CC BY
18
1ЬМА НОМРРА
Штаммы вируса краснухи дая живой аттенуированной вакцины
И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская, В.З. Агрба, Л.А. Яковлева, Ю.А. Радюкевич, А.Б. Жебрун ФГУ «Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера» Минзлрава России, НИИ мелииинской приматологии РАМН, г. Аллер
Приказом Минзлрава России (27.06.2001 г. < 229) с 1 января 2002 гола помимо первичной вакцинации против краснухи в возрасте 12 месяцев лля профилактики врожленной краснухи ввелена первичная прививка лля левочек 13 лет. Обеспечить нормативный уровень охвата иммунизацией против краснухи затрулнительно из-за отсутствия отечественного препарата лля профилактики инфекции и высокой стоимости зарубежных вакцин. При том, что срелний показатель заболеваемости краснухой за 5 месяцев 2003 гола существенно снизился по сравнению с аналогичным периолом 2002 (61,7 и 188,6 на 100 тыс. населения соответственно), у летей он остается высоким (281,9 и 916,6 на 100 тыс. летей соответственно).
В
СССР разработка специфических средств борьбы с инфекцией была начата в 70-е годы прошлого столетия. Отечественный вакцинный штамм «Орлов» был получен в НИИЭМ имени Пастера (автор В.Н. Мешалова) путем аттенуации эпидемического вируса краснухи методом серийных пассажей на первичной культуре клеток почки кролика. В 1979 году после успешных клинических испытаний штамм «Орлов» был депонирован в Государственную коллекцию музейных вирусов. Однако в условиях того времени, когда большинство детей дошкольного возраста посещало ДДУ и среди женщин детородного возраста восприимчивость к инфекции составляла всего 3 - 6% [1], было принято решение не проводить массовую вакцинацию детей против краснухи. Вакцинный штамм «Орлов» не был внедрен в производство.
Исследования в этом направлении возобновились в 1994 году в рамках Федеральной программы «Вак-цинопрофилактика». В 1995 году путем проведения трех дополнительных пассажей в той же культуре клеток штамм был восстановлен и получил наименование «Орлов-В». В том же году штамм был сертифицирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и депонирован в Государственную коллекцию музейных вирусов.
Однако использование в промышленном производстве первичной культуры клеток в качестве тканевого субстрата сопряжено с рядом трудностей, главная из которых - необходимость создания специализированных питомников со строго контролируемыми условиями содержания животных-продуцентов. Значительно более перспективными следует признать полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток человека, рекомендованные экспертами ВОЗ для производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), предназначенных для парентерального введения людям. Вакцинный штамм вируса краснухи
КЛ27/3, входящий в состав всех зарубежных препаратов для профилактики краснухи, получен путем аттенуации дикого вируса на диплоидной линии клеток человека - штамма Ш^аг-ЗБ. Этот же штамм с успехом используется в качестве тканевого субстрата при производстве ряда других противовирусных вакцин.
В ходе поиска более технологичного тканевого субстрата для производства краснушной вакцины определялась чувствительность ряда диплоидных линий к вирусу краснухи. В результате этой работы при проведении одного дополнительного пассажа штамма «Орлов-В» на диплоидной линии кожно-мышеч-ных фибробластов эмбриона человека получен альтернативный вариант исходного штамма - «Орлов-Д». Использованная в данном исследовании диплоидная линия клеток, штамм М-22 (автор Л.Л. Миронова), сертифицирована в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и рекомендована для производства на ее основе вакцинных препаратов. Характеристика аттенуиро-ванных штаммов вируса краснухи, полученных в НИИЭМ им. Пастера, представлена на рисунке 1.
Вакцинные штаммы для живых аттенуированных вакцин должны соответствовать национальным требованиям в отношении реактогенности, безопасности и специфической активности [3]. Штаммы вируса краснухи, полученные в НИИЭМ им. Пастера, в разной степени изучены по вышеперечисленным критериям. Наиболее полно охарактеризован исходный вакцинный штамм «Орлов», прошедший клинические испытания на ограниченной группе лиц.
Клинические испытания штамма «Орлов»
После всестороннего доклинического изучения, включающего определение тератогенности, контаги-озности и остаточной нейровирулентности на обезьянах, штамм «Орлов» был испытан на 210 детях
IFMA HQMFPA
школьного возраста [5]. Препарат вводили подкожно, однократно, в количестве 0,5 мл. Одна прививочная доза содержала 1000 ТЦД50. Серологическое обследование детей проводили до введения препарата, спустя 30 суток и год после вакцинации. Клинические реакции и специфическую активность оценивали по группе серонегативных к вирусу краснухи лиц, составляющей 94 человека. Наблюдаемые реакции были слабо выражены и кратковременны (таблица 1).
Повышение температуры тела до 37,60С регистрировали у одного ребенка, у 10% - субфебрильную температуру. Продолжительность температурных реакций не превышала одних суток. Мелкопятнистая сыпь имела место в 5% от общего числа привитых детей, ее обратное развитие заканчивалось к третьему дню после появления. Незначительное увеличение заднешейных и затылочных лимфоузлов у 14% привитых регистрировали к концу первой - началу второй недели после вакцинации. Симптоматики со стороны суставов не отмечалось. Проявления катарального синдрома выявлялось у 37% привитых против 10% в группе сравнения. Так как вакцинацию проводили в осенний и весенний периоды, на результаты клинического наблюдения, безусловно, повлиял сезонный подъем заболеваемости острыми респираторными заболеваниями. Тем не менее, клинические реакции на введение препарата не требовали медикаментозного лечения и не влияли на общее самочувствие привитых. По результатам 30-дневного наблюдения было сделано заключение о безопасности и безвредности испытуемого препарата.
В ходе клинических испытаний была показана высокая иммуногенная активность штамма «Орлов». При исследовании парных сывороток в реакциях торможения агглютинации (РТГА) и нейтрализации (РН) отмечали 100%-ную сероконверсию (таблица 2). При этом более чем у половины привитых определяли высокий уровень специфических антител (АТ).
Формирование поствакцинального иммунитета у детей с низким исходным уровнем специфических антител (1:10 - 1:20) и в группе серонегативных существенно не различалось. Среднегеометрические титры антител (СГТ АТ) составляли 7,7 (!§2 х). В то же время 93 ребенка, у которых до вакцинации определяли специфические антитела в титре 1:40 и выше, не ответили их приростом на введение препарата. То есть для этой группы привитых вакцинация оказалась бесполезной процедурой. Никаких побочных реакций, превышающих допустимый порог реактогенно-сти, и в этой группе привитых не регистрировали.
Учитывая, что наиболее интенсивное падение уровня антител происходило в первый год после иммунизации, авторы проводили через год после иммунизации серологическое обследование привитых. У половины из них титр антигемагглютининов сохранялся на том же уровне, у другой половины - отмечали двукратное снижение титров специфических антител. При этом у всех детей, обследованных через год после введения препарата, не наблюдали снижения уровня антител ниже титра 1:40.
Таким образом, клинические испытания показали, что штамм «Орлов» обладает высокой иммуно-генной активностью и низкой реактогенностью, сопоставимой с аналогичными показателями зарубежных вакцин, получаемых из штамма RA27/3.
Доклиническое изучение вариантов штамма «Орлов»
Восстановленный после шестнадцатилетнего хранения вакцинный штамм «Орлов-В» и полученный на диплоидной линии клеток человека M-22 штамм «Ор-лов-Д» после проведения лабораторного контроля на стерильность, специфичность, биологическую активность, отсутствие посторонних вирусов, микробов и микоплазм были испытаны на обезьянах макака-резус для определения остаточной нейровирулентно-сти, специфической активности и безвредности применения. Перед проведением эксперимента на обезьянах исследуемые материалы были зашифрованы.
Исследование осуществлено на базе НИИ медицинской приматологии PAMH. Всего в опыте использовано 18 животных. Определение остаточной ней-ровирулентности проводили при интрацеребральном заражении 9 обезьян, разделенных на 4 группы. Штамм «Орлов-В» вводили животным группы I, «Ор-лов-Д» - группы II, взвесь клеток незараженной производственной культуры почки кролика - группы III, животные группы IV получали препарат сравнения -вакцинный штамм RA27/3, входящий в состав крас-нушной вакцины Rudivax. Исследуемый материал вводили в область зрительного бугра обоих полушарий головного мозга в объеме 0,25 - 0,3 мл в каждое. Интрацеребральная доза вводимого вируссо-
Рисунок 1.
Аттенуированные штаммы вируса краснухи, полученные в НИИЭМ им. Пастера
IFMA HQMFPA
Таблица 1.
Реактогенные свойства вакцинного штамма «Орлов» (группа серонегативных)
Число обследуемых Температурные реакции Катаральные явления Мелкопятнистая сыпь Увеличение лимфоузлов
94 11% 37% 5% 14%
Таблица 2.
Специфическая активность вакцинного штамма «Орлов» (группа серонегативных)
Кол-во парных сывороток Кол-во привитых (%), РТГА СГТ АТ (lg2 х)
Высокий уровень АТ (1:320-1:2560) Средний уровень АТ (1:80-1:160) В РТГА В РН
94 53,2 46,8 8,1 5,4
Таблица 3.
Специфическая активность вариантов штамма «Орлов» в опыте на обезьянах макака-резус
< обезьяны/ Вводимый мат-ал/ Способ введения, Титры антител в РТГА с 4 ГАЕ
< клетки инфеки. акт. доза
33238/7 «Орлов-В» 3,3 ^ ТЦД50/0,1 В/мышечно 0,5 мл 1 320
32923/7 «Орлов-В» 3,3 ^ ТЦД50/0,1 В/ кожно по 0,25 мл х 2 1 1280
33385/8 «Орлов-В» 3,3 ^ ТЦД50/0,5 В/мышечно 0,5 мл 1 160
33653/8 Не иммунизирован < 1 : 10
33309/9 «Орлов-В» 3,3 ^ ТЦД50/0,5 В/мышечно 0,5 мл 1 320
32937/10 «Орлов-Д» 3,5 ^ ТЦД50/0,5 В/мышечно 0,5 мл 1 640
32834/10 «Орлов-Д» 3,5 ^ ТЦД50/0,5 В/мышечно 0,5 мл 1 640
33719/11 1^ис11уах 5 прививочных доз В/мышечно 0,5 мл 1 320
33730/11 1^ис11уах 5 прививочных доз В/кожно по 0,25 мл х 2 1 320
держащего материала соответствовала 10 прививочным дозам для человека. То есть обезьянам, инфицированным вариантами штамма «Орлов» и штаммом 1кЛ27/3, вводили по 10 000 ТЦД50 вируса.
После окончания клинического наблюдения (30 суток) профессор Л.А. Яковлева провела гистологическое исследование тканей головного и спинного мозга умерщвленных под кетаминовым наркозом животных. При окраске препаратов гематоксилином с эозином и тионином по методу Ниссля у животных каждой из 4 групп были исследованы: передняя центральная извилина, задняя центральная извилина, зрительный бугор правого полушария головного мозга; продолговатый мозг; спинной мозг в области шейного и поясничного утолщений.
У всех инфицированных обезьян отсутствовали клинические симптомы поражения центральной нервной системы в течение периода наблюдения. При гистологическом исследовании тканей головного и спинного мозга (в пределах использованного метода) патологических изменений в нейронах и глиальных клетках обнаружено не было. Нервные клетки имели четкие контуры, светлое пузырьковидное ядро с крупной центрально расположенной нуклеолой и отчетливые глыбки нисслевского вещества в цитоплазме. У одного животного, зараженного штаммом «Орлов-В», обнаружены посттравматические изменения в области инокуляционной травмы (припаивание оболочек мозга к внутреннему апоневрозу черепа). В то же время 100% интрацеребрально зараженных животных приобрели специфические антитела к вирусу краснухи.
По результатам проведенного опыта сделано заключение о том, что исследуемый материал не является нейровирулентным.
При изучении специфической активности препаратов 9 обезьян, разделенных на три группы, были иммунизированы штаммами «Орлов-В» (группа I), «Орлов-Д» (группа II), коммерческой вакциной Rudivax (группа III) в дозе, соответствующей 5 прививочным дозам для человека. Вируссодержаший материал разводили в растворе Хенкса и вводили в объеме 0,5 мл внутримышечно или по 0,25 мл внутрикож-но по типу «лимонной корочки».
Для изучения контагиозности штамма «Орлов-В» один макак не был иммунизирован и находился в клетке с иммунизированным животным на протяжении 30 суток от момента вакцинации. Через 30 суток у животных брали пробы крови, отделяли сыворотку от кровяного сгустка и исследовали в РТГА с 4 TAF краснушного геммаглютинируюшего антигена.
Все иммунизированные обезьяны при однократном введении вариантов штамма «Орлов» и коммерческой вакцины Rudivax ответили образованием специфических антител (таблица 3).
Максимальные титры антител (1 : 1280) регистрировали при внутрикожном способе введения препарата из штамма «Орлов-В», однако в группе сравнения (животные, привитые коммерческой вакциной Rudivax) способ введения препарата не сказался на интенсивности образования специфических антител. Очевидно, что для определения специфической активности вариантов штамма «Орлов», а также зависимости интенсивности антителообразования от
-ел
tu
т
IFMA HOMFFA
способа введения вакцинного препарата необходимо повторить эксперимент на большем количестве животных, позволяющем провести статистическую обработку результатов. Однако нельзя не отметить тот факт, что в условиях данного эксперимента макаки, иммунизированные вариантами штамма «Орлов», ответили образованием антител в высоких титрах, как правило, равных или превышающих титры антител в сыворотке крови животных, привитых коммерческой вакциной 1КиС1уах.
У неиммунизированного животного, находившегося в тесном контакте с иммунизированной обезьяной, образования специфических антител не выявлено.
Таким образом, в данном исследовании показана высокая специфическая активность штаммов «Ор-лов-В» и «Орлов-Д».
Кроме того, лимфоциты периферической крови иммунизированных животных были подвергнуты цито-генетическому анализу, который проводили методом подсчета аббераций 50 метафазных пластинок рутинно окрашенных хромосом. Выявлено, что во всех проанализированных клетках кариотип - 2п = 46 ХУ. Установленное число аббераций равно: у макака < 33309 -2%; макака е33385 - 1% (животные привиты препаратом из штамма «Орлов-В»); макака < 33730 (группа сравнения) - 1%. В клетках периферической крови остальных животных абберации хромосом обнаружено не было. Выявленный уровень абберации хромосом не превышает допустимый нормы (3%), свидетельствуя о том, что варианты штамма «Орлов» не обладают мутагенной активностью. В лимфоцитах периферической крови контрольной обезьяны (е 33653) также не выявлено клеток с абберациями хромосом, что свидетельствует о достоверности полученных результатов.
Проведенное доклиническое изучение полученных нами вариантов штамма «Орлов» показало отсутствие у них остаточной нейровирулетности при инт-рацеребральном заражении обезьян, их безвредность (отсутствие мутагенной активности) и высокую специфическую активность. Продемонстрировано также отсутствие контагиозности штамма «Орлов-В».
При интрацеребральном введении обезьянам взвеси неинфицированных клеток почки кролика -субстрата для получения штамма «Орлов-В» - никаких патологических воздействий тканевого субстрата
на организм животного выявлено не было. Диплоидная линия клеток человека M-22 (тканевой субстрат для получения штамма «Орлов-Д») была всесторонне изучена при аттестации линии в ГИСК им. Тарасаеви-ча и, как уже говорилось выше, рекомендована для производства на ее основе MИБП, вводимых людям.
Изученные нами производственные характеристики линии клеток M-22, а именно: стабильно высокая чувствительность клеток ( на протяжении 20-кратного пассирования клеточной культуры) к вирусу краснухи, не уступающая чувствительности прототипной первичной культуры клеток почки кролика; устойчивость к крио-консервации (что определяет возможность создания банка производственных клеток); стабильность биологических свойств вируса при его 10-кратном пассировании в культуре M-22 - свидетельствуют о ее пригодности для промышленного производства вакцины. Рекомендуемый ВОЗ контроль диплоидных линий (стабильности кариотипа, отсутствие туморогенной активности клеток) не является чрезмерно трудоемким или тяжело осуществимым и не может быть препятствием для использования этих линий в промышленном производстве.
В рамках данного исследования разработаны основные технологические характеристики получения препарата вакцины как на первичной, так и на диплоидной линиях клеток, подготовлена первичная НТД на препараты.
Высокая стоимость исследований на обезьянах не позволила провести эксперимент по определению остаточной нейровирулентности штаммов на требуемом по нормативным документам количестве животных. Тем не менее полученные результаты свидетельствуют о перспективности внедрения штаммов «Ор-лов-В» и «Орлов-Д» в производство отечественной вакцины против краснухи.
Дальнейшие работы в этом направлении должны быть сосредоточены на:
• повторении опыта по оценке остаточной нейровирулентности штаммов «Орлов-В» и «Орлов-Д» для приматов на требуемом для признания эксперимента валидным количестве животных;
• экспертном решении вопроса о том, на каком из вариантов штамма «Орлов» сосредоточить дальнейшие работы по его внедрению в производство вакцины против краснухи.
итература
1. Анджапаридзе О.Г., Червонскии Г.И. Краснуха. - М.: Медицина, 1975. - 102 с.
2. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологиче-скои обстановке в Российской Федерации в 2001 году». -М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. - 160 с.
3. Госудаственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. СП 3.3.2.561-96. М.: Минздрав России, 1998. - 127 с.
4. Краснуха, синдром врожденной краснухи: Информационный сборник, 2-е изд., доп., Pasteur Merieux Connaught. -М., 1995. - 64 с.
5.
6.
Мешалова В.Н., Жукова Е.А., Степанов А.Н. Прививочные свойства краснушной вакцины из штамма «Орлов»// Острые вирусные инфекции у детей - Сб. трудов НИИЭМ им. Пастера. - Л., 1979. - С. 112-117.
Таточенко В.К. Вакцинация.// Информационный бюллетень. - 1999. - < 1. - с.9.
Galazka A. Rubella in Europe // Epidemiol. Infect., - 1991. -107. - p.43-54
Semerikov V.V., Lavrentyeva I.N., Popov V.E., Fletcher M.A. Rubella in Russian Federation: epidemiological features and control measures to prevent the congenital rubella syndrome// Epidemiol. Infect. 2000, 125, P. 359 - 366.
