CC BY
75
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
5. WHO: Global strategy for containment of antimicrobial resistance. Geneva: WHO; 2001. World Health Organization. (WHO/CDS/CSR/DRS/2001.2) Available at: http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/ /drugresist/en/EGlobal_Strat.pdf (accessed 22.08.15)
6. Novak A, Rubic Z, Dogas V, Goic-Barisic I et al. Antimicrobial susceptibility of clinically isolated anaerobic bacteria in a University Hospital Centre Split, Croatia in 2013. Anaerobe. Elsevier. 2015; 31: 31-36.
7. Toprak Uger N., Sayin E., Dane F, Soyletir G. The first metronidazole-resistant Bacteroides species isolated at Marmara University Hospital: Bacteroides thetaiotaomicron. Mikrobiyol Bul. 2013; 47(4): 717-721.
8. Vasilevsky IV. Some solutions to the problem of antibiotic resistance at the present stage. Medicine (Minsk). 2008; 1: 92-97. Russian (Василевский И.В. Некоторые пути решения проблемы антибиотикорезистентности на современном этапе //Медицина (Минск). 2008. Т. 1. С. 92-97.).
9. Handal N., Jorgensen SB, Tunsjo HS, Johnsen BO, Leegaard TM. Anaerobic blood culture isolates in a Norwegian university hospital: identification by MALDI-TOF MS vs 16S rRNA sequencing and antimicrobial susceptibility profiles. APMIS. Denmark. 2015; 123(9): 749-758.
3?
Статья поступила в редакцию 20.10.2015 г.
Кутихин А.Г., Великанова Е.А., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Владимиров А.А., Созинов С.А., Руссаков Д.М., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Демидов Е.А., Пельтек С.Е., Долганюк В.Ф., Бабич О.О., Фролов А.В., Мухамадияров Р.А., Долгов В.Ю., Григорьев Е.В., Брусина Е.Б., Барбараш О.Л.
НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Институт углехимии и химического материаловедения СО РАН, Кемеровский государственный университет, Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова СО РАН, Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
ІХОДСГВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ наночастиц, ЩЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК,
г) I ВЫ
И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
Предмет исследования. Минерало-органические наночастицы (МОНЧ), представляющие собой самореплицирующиеся кальций-фосфатные частицы < 500 нм в диаметре, состоящие из углерода, азота, кислорода, водорода, кальция и фосфора и содержащие некоторые белки.
Цель - показать сходство или различия между МОНЧ, выделенными из кальцифицированных тканей (естественные МОНЧ), и искусственно синтезированными МОНЧ.
Методы. Выделение МОНЧ из атеросклеротических бляшек, искусственный синтез МОНЧ, декальцификация МОНЧ, электронная и атомно-силовая микроскопия, энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия, рентгеновская диф-рактометрия, инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье, измерение распределения размерности МОНЧ методом динамического рассеяния света, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, окрашивание нитратом серебра, иммуноблоттинг, окраска на нуклеиновые кислоты, флюоресцентная микроскопия, выделение липидов, газовая хроматография-масс-спектрометрия, анализ факторов формирования МОНЧ, анализ саморепликации МОНЧ, статистический анализ.
Результаты. Как естественные, так и искусственные МОНЧ представляют собой сферические частицы губчатой структуры с диаметром 100-500 нм. Оба типа МОНЧ состоят из углерода, кислорода, водорода, кальция и фосфора, которые формируют гидроксиапатит, карбонат-гидроксиапатит и кальцит. Распределение размерности естественных и искусственных МОНЧ также сходно, с разбросом диаметров 100-500 нм и средним диаметром около 200 нм. Естественные и искусственные МОНЧ обладают сходным белковым и липидным профилем и могут адсорбировать нуклеиновые кислоты. Соли кальция и фосфора ускоряют формирование МОНЧ, в то время как сыворотка, альбумин и фетуин-А являются ингибиторами этого процесса.
Область применения. Патофизиология, кардиология.
Заключение. МОНЧ, выделенные из атеросклеротических бляшек, и искусственно синтезированные МОНЧ сходны по морфологии, минеральному и органическому профилю, и законы их формирования соответствуют таковым для каль-ций-фосфатных бионов (КФБ). Поскольку факторы риска развития атеросклероза и факторы, способствующие формированию КФБ в крови человека схожи, это вызывает вопрос о возможной патогенности этих частиц.
Ключевые слова: минерало-органические наночастицы; бионы; патогенность; атеросклероз; кальцификация.
ОК{едицина
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 4 2015
55
СХОДСТВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК, И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
Kutikhin A.G., Velikanova E.A., Glushkova T.V., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Yu.,
Vladimirov A.A., Sozinov S.A., Russakov D.M., Gutakovskiy A.K., Zhivodkov Yu.A., Demidov E.A.,
Peltek S.E., Dolganyuk V.F., Babich O.O., Frolov A.V., Mukhamadiyarov R.A., Dolgov V.Yu.,
Grigoriev E.V., Brusina E.B., Barbarash O.L.
Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases,
Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo State University,
Kemerovo Technological Institute of Food Industry,
Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo
Rzhanov Institute of Semiconductor Physics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences,
Institute of Cytology and Genetics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk MINERALO-ORGANIC NANOPARTICLES ARE SIMILAR WHEN ISOLATED FROM HUMAN ATHEROSCLEROTIC PLAQUES AND ARTIFICIALLY SYNTHESIZED Study subject. Mineralo-organic nanoparticles (MONPs) which are self-propagating calcium phosphate particles < 500 nm in diameter consisting of carbon, nitrogen, oxygen, hydrogen, calcium, and phosphorus and containing certain proteins.
Aim - to demonstrate similarity or differences between the MONPs isolated from the calcified tissues (natural) and artificially synthesized MONPs.
Methods. Isolation of the MONPs from the atherosclerotic plaques, artificial synthesis of the MONPs, decalcification of the MONPs, electron and atomic force microscopy, energy-dispersive X-ray spectroscopy, X-ray diffraction analysis, Fourier transform infrared spectroscopy, dynamic light scattering measurements, sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, silver staining, Western blotting, nucleic acid staining, fluorescent microscopy, lipid extraction, gas chromatography-mass-spectrometry, dual inhibition-seeding assay, self-propagation assay, and statistical analysis.
Results. Both natural and artificial MONPs are 100-500 nm spherical particles with a sponge-like structure, and they consist of carbon, oxygen, hydrogen, calcium, and phosphorus which form hydroxylapatite, carbonate-hydroxylapatite, and calcite. A particle-size distribution of the natural and artificial MONPs is also similar, with a diameter range of 100-500 nm and mean diameter of around 200 nm. Both natural and artificial MONPs have similar proteomic and lipidomic profile and may adsorb nucleic acids. Calcium salts and phosphates enhance the seeding of the MONPs whilst serum, albumin, and fetuin-A are the inhibitors of this process.
Field. Pathophysiology, cardiology.
Conclusions. MONPs isolated from the atherosclerotic plaques and artificially synthesized MONPs have similar morphology, mineral, and organic profile, and the laws of their formation are similar to those for the calcium phosphate bions (CPB). Since the risk factors for atherosclerosis and the factors promoting the formation of the CPB in a human blood are similar, it raises a question about the pathogenicity of these particles.
Key words: mineralo-organic nanoparticles; bions; pathogenicity; atherosclerosis;
calcification.
Минерало-органические наночастицы (МОНЧ, нанобактерии, кальцифицирующиеся наночастицы, частицы, подобные нанобактериям, кальципротеиновые частицы, фетуино-минераль-ные комплексы, наноны, кальций-фосфатные бионы, минерало-окисленные липидные комплексы) были открыты в качестве контаминанта клеточных культур Kajander с соавт. более 25 лет назад, и их результаты были опубликованы несколькими годами позже [1]. Эти образования представляют собой самореплицирующиеся кальций-фосфатные частицы < 500 нм в диаметре и могут быть визуализированы при помощи электронной или атомно-силовой микроскопии как сферические наночастицы, формирующие агрегаты и состоящие из углерода, азота, кислорода, водорода, кальция и фосфора [1]. Также было показано, что они содержат некоторые белки [2].
Природа МОНЧ в течение достаточно долгого времени оставалась неясной. Kajander и Ciftcioglu с со-авт. [1] предположили, что нанобактерии являются наименьшим на Земле автономно реплицирующим-
Корреспонденцию адресовать:
КУТИХИН Антон Геннадьевич,
650025, г. Кемерово, ул. Дарвина, д. 2, кв. 9. Тел.: +7-960-907-70-67.
E-mail: [email protected]
ся микроорганизмом, ответственным за развитие эктопической кальцификации. Однако эта гипотеза была оспорена двумя годами позже Cisar с соавт. [2], которые предположили, что данная биоминерализация может быть инициирована перенасыщением раствора солями кальция и фосфора или фосфатидили-нозитолом. В 2003 году, Heiss с соавт. [3] показали, что антикальцифицирующий белок фетуин-A формирует временно растворимые коллоидные комплексы с кальцием и фосфатами, напоминающие нанобактерии. Аналогичное явление было также замечено Price с соавт. [4], которые идентифицировали и охарактеризовали формирование высокомолекулярного комплекса кальция, фосфатов и фетуина-А в сыворотке крыс, которым вводили этидронат.
В 2008 году Raoult с соавт. [5] убедительно опровергли гипотезу о нанобактериях как живых организмах, и показали ключевую роль фетуина в формировании данных минеральных комплексов, названных ими нанонами, по аналогии с прионами. Другой научной группе из Тайваня (Martel, Young, Wu, Wong с соавт.) [6] удалось успешно синтезировать семейство МОНЧ из различных солей и фосфатов, названное ими бионами. В соответствии с их гипотезой, би-оны представляют собой неживые биомиметические МОНЧ и являются частью физиологического механизма, регулирующего функцию, транспорт и выведе-
I
56
T. 14 № 4 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ние элементов и минералов [6]. Кальций-фосфатные бионы (КФБ) формируются в организме при избытке преципитирующих ионов или безуспешной работе механизма их выведения в биологических жидкостях [6]. Наконец, Kumon с соавт. [7] предположили, что МОНЧ представляют собой минерало-окислен-ные липидные комплексы, формирующиеся как побочный продукт хронического воспаления.
Группа из Тайваня [8] успешно продемонстрировала, что все данные образования сходны между собой при выделении из биологических жидкостей. В то же время, их также выделяли из кальцифицированных тканей, в особенности из артерий и клапанов сердца [9], однако не было попыток сравнить выделенные из них МОНЧ с искусственно синтезированными.
Данное исследование было проведено с целью установить сходство или различия между МОНЧ, выделенными из кальцифицированных тканей, и искусственно синтезированными МОНЧ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение минерало-органических наночастиц из кальцифицированных атеросклеротических бляшек
Исследование было одобрено этическим комитетом НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (Кемерово, Россия), все пациенты подписали протокол информированного согласия на участие в исследовании. Сегменты кальцифицированных атеросклеротических бляшек из аорты, сонной или бедренной артерии были получены в результате хирургического вмешательства. Ткань гомогенизировалась и центрифугировалась при 3,000 х g в течение 10 мин при 4°C (во всех экспериментах для низкоскоростного центрифугирования использовалась 5804R Centrifuge, Eppendorf). Далее надосадок фильтровался через целлюлозно-ацетатный фильтр (Mil-
Сведения об авторах:
КУТИХИН Антон Геннадьевич, мл. науч. сотрудник, лаборатория геномной медицины отдела экспериментальной и клинической кардиологии, ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН, г. Кемерово, Россия. E-mail: [email protected]
ВЕЛИКАНОВА Елена Анатольевна, канд. биол. наук, науч. сотрудник, лаборатория клеточных технологий отдела экспериментальной и клинической кардиологии, ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН,г. Кемерово, Россия.
ГЛУШКОВА Татьяна Владимировна, канд. биол. наук, науч. сотрудник, лаборатория новых биоматериалов отдела экспериментальной и клинической кардиологии, ФГБУ НИИ КПССЗ СО РАМН, г. Кемерово, Россия.
ЕФИМОВА Ольга Сергеевна, канд. хим. наук, науч. сотрудник, лаборатория высокотемпературных углеродных материалов, ФГБУН ИУХМ СО РАН, г. Кемерово, Россия.
ПОПОВА Анна Николаевна, канд. хим. наук, науч. сотрудник, лаборатория неорганических наноматериалов, ФГБУН ИУХМ СО РАН, г. Кемерово, Россия.
МАЛЫШЕВА Валентина Юрьевна, ведущий технолог, лаборатория высокотемпературных углеродных материалов, ФГБУН ИУХМ СО РАН, г. Кемерово, Россия.
ВЛАДИМИРОВ Александр Александрович, ведущий инженер, ФГБУН ИУХМ СО РАН, г. Кемерово, Россия.
СОЗИНОВ Сергей Анатольевич, канд. физ.-мат. наук, директор КемЦКП, ФГБУН ИУХМ СО РАН, г. Кемерово, Россия.
РУССАКОВ Дмитрий Михайлович, зав. лабораторией электронной микроскопии, кафедра экспериментальной физики, ФГБОУ ВПО КемГУ, г. Кемерово, Россия.
ГУТАКОВСКИЙ Антон Константинович, канд. физ.-мат. наук, ведущий науч. сотрудник, лаборатория нанодиагностики и нанолитографии отдела физики и технологии полупроводников пониженной размерности, микро- и наноструктур, ЦКП «Наноструктуры», ФГБУН ИФП СО РАН, г. Новосибирск, Россия.
ЖИВОДКОВ Юрий Алексеевич, ведущий инженер-технолог, лаборатория нанодиагностики и нанолитографии отдела физики и технологии полупроводников пониженной размерности, микро- и наноструктур, ФГБУН ИФП СО РАН, г. Новосибирск, Россия. ДЕМИДОВ Евгений Александрович, ст. лаборант, лаборатория молекулярных биотехнологий отдела молекулярных биотехнологий отделения молекулярной генетики, клеточной биологии и биоинформатики, ФГБНУ ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, Россия.
ПЕЛЬТЕК Сергей Евгеньевич, доктор биол. наук, профессор, зам. директора по научной работе, ФГБНУ ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, Россия.
ДОЛГАНЮК Вячеслав Федорович, канд. техн. наук, мл. науч. сотрудник, НИИ биотехнологии, ФГБОУ ВО КемТИПП, г. Кемерово, Россия.
БАБИЧ Ольга Олеговна, доктор техн. наук, директор, НИИ биотехнологии, ФГБОУ ВО КемТИПП, г. Кемерово, Россия.
ФРОЛОВ Алексей Витальевич, канд. мед. наук, мл. науч. сотрудник, лаборатория нейрососудистой патологии отдела мультифокального атеросклероза, ФГБУ НИИ КПССЗ, г. Кемерово, Россия.
МУХАМАДИЯРОВ Ринат Авхадиевич, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория новых биоматериалов отдела экспериментальной и клинической кардиологии, ФГБУ НИИ КПССЗ, г. Кемерово, Россия.
ДОЛГОВ Виктор Юрьевич, мл. науч. сотрудник, лаборатория новых биоматериалов отдела экспериментальной и клинической кардиологии, ФГБУ НИИ КПССЗ, г. Кемерово, Россия.
ГРИГОРЬЕВ Евгений Валерьевич, доктор мед. наук, профессор, зам. директора по научной и лечебной работе, ФГБУ НИИ КПССЗ, г. Кемерово, Россия.
БРУСИНА Елена Борисовна, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой эпидемиологии, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия.
БАРБАРАШ Ольга Леонидовна, доктор мед. наук, профессор, директор ФГБНУ НИИ КПССЗ, г. Кемерово, Россия.
Ои^шта Medicine
в Кузбассе
T. 14 № 4 2015
57
СХОДСТВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК, И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
lipore) с диаметром пор 0,22 цм. Наконец, 3 мл фильтрата добавлялись во флакон (T-25, Greiner), содержащий 7 мл культуральной среды (DMEM, 10 % фетальной бычьей сыворотки, 1 % раствор L-глута-мина-пенициллина-стрептомицина и 0,4 % раствор амфотерицина B, Gibco).
Все процедуры осуществлялись в стерильных условиях. Все культивирование МОНЧ проводилось при 37°C, 5 % CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo). Длительность культивирования составила 6 недель. Культуральная среда с и без аналогичного количества фосфатно-солевого буфера (ФСБ, 1x, pH 7.4, Gibco), а также чистая DMEM использовались в качестве отрицательного контроля. Чтобы убедиться, что именно перенасыщение раствора солями кальция и фосфора является истинной причиной формирова-
ния МОНЧ, была осуществлена такая же процедура для тканей внутренней грудной артерии. После 6 недель культивирования культуральная среда центрифугировалась при 200,000 х g в течение 1 ч при 4°C (во всех экспериментах для высокоскоростного центрифугирования использовалась Optima MAX-XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter). Осадок растворялся в стерильном ФСБ для экспериментов на клетках и животных или в стерильной ddH2O для изучения физико-химических свойств. Количество МОНЧ в растворе определялось измерением оптической плотности (ОП) на длине волны 650 нм в соответствии со стандартами МакФарланда (0,5, 1 и 2 McF с соответствующими значениями ОП 0,08-0,10; 0,14-0,17 и 0,27-0,31). Во всех экспериментах использовали микропланшетный ридер «Униплан» для измерения ОП.
Information about authors:
KUTIKHIN Anton Gennadievich, MD, Junior Researcher, Laboratory for Genomic Medicine, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia. E-mail: [email protected] VELIKANOVA Elena Anatolievna, PhD, Researcher, Laboratory for Cell Technologies, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
GLUSHKOVA Tatiana Vladimirovna, PhD, Researcher, Laboratory for Novel Biomaterials, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
EFIMOVA Olga Sergeevna, PhD, Researcher, Laboratory for High Temperature Carbon Materials, Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia.
POPOVA Anna Nikolaevna, PhD, Researcher, Laboratory for Inorganic Nanomaterials, Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia.
MALYSHEVA Valentina Yurievna, Leading Technologist, Laboratory for High Temperature Carbon Materials, Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia.
VLADIMIROV Alexandr Alexandrovich, Leading Engineer, Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia.
SOZINOV Sergei Anatolievich, PhD, Director of the Centre for Collective Use, Institute for Coal Chemistry and Material Sciences under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Kemerovo, Russia.
RUSSAKOV Dmitriy Mikhailovich, Head of the Laboratory for Electron Microscopy, Department of Experimental Physics, Physical Faculty, Kemerovo, Russia.
GUTAKOVSKIY Anton Konstantinovich, PhD, Leading Researcher, Laboratory for Nanodiagnostics and Nanolitography, Division of Physics and Technology of Low-Dimensional Semiconductors, Micro- and Nanostructures, Rzhanov Institute of Semiconductor Physics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.
ZHIVODKOV Yuri Alekseevich, Leading Engineer, Laboratory for Nanodiagnostics and Nanolitography, Division of Physics and Technology of Low-Dimensional Semiconductors, Micro- and Nanostructures, Rzhanov Institute of Semiconductor Physics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.
DEMIDOV Evgeniy Alexandrovich, Senior Technician, Laboratory for Molecular Biotechnology, Division of Molecular Biotechnology, Branch of Molecular Genetics, Cell Biology and Bioinformatics, Institute of Cytology and Genetics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.
PELTEK Sergei Evgenievich, PhD, Professor, Deputy CEO for Research, Institute of Cytology and Genetics under the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.
DOLGANYUK Viatcheslav Fedorovich, PhD, Junior Researcher, Research Institute of Biotechnology, Kemerovo Institute of Food Science and Technology, Kemerovo, Russia.
BABICH Olga Olegovna, PhD, CEO, Research Institute of Biotechnology, Kemerovo Institute of Food Science and Technology, Kemerovo, Russia. FROLOV Alexey Vitalievich, MD, PhD, Junior Researcher, Laboratory for Neurovascular Pathology, Division of Polyvascular Disease, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
MUKHAMADIYAROV Rinat Avkhadievich, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Novel Biomaterials, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
DOLGOV Viktor Yurievich, Junior Researcher, Laboratory for Novel Biomaterials, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
GRIGORIEV Evgeniy Valerievich, MD, PhD, Professor, Deputy CEO for Research and Treatment, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
BRUSINA Elena Borisovna, MD, PhD, Professor, Head of the Department of Epidemiology, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia.
BARBARASH Olga Leonidovna, MD, PhD, Professor, CEO, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia.
Г
58
T. 14 № 4 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Искусственный синтез минерало-органических наночастиц
Для искусственного синтеза МОНЧ готовили базовые растворы СаСІ2 (0,45М, Sigma-Aldrich) и Na2HPO4*12H2O (0,2M, Sigma-Aldrich) и далее разбавляли их до равных концентраций в 1 мМ во флаконе с 10 мл культуральной среды, инкубировали при аналогичных, описанных выше условиях, и осуществляли такие же процедуры после 6 недель культивирования.
Декальцификация минерало-органических наночастиц
Для изучения того, существуют ли в природе декальцифицированные МОНЧ, центрифугировали раствор МОНЧ при 200,000 х g в течение 1 ч при 4°C и затем декальцифицировали осадок, используя либо 0,5M дигидрат динатриевой соли ЭДТА (C1QH14N2Na2O8*2H2O, Sigma-Aldrich), перемешиваемый около суток при 4°C, либо 0,5Н HCl (Sigma-Aldrich), перемешиваемую в течение 5 минут с последующей нейтрализацией равным объемом 0,5Н NaOH (Sigma-Aldrich). После декальцификации растворы центрифугировались при 200,000 х g в течение 1 ч при 4°C, забирался надосадок, и предполагаемые декальцифицированные МОНЧ ресуспендировались в стерильной ddH2O. Для некоторых экспериментов не центрифугировали МОНЧ после декальцификации.
Электронная и атомно-силовая микроскопия
Визуализация МОНЧ проводилась методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Для ПЭМ несколько капель раствора МОНЧ помещались на медную сеточку с углеродным напылением (Structure Probe, Inc.), образец окрашивался 2 % раствором уранила-цетата (Electron Microscopy Sciences), и проводилась непосредственно ПЭМ (JEOL JEM-2100). Для СЭМ несколько капель раствора МОНЧ помещались на стекло для микроскопии (Thermo Scientific), высушивались при комнатной температуре (КТ) в течение суток, далее образец помещался на углеродный скотч (Ted Pella) и напылялся Au-Pd (SC7640, Emi-tech), и, наконец, проводилась непосредственно СЭМ (Zeiss CrossBeam 1540 XB, Carl Zeiss). Для АСМ несколько капель раствора МОНЧ помещались на диск из слюды (Ted Pella), и далее проводилась непосредственно АСМ (Cypher™ Atomic Force Microscope, Asylum Research).
Элементный анализ
Для определения химических элементов, составляющих МОНЧ, помещали несколько капель раствора МОНЧ на углеродный скотч, высушивали в течение 2 ч при 37°C, напыляли углеродом (CA7625, Emitech) и проводили элементный анализ методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (XFlash® 4010, Bruker). Для каждого образца определялись три квадранта с четко визуализируемыми
МОНЧ, и затем рассчитывался средний атомный процент для каждого элемента. Все расчеты проводились с поправкой на углерод во избежание систематической ошибки.
Рентгеновская
дифрактометрия
Несколько капель раствора МОНЧ помещались на стекло для микроскопии и высушивались в ламинарном боксе при КТ в течение суток. Спектры были получены с использованием рентгеновского дифрактометра (Bruker D8 ADVANCE, Bruker) с железной рентгеновской трубкой при 40 кВ. Данные собирались по 20 углу от 10 до 100 градусов при скорости в 0,02 градуса в секунду. Полученные спектры сравнивались с базой Объединенного комитета порошковых дифракционных стандартов для идентификации химической формулы соединения.
Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье
Несколько капель раствора МОНЧ использовались как образцы для Фурье-ИКС. Спектры были получены с использованием Фурье-ИК-спектромет-ра (Infralum FT-801, Simex) с разрешением 4 см-1 на длинах волн от 4,000 см-1 до 500 см-1. Каждый спектр представляет собой среднее 25 последовательных сканов.
Динамическое рассеяние света
Кривая распределения размерности МОНЧ в растворе рассчитывалась методом динамического рассеяния света с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Общий объем одного образца составил 1,5 мл, и для этого эксперимента пропускали ddH2O через 0,22-цм целлюлозно-ацетатный фильтр. До измерения образцы инкубировались при 25°C в течение 10 мин. Все измерения проводились трижды с дальнейшим расчетом среднего распределения.
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и окрашивание нитратом серебра
Для ДСН-ПААГ, аликвоты одинакового объема (30 цл) интактного раствора МОНЧ (0,5 McF), белкового экстракта интактного раствора МОНЧ, HCl-и ЭДТА-декальцифицированных МОНЧ были смешаны с буфером Лэммли (1,5 M Tris-HCl pH 6,8, глицерол, p-меркаптоэтанол, ДСН, 1 % бромфеноловый синий, дитиотреитол) в отношении 4:1 и затем загружены на 1,0 мм NuPAGE® Novex® 4-12 % Bis-Tris гель (Life Technologies). Белковый стандарт Precision Plus (Bio-Rad) загружался как маркер. Белки разделялись при помощи ДСН-ПААГ при 100 В в течение 1 ч. Гель окрашивался при помощи набора Sil-verQuest (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Стоп-раствор (39 mM динатриевой соли ЭДТА) добавлялся при появлении полос. Гели фотографировались с использованием сканера HP Scanjet Enterprise Flow (Hewlett Packard).
ОК{вдицина
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 4 2015
59
СХОДСТВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК, И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
Иммуноблоттинг
Для иммуноблоттинга небольшое количество (10 цл) раствора МОНЧ (0,5 McF) смешивалось с буфером Лэммли в отношении 4:1 и загружалось на 1,0 мм NuPAGE® Novex® 4-12 % Bis-Tris гель. Экстракт белков нормальной печени человека использовался как положительный контроль. Белки разделялись ДСН-ПААГ при 100 В в течение 1 ч, перенос осуществлялся при 30 В в течение 1,5 ч при 4°C. Блоттинг проводился с антителами к фетуину-А (ab34505, Abcam) и альбумину (ab9092, Abcam). Конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи или козлиные вторичные антитела (Santa Cruz Biotechnology) использовались с разведением 1 : 500. Белки визуализировались хемилюминесценцией с использованием реагента для детекции Amersham ECL Prime (General Electric Healthcare).
Окраска на нуклеиновые кислоты
Для детекции нуклеиновых кислот МОНЧ проводилась окраска Hoechst 33342. Несколько капель раствора МОНЧ помещались на стекло для микроскопии и высушивались в ламинарном боксе при КТ в течение 30 минут. Затем несколько капель красителя Hoechst 33342 (2 цг/мл, Sigma-Aldrich) помещались на высушенные МОНЧ, и осуществлялась инкубация при КТ в течение 20 мин. Визуализация проводилась посредством флюоресцентной микроскопии [AxioObserver.Z1 Inverted Microscope, Carl Zeiss; Zeiss Filter Set #49 (ex. G 365 нм, FT 395, em. BP 445/50 нм)].
Выделение липидов и газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС)
Липиды выделялись из МОНЧ по методу Фол-ча с использованием традиционного протокола. ГХ-МС проводилась с использованием капиллярной колонки MDN-1 (твердосвязанный метилсиликон, 30 м х 0,25 мм, Sigma-Aldrich) и газового хромато-масс-спек-трометра GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu) в соответствии со следующими параметрами: объем инжектора 1 |iL, температура инжектора 200°C, деление потока 1 : 10, температура интерфейса 210°C, температура детектора 200°C, скорость потока газа-носителя (He) 0,8 мл/мин, температурная программа: 100°С в течение 2 мин, 5°/мин до 120°С, 20°/мин до 260°С, затем 260°С в течение 2 минут. Идентификация масс от 1,5 до 1,900 m/z.
Анализ факторов формирования минерало-органических наночастиц
Для оценки законов формирования МОНЧ инкубировали базовые стерильные растворы CaCl2 и Na2HPO4*12H2O, разбавленные до равных концентраций в 0,2, 0,5, 1, 5 или 10 мМ в 1 мл DMEM с 1, 3, 5, 7, 10, 15 или 20 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Для оценки того, как отношение концентрации солей кальция к концентрации солей фосфора влияет на формирование МОНЧ, инкубировали базовые стерильные растворы CaCl2 и Na2HPO4*12^O,
разбавленные до отношения 4 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 или 1 : 4 мМ в 1 мл DMEM с 1, 3, 5, 7, 10, 15 или 20 % FBS. Инкубация проводилась в 1,66 мл пробирках (Eppendorf) при 4°C или в 24-луночных планшетах (Eppendorf) при 37°C, 5 % CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo). Все измерения проводились в дублях, и средние значения использовались для последующего анализа. Последовательные измерения ОП на длине волны 650 нм проводились сразу после раскапывания, на 1, 3, 7, 14, 28 и 42 день после инкубации.
Анализ саморепликации минерало-органических наночастиц
Для определения способности МОНЧ к саморепликации разбавляли 300 л отфильтрованного гомогената кальцифицированной ткани или базовые стерильные растворы CaCl2 и Na2HPO4*12^O до равных концентраций в 1 мМ в 1 мл культуральной среды. Инкубация проводилась в 1,66 мл пробирках при 4°C или при 37°C, 5 % CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo). Все измерения проводились в дублях, и средние значения использовались для последующего анализа. Оценка способности к саморепликации проводилась последовательными измерениями ОП на длине волны 650 нм сразу после раскапывания, на 1, 3, 7, 14, 28 и 42 день после инкубации.
Статистический анализ
Статистический анализ проводился при помощи программы MedCalc (MedCalc Software). Оценка нормальности распределения оценивалась по критерию д’Агостино-Пирсона. Данные представлялись с помощью медианы, межквартильного расстояния (25 и 75 процентили), среднего и доверительных интервалов (ДИ) для медианы и среднего. В зависимости от типа распределения, две независимые группы сравнивались по U-критерию Манна-Уитни или t-критерию Стьюдента. Значения с P < 0.05 признавались статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Нами было проведено культивирование естественных и искусственных МОНЧ путем добавления экстрактов атеросклеротических бляшек и перенасыщенных растворов CaCl2 и Na2HPO4*12^O, соответственно, в различные флаконы с культуральной средой. Через шесть недель культивирования наблюдалось помутнение среды в этих флаконах (рис. 1A). На дне пробирок с этой средой наблюдался белый осадок (рис. 1Б). Измерение оптической плотности (ОП) подтвердило формирование определенных агрегатов в среде (рис. 1В). В то же время, ничего подобного не наблюдалось во флаконах или пробирках, куда был добавлен экстракт внутренней грудной артерии, а также в емкостях с контрольной средой (Рис. 1A и 1В). Более того, экстракты атеросклеротических бляшек пяти из шестнадцати пациентов не вызывали ни образования преципитатов, ни повышения ОП
60
T. 14 № 4 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рисунок 1 Культивирование МОНЧ
А) Повышенная мутность культуральной среды была обнаружена во флаконах, в которые добавляли экстракты кальцифицированных атеросклеротических бляшек (справа); в то же время среда во флаконах, в которые добавляли экстракты из внутренней грудной артерии, оставалась чистой (слева);
Б) Белый осадок на дне пробирки, заполненной культуральной средой, содержащей экстракт кальцифицированной атеросклеротической бляшки; В) Повышение оптической плотности подтверждает наличие определенных агрегатов в культуральной среде с экстрактами кальцифицированных атеросклеротических бляшек (справа), но не с экстрактами внутренней грудной артерии (слева); Г) Добавление экстрактов атеросклеротических бляшек от пяти из шестнадцати пациентов к культуральной среде не приводило к увеличению оптической плотности (справа); в то же время, оптическая плотность всегда повышалась при добавлении перенасыщенных растворов CaCl2 и Na2HPO4*12H2O (слева).
Figure 1
Culture of the mineralo-organic nanoparticles (MONPs)
a) An increased turbidity of the culture medium could be observed in the flasks where the extracts of the calcified atherosclerotic plaques were added (right); however, the medium in the flasks where the extracts of internal mammary artery were added still remained clear (left);
b) A whitish precipitate could be found at the bottom of the tube filled with the culture medium containing the extract of the calcified atherosclerotic plaque;
c) An increase of the optical density confirms the presence of the certain aggregates in the culture medium with the extracts of the calcified atherosclerotic plaques (right) but not with the extracts of internal mammary artery (left);
d) Addition of the extracts of the atherosclerotic plaques from five out of sixteen patients to the culture medium did not lead to an increase of the optical density (right); however, optical density always increased when we added the supersaturated solutions of CaCl2 and Na2HPO4*12H2O (left).
(рис. 1Г). Электронная и атомно-силовая микроскопия выявила, что данные агрегаты состоят из естественных или искусственных МОНЧ, которые пред-
ставляют собой сферические частицы губчатой структуры с диаметром 100-500 нм (рис. 2), и что оба типа МОНЧ морфологически неотличимы друг от друга.
ОК{вдицина
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 4 2015
61
СХОДСТВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК, И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
Рисунок 2
Морфология естественных и искусственных МОНЧ
А) Просвечивающая электронная микроскопия естественных (сверху) и искусственных (снизу) МОНЧ; Б) Сканирующая электронная микроскопия естественных (сверху) и искусственных (снизу) МОНЧ;
В) Атомно-силовая микроскопия естественных (сверху) и искусственных (снизу) МОНЧ; Г) Трехмерная атомно-силовая микроскопия естественных (сверху) и искусственных (снизу) МОНЧ; Все данные изображения (a-d) подтверждают, что как естественные, так и искусственные МОНЧ представляют собой сферические частицы губчатой структуры диаметром 100-500 нм и морфологически неотличимы друг от друга.
Figure 2
Morphology of the natural and artificial MONPs
a) Transmission electron microscopy images of the natural (top) and artificial (bottom) mineralo-organic NPs;
b) Scanning electron microscopy images of the natural (top) and artificial (bottom) mineralo-organic NPs;
c) Atomic force microscopy images of the natural (top) and artificial (bottom) mineralo-organic NPs;
d) Three-dimensional atomic force microscopy images of the natural (top) and artificial (bottom) mineralo-organic NPs.
All these images (a-d) confirm that both these entities are 100-500 nm spherical particles with a sponge-like structure and are morphologically indistinguishable from each other.
Далее было исследовано, может ли декальцификация обнаружить «внутреннее ядро» МОНЧ. После декальцификации не удалось получить никакого осадка при центрифугировании, визуализировать какие-либо специфические структуры электронной микроскопией, а также выявить белки и специфические липиды электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) и газовой хроматографией-масс-спектрометрией (ГХ-МС) вне зависимости от того, какой реагент был использован для декальцификации [HCl или дигидрат динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)].
С целью сравнения минерального профиля естественных и искусственных МОНЧ были проведены элементный анализ, инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (Фурье-ИКС) и рентгеновская дифрактометрия (РД). Все данные методики показали, что он схожий и как естественные, так и искусственные МОНЧ состоят из углерода, кислорода, водорода, кальция и фосфора, которые формируют гидроксиапатит [Ca^PO^g^H^], карбонат-гидроксиапатит [Ca10(PO^)3(CO3)3(OH)2] и кальцит (СаСОз) (рис. 3A, 3Б, 3В). Метод динамического рас-
сеяния света (ДРС) показал, что распределение размерности естественных и искусственных МОНЧ также сходно, с разбросом диаметров 100-500 нм и средним диаметром около 200 нм (рис. 3Г).
Далее был сравнен органический профиль естественных и искусственных МОНЧ. ДСН-ПААГ и окрашивание нитратом серебра показали, что они обладают сходным белковым профилем с, как минимум, тремя выраженными полосами (немногим более 25 кДа, 50-58 кДа и немногим более 65 кДа), которые могут соответствовать аполипопротеину А, фету-ину-А и альбумину соответственно (рис. 4A). Декальцификация (без последующего центрифугирования) существенно снижала количество белков, однако полоса альбумина все равно была выражена (рис. 4Б). Эти результаты были подтверждены иммуноблоттин-гом для фетуина-А и альбумина (рис. 4В). Как естественные, так и искусственные МОНЧ успешно окрашивались Hoechst 33342 без какой-либо значимой аутофлюоресценции, что указывает на адсорбцию ими двуспиральной ДНК (рис. 4Г). В отношении липидного профиля, определенного ГХ-МС, нам удалось выявить определенные незначительные различия между естественными и искусственными МОНЧ (рис. 4Д).
62
T. 14 № 4 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рисунок 3
Минеральный профиль и распределение размерности естественных и искусственных МОНЧ
А) Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия как естественных (слева), так и искусственных (справа) МОНЧ показывает, что они состоят как минимум из кислорода, кальция и фосфора (углерод убран вследствие поправки на углерод); Б) Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье показывает специфические для фосфатных групп пики (550-600 cm-1) при анализе как естественных (красный), так и искусственных (зеленый) МОНЧ; остальные пики вследствие ddH2O; В) Метод динамического рассеяния света показывает, что как естественные (красный), так и искусственные (зеленый) МОНЧ обладают сходным распределением размерности, с разбросом диаметров 100-500 нм и средним диаметром около 200 нм; Г) Рентгеновская дифрактометрия показывает, что как естественные (серый), так и искусственные (розовый) МОНЧ состоят из гидроксиапатита [Ca10(PO4)6(OH)2], карбонат-гидроксиапатита [Ca10(PO4)3(CO3)3(OH)2] и кальцита (CaCO3);
пики корунда присутствуют вследствие подложки, на которой были высушены МОНЧ.
Figure 3
Mineral pattern and particle-size distribution of the natural and artificial MONPs
a) Energy-dispersive X-ray spectroscopy of natural (left) and artificial (right) mineralo-organic NPs shows that they both consist at least of oxygen, calcium, and phosphorus (carbon cannot be seen here due to a carbon correction);
b) Fourier transform infrared spectroscopy reveals the similar peaks specific for the phosphate groups (550-600 cm-1) in both natural (red) and artificial (green) mineralo-organic NPs; other peaks are due to ddH2O;
c) Dynamic light scattering measurements demonstrates that both natural (red) and artificial (green) mineralo-organic NPs have a similar particle-size distribution curve, with a diameter range of 100-500 nm and mean diameter of around 200 nm;
d) X-ray diffraction analysis identifies that both natural (gray) and artificial (pink) mineralo-organic NPs are composed of hydroxylapatite [Ca10(PO4)6(OH)2], carbonate-hydroxylapatite [Ca10(PO4)3(CO3)3(OH)2], and calcite (CaCO3);
corundum peaks are due to the plate where the NPs were dried.
ОК{вдицина
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 4 2015
63
СХОДСТВО МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК, И ИСКУССТВЕННО СИНТЕЗИРОВАННЫХ МИНЕРАЛО-ОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ
Рисунок 4
Органический профиль естественных и искусственных МОНЧ
А) Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и окрашивание нитратом серебра показали, что как естественные (слева), так и искусственные (справа) МОНЧ обладают схожим белковым профилем с как минимум тремя выраженными полосами немногим более 25 кДа, 50-58 кДа и немногим более 65 кДа), которые могут соответствовать аполипопротеину А, фетуину-А и альбумину соответственно; Б) Декальцификация (без последующего центрифугирования) значительно снижает количество белков
как в естественных (слева), так и в искусственных (справа) МОНЧ; В) Иммуноблоттинг подтвердил, что как естественные (слева), так и искусственные (справа) МОНЧ
содержат фетуин-А (сверху) и альбумин (снизу); Г) Окрашивание Hoechst 33342 обнаружило двуспиральную ДНК, адсорбированную как к естественным (сверху), так и к искусственным (снизу) МОНЧ, без какой-либо значительной аутофлюоресценции; Д) Газовая хроматография-масс-спектрометрия выявила единичные остаточные липиды в естественных (сверху), но не в искусственных (снизу) МОНЧ.
Figure 4
Organic pattern of the natural and artificial MONPs
a) Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining show that both natural (left) and artificial (right) mineralo-organic NPs have a similar proteomic profile with at least three prominent bands of slightly more than 25 kDa, 50-58 kDa, and slightly more than 65 kDa which may correspond to apolipoprotein A, fetuin-A, and albumin, respectively;
b) Decalcification (without further centrifugation) significantly reduces the number of proteins
in both natural (left) and artificial (right) mineralo-organic NPs;
c) Western blotting confirms that both natural (left) and artificial (right) mineralo-organic NPs
contain fetuin A (top) and albumin (bottom);
d) Hoechst 33342 staining reveals double-stranded DNA adsorbed to both natural (top) and artificial (bottom) mineralo-organic NPs, without any significant autofluorescence;
e) Gas chromatography-mass spectrometry identifies a few residual lipids in natural (top)
but not in artificial (bottom) mineralo-organic NPs.
С целью определения условий, определяющих формирование МОНЧ, повторили анализ, разработанный группой из Тайваня [6, 8]. Повышение концентрации солей кальция и фосфора существенно ускоряло этот процесс, независимо от концентрации фетальной бы-
чьей сыворотки (ФБС), и можно было наблюдать значительный сдвиг ОП в растворе с 10 mM концентрацией солей кальция и фосфора, как в условиях культивирования клеток, так и при 4°C. Аналогично, снижение концентрации ФБС также ускоряло
64
T. 14 № 4 2015 MediciinnLass
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
формирование МОНЧ, независимо от концентрации солей кальция и фосфора, и это было особенно заметно при 1 % концентрации ФБС, как в условиях культивирования клеток, так и при 4°C. Отношение концентрации солей кальция к концентрации фосфатов не оказывало существенного влияния на формирование МОНЧ, независимо от концентрации ФБС. Температура также не являлась решающим фактором в этом процессе. Кроме того, нам удалось показать способность как естественных, так и искусственных МОНЧ к саморепликации.
Все наши эксперименты показали, что естественные и искусственные МОНЧ сходны друг с другом, и законы их формирования соответствуют таковым для кальций-фосфатных бионов (КФБ).
ОБСУЖДЕНИЕ
Насколько нам известно, мы впервые сравнили МОНЧ, выделенные из кальцифицированных тканей, с искусственными МОНЧ. Ранее было показано, что МОНЧ, выделенные из ФБС, сходны с выделенными из сыворотки здоровых субъектов [8]. Мы показали, что МОНЧ, выделенные из кальцифицированных тканей, и искусственные МОНЧ морфологически и химически подобны. Хотя мы обнаружили определенные незначительные различия в липидном профиле, вероятно, что они вызваны остаточными липидами из экстракта атеросклеротической бляшки, поскольку при анализе искусственных МОНЧ липидных пиков выявлено не было. Кроме того, данный липидный профиль показывает, что эти остаточные липиды не играют серьезной биологической роли и едва ли могут вызывать существенные различия между естественными и искусственными МОНЧ.
Благодаря данным результатам мы можем уверенно сказать, что все МОНЧ аналогичны друг другу по морфологии, минеральному и органическому профилю, независимо от источника, из которого они были выделены. Это значительно облегчает функциональные эксперименты, поскольку возможно использовать искусственные МОНЧ, не требующие образцов тканей для выделения. В отдельных случаях, когда проблемно синтезировать искусственные МОНЧ, возможно их культивирование из экстрактов кальцифицированных тканей. Тем не менее, это было невозможно в случае с пятью из шестнадцати пациентов и с экстрактами внутренней грудной артерии, которая практически никогда не поражается атеросклерозом (известны лишь единичные случаи) [10]. Поэтому мы предположили, что именно перенасыщенный солями кальция и фосфора раствор привел к формированию МОНЧ. Более того, это показывает, что эти потенциально патогенные частицы могут образовываться в биологических жидкостях человека (кровь, моча) в результате их перенасыщения солями кальция и фосфора.
Мы подтвердили гипотезу Тайваньской группы [6, 8] о том, соли кальция и фосфора ускоряют формирование МОНЧ, в то время как сыворотка, альбумин и фетуин-А являются ингибиторами этого про-
цесса. Мы не проводили такой анализ для альбумина и фетуина-А по отдельности, поскольку в любом случае проблематично проверить все сывороточные белки на их антикальцифицирующую функцию. В то же время, основываясь на наших результатах и предыдущих исследованиях, мы предполагаем, что именно антикальцифицирующие белки (альбумин, фетуин-А) ответственны за ингибиторный эффект сыворотки на формирование МОНЧ [6, 8]. Таким образом, именно отношение концентрации солей кальция и фосфора к концентрации сыворотки определяет формирование данных частиц. Другими словами, именно гиперкальциемия и гиперфосфатемия запускают этот процесс. Мы попытались определить, что играет здесь главную роль — соли кальция или соли фосфора, однако их отношение не оказывало существенного влияния на формирование МОНЧ, независимо от концентрации сыворотки.
Кроме того, наши эксперименты подтвердили способность как естественных, так и искусственных МОНЧ к саморепликации. Можно предположить, что измерение ОП не является адекватным методом для определения саморепликации, поскольку оно не позволяет отличить истинную саморепликацию от простой преципитации. Тем не менее, ранее методами инвертированной световой микроскопии и покадровой обработки изображений было показано, что МОНЧ способны к саморепликации в течение, как минимум, первых пяти дней культивирования и, возможно, еще, как минимум, 20 дней [11]. Тем не менее, саморепликация МОНЧ в любом случае ограничена их минимальным размером, и едва определяет их возможные патогенные эффекты.
Все свойства МОНЧ, которые нам удалось оценить, аналогичны тем, что были выявлены Wu, Young и соавт. [6, 8]. Стоит отметить, что ничего не удалось обнаружить при попытке осадить предполагаемые декальцифицированные МОНЧ. На основании этих результатов можно сделать вывод, что данные наночастицы являются не «кальцифицирующимися», как это было предположено раньше [12], а «кальцийфосфатными», или, чтобы быть более точными, КФБ.
Стоит отметить, что результаты клинических исследований показывают, что повышенный уровень кальция и фосфора в сыворотке ассоциирован с атеросклерозом и его клиническими проявлениями, такими как ишемическая болезнь сердца (ИБС), цереброваскулярные события и заболевания периферических артерий [13]. Кроме того, он коррелирует с развитием кальцификации клапанов сердца [14]. Клинические исследования [15] также показали, что сниженный уровень фетуина-А и альбумина в сыворотке ассоциирован с развитием ИБС и кальцификации клапанов сердца. Таким образом, повышенный уровень кальция и фосфора и сниженный уровень антикальцифицирующих белков в сыворотке является фактором риска развития атеросклероза и кальцификации клапанов сердца. Другими словами, факторы риска развития атеросклероза и кальцификации клапанов сердца аналогичны тем, что способствуют формированию КФБ в крови. Это указывает на их возмож-
ОК{вдицина
в Кузбассе
Medicine
in Kuzbass
T. 14 № 4 2015
65
ОБЗОРЫ НАУЧНОЙ литературы
ную патогенность и роль в сердечно-сосудистой кальцификации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
МОНЧ, выделенные из кальцифицированных атеросклеротических бляшек, и искусственные МОНЧ морфологически и химически сходны друг с другом. Они представляют собой сферические частицы губ-
чатой структуры 100-500 нм в диаметре и состоят из гидроксиапатита, карбонат-гидроксиапатита, кальцита и белков. Все их свойства и законы формирования соответствуют таковым для кальций-фосфатных бионов (КФБ), поэтому МОНЧ могут рассматриваться как КФБ. Аналогичность факторов риска развития атеросклероза и факторов, способствующих формированию КФБ в крови человека, указывает на возможную патогенность этих частиц.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES:___________________________________________________________________________________________
1. Kajander EO, Ciftcioglu N. Nanobacteria: an alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1998; 95(14): 8274-8279.
2. Cisar JO, Xu DQ, Thompson J, Swaim W, Hu L, Kopecko DJ. An alternative interpretation of nanobacteria-induced biomineralization. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2000; 97(21): 11511-11515.
3. Heiss A, DuChesne A, Denecke B, Grotzinger J, Yamamoto K, Renne T et al. Structural basis of calcification inhibition by alpha 2-HS glycoprotein/fe-tuin-A. Formation of colloidal calciprotein particles. J Biol Chem. 2003; 278(15): 13333-13341.
4. Price PA, Thomas GR, Pardini AW, Figueira WF, Caputo JM, Williamson MK. Discovery of a high molecular weight complex of calcium, phosphate, fe-tuin, and matrix gamma-carboxyglutamic acid protein in the serum of etidronate-treated rats. J Biol Chem. 2002; 277(6): 3 926-3934.
5. Raoult D, Drancourt M, Azza S, Nappez C, Guieu R, Rolain JM et al. Nanobacteria are mineralo fetuin complexes. PLoS Pathog. 2008; 4(2): e41.
6. Wu CY, Young L, Young D, Martel J, Young JD. Bions: a family of biomimetic mineralo-organic complexes derived from biological fluids. PloS One. 2013; 8(9): e75501.
7. Kumon H, Matsuura E, Nagaoka N, Yamamoto T, Uehara S, Araki M et al. Ectopic calcification: importance of common nanoparticle scaffolds containing oxidized acidic lipids. Nanomedicine. 2014; 10(2): 441-450.
8. Young JD, Martel J, Young D, Young A, Hung CM, Young L et al. Characterization of granulations of calcium and apatite in serum as pleomorphic mi-neralo-protein complexes and as precursors of putative nanobacteria. PloS One. 2009; 4(5): e5421.
9. Bertazzo S, Gentleman E, Cloyd KL, Chester AH, Yacoub MH, Stevens MM. Nano-analytical electron microscopy reveals fundamental insights into human cardiovascular tissue calcification. Nat Mater. 2013; 12(6): 576-583.
10. Otsuka F, Yahagi K, Sakakura K, Virmani R. Why is the mammary artery so special and what protects it from atherosclerosis? Ann Cardiothorac Surg. 2013; 2(4): 519-526.
11. Mathew G, Mckay DS, Ciftcioglu N. Do blood-borne calcifying nanoparticles self-propagate? Int J Nanomedicine. 2008; 3(2): 265-275.
12. Kajander EO. Nanobacteria-propagating calcifying nanoparticles. Lett Appl Microbiol. 2006; 42(6): 549-552.
13. Foley RN, Collins AJ, Ishani A, Kalra PA. Calcium-phosphate levels and cardiovascular disease in community-dwelling adults: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Am Heart J. 2008; 156(3): 556-563.
14. Linefsky JP, O'Brien KD, Katz R, de Boer IH, Barasch E, Jenny NS et al. Association of serum phosphate levels with aortic valve sclerosis and annular calcification: the cardiovascular health study. J Am Coll Cardiol. 2011; 58(3): 291-297.
15. Sun ZL, Xie QY, Guo GL, Ma K, Huang YY. Serum fetuin-A levels in patients with cardiovascular disease: a meta-analysis. Biomed Res Int. 2014; 2014: 691540.
a
Статья поступила в редакцию 18.10.2015 г.
Печеник А.С., Шмакова М.А., Шатаев Г.Н., Перец О.В., Пекарская Е.В., Бобонец А.В., Турегалиев К.В.
Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ вакцинации против гриппа ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Предмет исследования. Научные публикации.
Цель исследования - получить информацию с более высоким уровнем доказательности об эффективности вакцинации против гриппа, как превентивной меры сердечно-сосудистых заболеваний, обосновать направление стратегии профилактики.
Материалы и методы. Проведен систематический обзор и мета-анализ научных публикаций, собранных в электронных архивах и различных базах данных: PubMed database, the Cochrane database of systematic reviews, Embase, clinical-
66
T. 14 № 4 2015 MedicLn,L»
