CC BY
29
БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
УДК 616.916.2-085.371-036.22-078
ПОСТВАКЦИНАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ КРАСНУХИ ШТАММОМ «ОРЛОВ-Д» В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
И. Н. Лаврентьева, В. В. Семериков, В. З. Агрба, Л. П. Сухобаевская, А. Ю. Антипова
По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 300 000 случаев врожденной краснухи (ВК), 83% из которых приходится на Европу, в том числе на страны СНГ и РФ. По расчетам специалистов, заболеваемость ВК составляет 0,13% от общего числа зарегистрированных случаев, и, по экспертной оценке, за период 2000—2002 гг. число заболеваний врожденной краснухой в России составляло не менее 360 случаев ежегодно, без учета самопроизвольных абортов и мерт-ворождений [4].
Европейское Бюро ВОЗ определяет ликвидацию ВК как одно из приоритетных направлений и выдвинуло перед странами региона задачу снижения заболеваемости ВК к 2010 г. до уровня менее 0,01 случая на 1000 детей, родившихся живыми (целевая программа «Здоровье для всех в ХХ! веке», 1998 г.). Вакцинация — единственный эффективный способ профилактики врожденной краснухи. В большинстве стран Европейского региона, где достигнут высокий уровень охвата населения профилактическими прививками, эта задача успешно решается.
В России до конца 1990-х гг. краснуха оставалась неуправляемой инфекцией в связи с отсутствием отечественной вакцины [1]. Иммунизация против краснухи детей 12— 15 месяцев была введена в календарь профи-
лактических прививок РФ в 1997 г. (приказ Минздрава РФ № 375 от 18.12.1997 г.).
С 2002 г. в соответствии с приказом Минздрава № 229 от 27.06.2001 г. вакцинации против краснухи подлежат дети в возрасте 12 месяцев, 6 лет, а также девочки 13 лет. Снижение показателя заболеваемости краснухой с 396,0 в 2001 г. до 92,6 в 2006 г. на 100 000 населения произошло в основном за счет своевременной вакцинации детей в возрасте 12 месяцев. Уровень охвата профилактическими прививками этой возрастной группы начиная с 2005 г. превышает 95%. В 2006 г. в рамках реализации Национального приоритетного проекта в сфере здравоохранения проведена дополнительная иммунизация против краснухи детей в возрасте 5—7 лет и подростков 14—17 лет; существенно возрос — до 87% — показатель своевременности ревакцинирующей профилактической прививки. Предотвращен очередной эпидемический подъем заболеваемости [6]. В целом эти показатели безусловно свидетельствуют об эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики краснухи как мероприятия.
В настоящее время вакцинопрофилак-тика краснухи в России осуществляется посредством зарубежных вакцин, зарегистрированных на территории РФ в установ-
ленном порядке. Несмотря на успехи, достигнутые в специфической профилактике краснухи, охват прививками всех декретированных контингентов до настоящего времени недостаточен. Так, регламентированный ВОЗ 95%-ный уровень охвата ревакцинирую-щими прививками достигнут в 2006 г. только в 14 субъектах РФ [6]. Такое положение связано с отсутствием отечественной вакцины для профилактики краснухи и достаточно высокой стоимостью зарубежных аналогов. Среди заболевших краснухой наметилась тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе лиц детородного возраста. Поскольку экономическая и социальная значимость последствий краснухи определяется в основном тератогенным воздействием вируса на плод и возможным развитием СВК, данная тенденция свидетельствует о необходимости совершенствования контроля над инфекцией и разработки экономически более доступных отечественных препаратов, не уступающих зарубежным аналогам по критериям специфической безопасности и эффективности.
Такие разработки представляются особенно важными на современном этапе профилактики СВК. Согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ № 673 от 30.10.2007 г. иммунизации против краснухи дополнительно подлежат все дети от 1 года до 17 лет, не болевшие, не привитые ранее или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18—25 лет, не болевшие и не привитые ранее. В условиях фактически массовой иммунизации против краснухи эпидемически значимых возрастных групп населения экономическая составляющая кампании приобретает существенное значение.
Ранее мы сообщали, что в НИИЭМ им. Пастера в течение ряда лет проводятся исследования, связанные с разработкой живой ат-
тенуированной вакцины против краснухи на основе вакцинного штамма «Орлов-В», полученного на первичной культуре клеток почки кролика, и его варианта, штамма «Орлов-Д», адаптированного к более технологичному тканевому субстрату — диплоидной линии клеток человека, «М-22» [7]. Доклиническое изучение, проведенное на базе ГУ НИИМП РАМН [5], показало специфическую безопасность, высокую иммуногенную (титры антител в РТГА 1: 160—1: 1280) и протективную активность обоих штаммов и их пригодность для производств вакцины по ряду других показателей (отсутствие контагиозности и мутагенной активности, безопасность тканевого субстрата). Ограниченное количество животных, использованное на первом этапе доклинического изучения вариантов штамма «Орлов», не позволяло считать все полученные результаты валидными. Далее в специальном исследовании была доказана генетическая стабильность (по гену Е1) варианта исходного штамма «Орлов», адаптированного к диплоидной линии клеток человека на протяжении как минимум пяти пассажей вируса в клетках «М-22» (И. Н. Лаврентьева, В. В. Семериков, А. Ю. Антипова, А. В. Марков). Учитывая, что диплоидные линии клеток человека являются более технологичным тканевым субстратом и рекомендованы экспертами ВОЗ для производства противовирусных вакцин, штамм «Орлов-Д» стал объектом дальнейшего исследования.
Известно, что единственной лабораторной моделью, пригодной для доклинического изучения штаммов вируса краснухи, являются лабораторные приматы, в частности макаки-резусы, у которых можно моделировать инфекционный процесс, вызванный вирусом краснухи, сходный с таковым у человека по следующим показателям: продолжительность инкубационного периода и вирусо-
выделения, наличие вирусемии и динамика формирования иммунного ответа.
Поскольку одним из важнейших критериев пригодности вакцины для профилактики краснухи является ее специфическая активность, настоящее исследование посвящено повторному определению иммуногенной и протективной активности штамма «Орлов-Д» на увеличенном количестве обезьян породы макака-резус. В работе использованы также препараты сравнения — отечественный вакцинный штамм «Орлов-В» и вакцинный штамм М27/3 в составе коммерческой крас-нушной вакцины «Рудивакс» производства Санофи-Пастер (Франция).
Исследование проведено в соответствии с действующим нормативным документом, определяющим порядок доклинического изучения новых медицинских иммунобиологических препаратов [3].
Материалы и методы
Вирусы: штамм вируса краснухи «Орлов-Д» — получен после проведения 39 пассажей в первично трипсинизирован-ной культуре клеток почки кролика + 1 или 5 пассажей в диплоидной культуре клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека, линия «М-22»; вакцинный штамм вируса краснухи М27/3; штамм вируса краснухи «Лебедев» — выделен от ребенка с врожденной краснухой, прошел 3—4 пассажа в перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Лабораторные животные: 35 самцов макака-резус 4—5 лет, масса тела 3—4 кг. Методы: иммуногенность определяли после однократного внутримышечного введения обезьянам 0,5 мл препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 прививочной дозе для человека — не менее 1000 ТЦД50. Титры антител регистрировали в РТГА с 4 ГАЕ антигенного краснушного диаг-ностикума производства ОТН НИИЭМ им.
Пастера, согласно инструкции по применению препарата, через 30 суток, 1 и 4 года после иммунизации.
Протективную активность определяли по устойчивости иммунизированных животных к заражению патогенным штаммом вируса краснухи, заражая животных через 31— 33 дня после иммунизации штаммом вируса краснухи «Лебедев». Заражение проводили трехкратно, интраназально, в дозе, равной 10 000 ЦПД50. Группу контроля составляли неиммунизированные, серонегативные к краснухе животные. Развитие инфекционного процесса определяли по наличию вирусе-мии, которую регистрировали при исследовании сывороток крови подопытных обезьян в ПЦР на разных сроках после заражения патогенным штаммом.
Контагиозность оценивали после 30 суток тесного контакта (нахождение в одной клетке) иммунизированных и неиммунизи-рованных макак, после чего у непривитых животных определяли титр антител к краснухе в РТГА.
Параметры клеточного иммунитета исследовали в тесте розеткообразования эритроцитов барана, меченных монокло-нальными антителами против субпопуляций лимфоцитов: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD22, HLA-DR. Для интерпретации результатов производили пересчет абсолютных показателей CD-АГ в относительные (Оп): Оп = R/N, где N — количество клеток данной субпопуляции до иммунизации, R — количество клеток той же субпопуляции на разных сроках после введения вакцины.
Интерфероновый статус определяли уровнем а- и у-интерферонов титрованием на культуре клеток. За титр цитокинов принимали величину, обратную максимальному разведению препарата, при котором наблюдалась 50%-ная деструкция клеточного монослоя клеток-мишеней.
Полученные результаты
и их обсуждение
Иммуногенную активность штамма «Орлов-Д» выявляли у 23 серонегативных к краснухе макак-резусов, разделенных на три группы. Препарат из штамма «Орлов-Д» получили 12 обезьян, из штамма «Орлов-В» — 4, из штамма М27/3 — 3 животных. Контрольную группу составили три обезьяны, находившиеся в течение периода наблюдения в тесном контакте с животными, иммунизированными препаратом из штамма «Орлов-Д». Результаты представлены в таблице. 1.
Через 30 суток после иммунизации в сыворотках крови обезьян, привитых как штаммом «Орлов-Д», так и препаратами сравнения, отмечали 100%-ную сероконверсию
и регистрировали высокие титры антител — от 1: 160 до 1: 1280, при этом средняя геометрическая во всех трех случаях практически совпадала.
По окончании периода наблюдения в сыворотке крови контактных животных специфические антитела не определялись, что свидетельствует об утрате контагиоз-ности штаммом «Орлов-Д». У части иммунизированных животных удалось определить уровень постакцинальных антител через 1 и 4 года после иммунизации (табл. 2).
Во всех четырех случаях поствакцинальный иммунитет сохранялся в течение периода наблюдения на достаточно высоком уровне, превосходящем защитный титр (1:10—1:20).
Учитывая, что действующий нормативный документ, определяющий порядок
Таблица 1
Титры антител в сыворотке крови обезьян, иммунизированных вакцинными штаммами вируса краснухи
Вводимый материал Количество животных Инфекционная активность препарата Средняя геометрическая титров АТ в обратных величинах/^2
«Орлов-Д» 12 3,5 ^ ТЦД 50/0,5 мл 1: 362/8,57
«Орлов-В» 4 3,3 ^ ТЦД 50/0,5 мл 1: 388/8,49
RA27/3 4 4,Щ ТЦД 50/0,5 мл 1:388/8,57
Контроль 3 Не иммунизировали <1: 10
Таблица 2
Уровень специфических антител у привитых обезьян через 1 и 4 года после иммунизации
(период наблюдения)
№ обезьяны/ № клетки Вводимый материал/ Инфекционная активность Титры антител в РТГА после иммунизации
через 30 суток через 12 месяцев через 4 года
33238/7 «Орлов-В»/3,3 ^ ТЦД 50/0,1 мл 1:320 1 : 640 1: 80
33385/8 «Орлов-В»/3,3 ^ ТЦД 50/0,1 мл 1:160 1: 160 1 : 40
32937/10 «Орлов-Д»/3,5 ^ ТЦД 50/0,5 мл 1 : 640 1 : 1280 1 : 80
33730/11 Rudivax/4,1lg ТЦД 50/0,5 мл 1 : 320 1 : 320 1 : 80
испытаний новых иммунобиологических препаратов [2], предписывает определение иммунного статуса подопытных животных, в следующей части эксперимента изучали влияние иммунизации против краснухи на факторы неспецифической резистентности и формирование клеточного звена иммунитета. Определение уровня а- и у-интерфе-ронов проводили в группе из 7 подопытных и 2 контрольных животных титрованием в культуре клеток биологических образцов, обработанных индукторами цитокинов. Циркулирующий интерферон (8) выявляли непосредственно в сыворотке крови. Спонтанная продукция определялась без добавления индукторов. Уровень интерферонов (ИФН) исследовали до иммунизации, через 14 и 28 суток после. Забор крови у контрольных животных проводили в те же сроки. Через 14 суток после вакцинации у всех иммунизированных животных, включая двух обезьян, получивших препарат сравнения, отмечали непродолжительное 4—8-кратное сниже-
ние уровней а- и у-ИФН. Исходный уровень (64—128 ЕД/мл) восстанавливался к 28-му дню после введения препарата. В контрольной группе колебания уровней а- и у-ИФН были незначительны и не превышали двукратных различий. Стабильные показатели 8-ИФН и спонтанно продуцируемого ИФН (4 ЕД/мл) свидетельствуют об отсутствии стресса у животных в период эксперимента.
Влияние иммунизации на факторы клеточного иммунитета изучали в группе из 9 животных: 5 — привитых штаммом «Ор-лов-Д», 2 — вакциной «Рудивакс», 2 — контрольные, не иммунизированные обезьяны. Количественные характеристики CD-антиге-нов (АГ) определяли до иммунизации, через 7, 14 и 28 суток после ведения препаратов. Результаты представлены в таблице 3. Весьма существенные колебания исходных показателей не позволили провести статистическую обработку результатов. Тем не менее нельзя не отметить, что спустя 7—14 суток после иммунизации у всех привитых живот-
Таблица 3
Показатели клеточного иммунитета у обезьян, иммунизированных вакцинными
штаммами вируса краснухи
№ обезьяны Иммунный статус/Материал для иммунизации
CD-3 CD-4 CD-8 CD-16 СD-19 CD-22 НLA-DR
36 481 — неиммунизированная обезьяна (контроль)
Через 7 с 1,08 1,12 1,15 0,90 0,80 1,00 1,11
Через 14 с 0,94 1,20 1,15 1,06 0,83 1,25 1,22
Через 28 1,21 1,12 1,08 0,93 0,97 0,95 1,11
34 766 — неиммунизированная обезьяна (контроль)
Через 7 с 0,90 0,92 0,87 0,95 1,12 1,20 1,50
Через 14 с 1,03 1,04 1,00 1,10 1,12 1,20 1,00
Через 28 с 1,16 1,12 1,13 1,16 1,25 1,10 1,50
Продолжение
№ обезьяны Иммунный статус/Материал для иммунизации
CD-3 CD-4 CD-8 CD-16 СD-19 CD-22 НLA-DR
34 455 — штамм «Орлов-Д»
Через 7 с 0,55 0,74 0,27 1,75 0,29 3,33 0
Через 14 с 0,86 1,30 1,31 7,50 1,65 10,00 4,00
Через 28 с 0,44 1,26 0,92 6,25 1,70 7,67 6,00
35 108 — штамм «Орлов-Д»
Через 7 c 0,93 1,33 1,22 0,43 1,59 1,11 1,67
Через 14 с 0,74 1,67 0,90 0,90 2,35 1,89 2,00
Через 28 с 0,93 2,2 1,09 0,80 1,76 1,39 1,90
35 095 — штамм «Орлов-Д»
Через 7 с 1,00 1,33 0,73 1,50 7,33 1,89 0,77
Через 14 с 1,33 1,87 0,67 1,75 8,33 1,11 1,69
Через 28 с 1,09 1,60 0,57 1,1 8,33 1,55 1,92
34411 — штамм «Орлов-Д»
Через 7 с 0,87 1,30 0,90 1,67 1,04 5,67 3,0
Через 14 с 1,00 1,11 1,21 1,95 0,96 10,00 5,25
Через 28 с 0,80 1,03 0,76 1,00 0,79 6,00 2,37
36 157 — штамм «Орлов-Д»
Через 7 с 1,00 1,36 1,12 0,80 1,47 1,50 1,23
Через 14 с 1,02 1,07 1,20 2,05 1,16 1,65 0,77
Через 28 с 0,85 1,00 1,08 1,00 1,05 0,90 1,38
34 467 — штамм RA 27/3 (вакцина «Рудивакс»)
Через 7 с 0,90 1,36 4,00 4,00 1,25 2,00 3,33
Через 14 с 0,85 1,18 1,20 3,50 1,67 2,20 4,00
Через 28 с 0,75 1,27 0,90 3,00 1,50 2,00 3,33
34 469 — штамм RA 27/3 (вакцина «Рудивакс»)
Через 7 с 0,75 0,75 3,18 2,08 0,35 1,38 1,00
Через 14 с 1,11 2,20 2,73 3,25 2,55 1,69 5,00
Через 28 с 0,86 1,20 2,00 2,08 — 1,46 6,00
ных, включая обезьян, иммунизированных вакциной «Рудивакс», выявлялась тенденция к активации натуральных киллеров (CD-l6), маркеров В-клеточного звена иммунитета — CD-19, CD-22,— ответственных за выработку специфических антител, и маркеров молекул ГКГ (ШЬЛ-ЭК). Ранжирование животных по исходному уровню СЭ-антигенов показало, что максимальная активация происходит при минимальном исходном количестве клеток данной субпопуляции лимфоцитов.
Что касается Т-клеточного звена иммунитета, то первичная встреча с вирусным антигеном не оказала существенного влияния на уровень Т-лимфоцитов, но привела, по-видимому, к премированию Т-клеток, о чем можно судить по активации молекул ГКГ, принимающих участие в этом процессе [1].
Протективную активность штамма «Ор-лов-Д» исследовали на 10 обезьянах, заражая животных через 31—33 дня после иммунизации патогенным штаммом вируса краснухи «ЛЛС-02». Препаратом сравнения были привиты 2 обезьяны, контрольная группа — 3 макаки. Иммунизация животных как штаммом «Орлов-Д», так и вакциной «Рудивакс» полностью защитила их от проникновения вируса в кровяное русло, тогда как в группе неиммунизированных животных отмечали выраженную вирусемию в период с 7-х по 18-е сутки после заражения.
Выводы
Изучение влияния иммунизации против краснухи препаратом из штамма «Орлов-Д» на формирование факторов специфической и неспецифической защиты в опыте на обезьянах породы макака-резус показало воспроизводимо высокую иммуноген-ную активность исследуемого препарата, не
уступающую иммуногенности препаратов сравнения — штамма «Орлов-В» и коммерческой краснушной вакцины «Рудивакс»; непродолжительное 4—8-кратное снижение уровня а- и у-интерферонов через 14 суток после вакцинации животных, иммунизированных как препаратом из штамма «Ор-лов-Д», так и препаратом сравнения; активацию В-лимфоцитов, ответственных за выработку вирусспецифических антител через 7— 14 суток после вакцинации в обеих группах привитых животных; инициацию (премирование) субпопуляции Т-лимфоцитов при первичной встрече с антигеном, о чем свидетельствует активация маркера молекул ГКГ. Важно, что продолжительность изменений показателей активности факторов неспецифической резистентности и иммуноком-петентных клеток в целом не превышала 28 суток (период наблюдения), после чего уровень а- и у-интерферонов возвращался к исходному, а численные показатели СЭ-антигенов, как правило, не отличались более чем в 1,5 раза от исходных величин и показателей группы плацебо, что соответствует требованиям нормативного документа, регламентирующего порядок доклинических испытаний новых иммунобиологических препаратов [2]. Учитывая генетическую стабильность штамма «Орлов-Д» по отношению к исходному вакцинному штамму, можно рекомендовать указанный штамм вируса краснухи для дальнейших работ по получению и внедрению отечественной вакцины против краснухи.
Библиографический список
1. Бектемиров, Т. А. Мировой опыт иммунопрофилактики краснухи/Т. А. Бектеми-ров//Вакцинация. Новости вакцинопро-
филактики: информационный бюллетень.— 2004.— № 6 (36).— С. 3—4.
2. Галактионов, В. Г. Иммунология/В. Г. Галактионов.— М., 2004.— С. 146—261.
3. Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов: санитарно-эпидемиологические правила. СП 3.3.2.561—96.— М.: Минздрав, 1998.
4. Штаммы вируса краснухи для живой атте-нуированной вакцины/Я. Н. Лаврентьева, Л. П. Сухобаевская, В. З. Агрба и др.//Эпи-демиология и вакцинопрофилактика.— 2003.— № 4.— С. 7—10.
5. Обезьяны макака-резус как модель для доклинического изучения вакцинных штаммов вируса краснухи/Я. Н. Лаврентьева, А. Б. Жебрун, В. З. Агрба, Л. А Яковлева// Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях: материалы Всероссийской науч. конф.— Сочи-Адлер, 2006.— С. 38—42.
6. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2001 году: государственный доклад.— М.: Минздрав, 2002.— 160 с.
7. Онищенко, Г. Г. Актуальные вопросы обеспечения санитарного и эпидемического благополучия населения Российской Федерации/Г. Г. Онищенко//Материалы к докладу Главного государственного санитарного врача Российской Федерации на IX Всероссийском съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.— М., 2007.— 102 с.
I. N. Lavrentyeva, V. V. Semerikov, V. Z. Agrba, L. P. Sukhobaevskaya, A. Yu. Antipova
POSTVACCINAL IMMUNITY IN IMMUNIZATION AGAINST GERMAN
MEASLES WITH «ORLOV-D» STRAIN IN EXPERIMENT
The effect of German measles immunization with «Orlov-D» strain preparation on formation of factors of specific and nonspecific protection was investigated in rhesus macaque experiment. It showed high immunogenic activity of the preparation that does not yield to the preparations of comparison «Orlov-B» strain and «Rudi-vax» vaccine. It also results in short 4—8-fold reduction of a- and y-interferon 14 days after vaccination of animals immunized both with «Orlov-D» and preparations of comparison, activation of B-lymphocytes responsible for development of virus-specific antibodies 7—14 days after vaccination, initiation of T-lymphocyte subpopulations in primary meeting with antigen. Taking into account genetic stability of «Or-lov-D» strain in relation to initial vaccine strain, it can be recommended for future investigation and inculcation of native vaccine against German measles.
Keywords: vaccine, German measles, «Or-lov-D» strain, immunization.
ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора,
г. Санкт-Петербург Управление здравоохранения администрации города Перми, г. Пермь ГУ НИИ МП РАМН, г. Сочи-Адлер
Материал поступил в редакцию 04.08.2008
© Лаврентьева И. Н., Семериков В. В., Агрба В. З.,
Сухобаевская Л. П., Антипова А. Ю., 2008
