определяли выработку цитокина при воздействии каждого из агонистов и при их одновременном использовании. Коэффициент синергизма (отклонение от линейного суммирования) определяли как отношение отклика при парном воздействии к сумме одиночных откликов. В приведенном на рис. 2 примере, коэффициент синергизма равен 1,5.
Не для всех цитокинов и не при всех сочетаниях агонистов мы наблюдали эффект синергизма, например для IL-1 и RANTE S он практически отсутствовал, но по разным причинам.
Как видно из данных, приведенных на рис. 3, а—в и в таблице, сочетание агониста TLR9 и NOD2 не стимулировало выработку IL-1 ни при каких концентрациях, TLR4-агонист дозозависимо повышал производство IL-1, но добавление и TLR9-, и NOD2-агониста не приводило к усилению сигнала вплоть до максимальной концентрации 5 мкг/мл, при которой начинал проявляться синергизм (коэффициент 1,9 для NOD2 и 1,5 — для TLR9).
В случае RANTES сами одиночные агонисты TLR4 и TLR9 стимулируют выработку цитокина (см. рис. 1, б, рис. 3, г—е, см. таблицу). Сочетание агонистов TLR4 и TLR9 с активацией NOD2 не изменяет выработку RANTES (коэффициент синергизма 1).
Сочетание агонистов TLR4 и TLR9 не приводит к дополнительной выработке RANTES, отклик клеток оказывается меньше, чем сумма одиночных ответов, поэтому коэффициент синергизма меньше 1.
Для TNF и MCP-1 мы наблюдали умеренные эффекты синергизма (рис. 4, см. таблицу). Так коэффициент нелинейного усиления выработки TNF при всех парных сочетаниях TLR4-и NOD2-рецепторов и TLR4 и TLR9 находился в пределах 1,3—1,5 при концентрациях лигандов в диапазоне 0,05—0,5 мкг/мл.
Несколько больший синергизм выработки TNF наблюдали при сочетании TLR9 и NOD2 — до 2,8, при концентрации TLR9 лиганда 5 мкг/мл.
Для MCP-1 коэффициенты синергизма находились в пределах 1,3—2 для всех пар сочетаний агонистов (рис.4, г—е, см. таблицу).
Коэффициенты синергизма выработки цитокинов дендритными клетками при парных взаимодействиях через рецепторы врожденного иммунитета TLR4, TLR9 и NOD2
L-12 MIP-1a | TNF
Концентрация NOD2 агониста L18-MDP, мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR4 агониста
иммуномакса,
мкг/мл
0,05 12,3 12,8 12,7 4,5 4,3 2,3 1,5 1,5 1,1
0,5 4,6 4,7 4,6 1,2 1,1 1,1 1,2 1,1 1,0
5 1,6 2,2 3,2 1,0 0,8 0,6 1,2 1,3 1,6
Концентрация TLR9 агониста ODN CpG1826,
мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR4 агониста
иммуномакса,
мкг/мл
0,05 7,1 2,7 1,8 2,5 4,8 3,0 1,0 1,3 1,2
0,5 6,6 3,5 2,7 1,1 1,0 0,8 1,2 1,3 1,2
5 2,0 1,6 1,7 0,8 0,6 0,4 1,0 1,1 1,1
Концентрация NOD2 агониста L18-MDP, мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR9 агониста
ODN CpG1826,
мкг/мл
0,05 5,5 5,8 5,1 0,9 1,3 1,0 0,9 1,2 1,2
0,5 3,3 3,4 3,1 2,3 2,9 3,1 2,3 2,8 2,9
5 2,4 2,6 2,5 1,2 1,6 1,8 1,7 1,8 1,9
MCP-1 RANTES IL-1
Концентрация NOD2 агониста L18-MDP, мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR4 агониста
иммуномакса,
мкг/мл
0,05 2,0 2,2 1,7 1,2 1,2 1,0 1,4 1,6 1,4
0,5 1,3 1,2 1,2 0,9 0,9 0,9 1,3 1,2 1,3
5 1,0 0,7 0,9 0,9 0,8 0,9 1,1 1,2 1,9
Концентрация TLR9 агониста ODN CpG1826,
мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR4 агониста
Иммуномакса,
мкг/мл
0,05 1,1 1,5 1,5 0,8 0,6 0,6 1,2 1,4 1,4
0,5 1,2 1,3 1,4 0,8 0,6 0,6 1,3 1,8 1,7
5 0,9 1,3 1,2 0,8 0,5 0,5 1,2 1,5 1,5
Концентрация NOD2 агониста L18-MDP, мкг/мл
Концентрация 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5 0,05 0,5 5
TLR9 агониста
ODN CpG1826,
мкг/мл
0,05 0,3 0,8 0,3 1,0 1,5 1,0 0,8 0,8 0,8
0,5 1,5 1,8 1,4 1,0 1,1 1,1 1,2 1,6 1,6
5 1,4 1,7 1,4 0,9 0,9 1,0 1,3 1,4 1,5
Примечание. В таблице приведены значения коэффициентов синергизма, определенные, как показано на рис. 2.
Наибольший интерес из исследованных цитокинов представили М1Р-1а и ТЬ-12, для которых коэффициенты синергизма достигали 4,8 и 12,8 соответственно.
Максимальный эффект синергизма выработки М1Р-1а (коэффициент 4,5—4,8) наблюдали при малых концентрациях TLR4-агониста 0,05—0,5 мкг/мл в сочетании с малыми концентрациями NOD2- и TLR9-агониста
(0,05—0,5 мкг/мл). Интересно заметить, что при больших концентрациях TLR4 (5 мкг/мл) добавление второго сигнала (TLR9 или NOD2) уже не приводило к усилению, а даже наоборот — к падению коэффициента синергизма до 0,4—0,6.
Уникальное поведение показал IL-12 — для него были получены максимальные коэффициенты синергизма, причем для всех пар сочетаний агонистов TLR4-, TLR9- и NOD2-рецепторов и, что особенно важно, при малых концентрациях всех лигандов (0,05—0,5 мкг/мл). Ни один из использованных лигандов в концентрации 0,05 мкг/мл не стимулировал выработку IL-12 (рис. 1, а, рис. 5, г—е), а вот сочетанное воздействие TLR4 + NOD2, TLR4 + TLR9 и TLR9 + NOD2 стимулировало выработку IL-12 (коэффициенты синергизма 12,3; 7,1 и 5,5 соответственно).
Обсуждение
IL-12 — ключевой цитокин для стимуляции как естественного, так и адаптивного иммунитета [11]. IL-12 определяет активацию T-клеточного ответа 1-го типа, активирует выработку IFN-y T-клетками и NK-клетками. Многие агони-сты рецепторов естественного иммунитета стимулируют выработку IL-12 дендритными клетками [12].
Эффект синергизма выработки IL-12 дендритными клетками при воздействии через несколько рецепторов врожденного иммунитета наблюдали ранее [7, 13]. В работе Gabi [7] отмечено усиление выработки IL-12 при сочетании LPS и CpG, авторы использовали концентрации агонистов 1 мкг/мл, получили усиление выработки IL-12 в 5 раз. Наши данные показывают, что максимальный синергизм можно получить при малых концентрациях агонистов 0,05 мкг/мл: сочетание агонистов TLR4 (иммуномакс) и TLR9 (CpG) дает коэффициент усиления 7. В статье [13] авторы использовали сочетание TLR4- (LPS) и NOD2- (MDP) агонистов в концентрации 10 мкг/мл и получили примерно 4-кратный синергизм, а мы обнаружили, что в области малых концентраций 0,05 мкг/мл сочетание TLR4- и NOD2-агонистов дает усиление в 12,8 раз.
MIP-1a — хемоаттрактант, принадлежащий к семейству CC-цитокинов, регулирует острые и хронические воспалительные ответы, привлекая иммунные клетки в места воспаления [14]. MIP-1a играет критическую роль для миграции T-клеток из циркуляции в воспаленные ткани, а также вызывает трансэндотелиальную миграцию моноцитов, дендритных клеток и NK-клеток [15].
Мы наблюдали эффект синергизма выработки MIP-1a при сочетании воздействия TLR4-агониста с NOD2-агонистом (коэффициент 4,5) и TLR9-агонистом (коэффициент -4,8). Однако в работе [16] авторы наблюдали падение сигнала при парных сочетаниях двух TLR-агонистов по сравнению с одиночными воздействиями.
Из рис. 5, б видно, что в области концентраций TLR4-агониста 0,05 мкг/мл и TLR9-агониста 0,5 мкг/мл наблюдается синергизм (коэффициент 4,8), а при концентрации обоих агонистов 5 мкг/мл суммарный ответ меньше одиночного (коэффициент 0,4). Это может объяснить расхождение наших данных с данными D. Mitchell [16], которые использовали концентрации агонистов 2 мкг/мл, и подчеркивает важность исследования всей области сочетания концентраций агони-стов.
original article
Заключение
При систематическом исследовании в широком диапазоне комбинаций концентраций агонистов было обнаружено, что максимальный эффект синергизма при парных воздействиях через рецепторы врожденного иммунитета достигается при очень малых концентрациях агонистов.
Это имеет важное биологическое значение — стимуляция иммунной реакции при первом контакте с возбудителем, когда его количество еще незначительно.
Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-15-00102.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература (references)
1. Thompson M.R., Kaminski J.J., Kurt-Jones E.A., Fitzgerald K.A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 2011; 3(6): 920—40,
2. Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 2010; 140(6): 805—20.
3. Kawasaki T., Kawai T. Toll-like receptor signaling pathways. Front. Immunol. 2014; 5: 461. doi:10.3389/fimmu.2014.00461
4. Mogensen T.H. Pathogen eecognition and inflammatory signaling in innate immune defenses. Clin. Microbiol. Rev. 2009; 22(2): 240—73. doi:10.1128/CMR.00046-08
5. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A, et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005; 54(11): 1553—7. doi:10.1136/gut.2005.065888.
6. Fritz J.H. et al., Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-acti-vating agonists, Eur. J. Immunol. 2005. 35: 2459—70.
7. Theiner G., RoBner S., DalpkeA., Bode K., Berger Th., Gessner A., Lutz M.B. TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells. Mol. Immunol. 2008; 45: 244—52. doi:10.1016/j.molimm.2007.02.021
8. Tan R.S., Ho B., Leung B.P., Ding J.L. TLR cross-talk confers specificity to innate immunity, Int. Rev. Immunol. 2014; 33(6): 443—53. doi: 10.3109/08830185.2014.921164
9. Ghochikyan A., Pichugin A., Bagaev A. et al. Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax®, as a therapeutic strategy for metastatic breast cancer. J. Translat. Med. 2014; 12: 322. doi:10.1186/s12967-014-0322-y.
10. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S. et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 1992; 176(6): 1693—702
11. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity, Nature Rev. Immunol. 2003; 3: 133—46. doi:10.1038/nri1001
12. Kaisho T., Akira S. Regulation of dendritic cell function through Toll-like receptors. Curr. Mol. Med. 2003; 3: 373—85.
13. Tada H., Aiba S., Shibata K., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with Toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. andImmun. 2005; 73, 7967—76.
14. Menten P. et al. Macrophage inflammatory protein-1, Cytokine Growth Factor Rev. 2002; 13(6): 455—81.
15. Maurer M., von Stebut E. Molecules in focus Macrophage inflammatory protein-1, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004; 36: 1882—6.
16. Mitchell D., Olive C. Regulation of Toll-like receptor-induced chemokine production in murine dendritic cells by mitogen-activated protein kinases. Mol. Immunol. 2010; 47: 2065—73.
Поступила 07.10.17 Принята в печать 03.11.17
