CC BY
58
СХЕМОТЕХНИКА СПЕКТРОРЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ
И.А. Виноградов, Д.В. Шпаков, А.В. Мамцев Научный руководитель - д.т.н., профессор Р.К. Мамедов
Настоящая статья посвящена проблемам диагностики и зондирования биологических тканей в состоянии in vivo методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Для практической реализации метода произведен расчет элемента НПВО и предложена оптическая схема установки.
Введение
Прогресс в современной медицине невозможен без создания медицинских технологий, использующих новейшие результаты фундаментальных исследований в пограничных областях физики, химии и биологии. Достижения последних лет, полученные на стыке этих наук, создают мощный потенциал для развития медицинской техники. В результате этого процесса не только усовершенствуются или становятся более дешевыми и, следовательно, более доступными для массового применения традиционные технологии и оборудование, но и возникают принципиально новые методы медицинской диагностики и зондирования.
Исследование биотканей и биожидкостей является наиважнейшей областью медицинской практики. На основе полученных данных можно разработать методики, которые позволят идентифицировать заболевания и паталогии для постановки точного диагноза.
Применение метода НПВО для исследования биотканей
Современная наука предоставляет огромный выбор средств и методов исследования биологических тканей, и у каждого есть свои неоспоримые достоинства и недостатки. Практика показала, что для получения информации о составе и структуре ткани максимально эффективными являются спектральные методы исследования и, в частности, методы ИК-спектроскопии пропускания, диффузного отражения и метод НПВО.
Положение полос поглощения в ИК-области совпадает с частотами собственных или нормальных колебаний молекул. Специфичность ИК-спектров, определяющая перспективность их использования для анализа биологических тканей состоит в том, что поглощение излучения зависит не только от всей молекулы в целом, но и от наличия в ней определенных групп атомов и даже отдельных связей между ними [1].
Для исследования биотканей в состоянии in vivo наиболее целесообразно использовать методы НПВО, позволяющие получать спектрорефрактометрическую информацию об оптических постоянных сильнопоглощающих веществ без предварительной подготовки. Выбор аналитического метода осуществлялся исходя из специфики строения объектов биологического происхождения и их оптических свойств. Основными критериями, определящими выбор, являлись возможность его использования для исследования сильно неоднородных дисперсных объектов, обладающих поглощением а2(и) = 0,05 —1,0. Рабочий спектральный диапазон - средняя ИК-область, где аналитические полосы поглощения компонентов являются наиболее интенсивными. Кроме того, для этой области спектра хорошо известны полосы поглощения, которые могут быть свойственны компонентам биологического происхождения.
Суть метода состоит в том, что луч света падает из оптически более плотной прозрачной среды в исследуемом диапазоне в оптически менее плотную поглощающую среду под уголом больше критического [2].
/7/
я
у" о. /\ ^ \ /
Рис. 1. Схема реализации метода НПВО
При этом поток излучения проникает на глубину ёр в исследуемую поглощающую среду с комплексным показателем преломления
«2 = «2(1 - /а), (1)
где а - коэффициент поглощения менее плотной среды. Среду п1 принято называть элементом НПВО. Глубина проникновения света в оптически менее плотную среду определяется как расстояние от границы раздела, на которую амплитуда электрических колебаний световой волны уменьшается в е раз.
аР =
2фт2 0 - п221)1/2
(2)
Для фиксированного угла падения глубина проникновения ёр тем больше, чем ближе значение показателей преломления сред[3].
Отражение света в условиях НПВО с учетом поглощения описывается формулами Френеля, из которых по соответствующим программам рассчитываются значение оптических постоянных - дисперсия показателя преломления п(Х) и поглощения а(^) :
2
Де =
ЯР =
—2 2 2 1/2 п1ео8 0 - («2 - п1 Бт 0)
2^>ч1/2
п1ео8 0 + («2 - п1 Бт 0)
—2 О —2 О О 1 /О
п2 соб 0 - « («2 - п1 0)
—2 о —2 о о 1 /о
п2 соб 0 + п1 (п2 - п1 Бт 0)
(3)
(4)
В предложенной нами схеме, основанной на методе спектроскопии НПВО, элемент МНПВО предлагается выполнить в виде оптической иглы, которая при исследовании проникает в биологические ткани. Данная игла обладает следующими основными характеристиками: оптимальное число отражений, угол падения светового потока на границу раздела, размер элемента и его форма.
Оптическая игла является основной частью приставки, которая должна функционировать в составе серийного Фурье спектрофотометра RS-88. Оптическая схема приведена на рис. 2. Приставка помещается в кюветную камеру и должна согласовываться с оптической схемой прибора и обеспечивать прямое преобразование светового потока до встречи с объектом исследования и обратное преобразование - восстановление геометрической структуры пучка света.
С целью реализации наилучшей чувствительности спектроскопических измерений методом НПВО в первую очередь необходимо осуществить расчет геометрических параметров элемента МНПВО, обеспечивающего оптимальное число отражений. Для решения поставленной задачи необходимо знать состав объектов исследования, их химическое
2
строение и физические свойства. Основными составляющими биотканей являются: белки, жиры и влага, ИК-спектры которых изучены достаточно подробно.
Рис. 2. Оптическая схема спектрофотометра РБ-88: 1 - образец; 2 - приемный блок;
3 - подвижное зеркало; 4 - светоделитель; 5-8 - неподвижные зеркала; 9 - кюветная
камера; 10 - источник излучения
Свободная молекула воды имеет три основных частоты колебаний, из которых только две активны в ИК-спектре. Спектр поглощения жидкой воды состоит из размытых и линейных структур полос. Спектры ИК поглощения жира, представляющего собой сложные эфиры глицерина и жирных кислот, получают, предварительно экстрагируя его из тканей. Спектральные свойства белков определяются, в основном, наличием пептидной группы [4]. Полосы поглощения при колебании атомов этой группы являются наиболее сильными и характерными для ИК-спектра любого белка, и имеют примерно одинаковое поглощение и интенсивность. Они и определяют внешний вид ИК-спектра.
Частота полос для отдельных компонентов и, в значительной степени, их интенсивность практически нечувствительны к одновременному присутствию в образце других компонентов и инородных образований. Это позволяет проводить исследование биологических тканей на основе содержания в них влаги, жира и белка в исходной форме, измеряя оптическую плотность в различных участках спектра отражения или пропускания [4].
Поскольку в литературе отсутствуют необходимые для такого расчета данные по значениям оптических постоянных п^) и а2 (и) составных компонентов биоматериалов (за исключением ОП воды), был произведен подбор соответствующих им аналогов, которые будут использованы для выполнения расчетов оптимального числа отражений. Подобранные аналоги приведены в табл. 1. В качестве таких аналогов были выбраны полиамид ПА-6 как аналог белка и легкая нефть как аналог жира. Правомерность такого подхода, в принятом приближении, обусловлена характеристическими полосами поглощения белка: 3300 см-1, 1640 см-1 и 1540 см-1, связанные с колебаниями пептидной группы. Полосы поглощения колебаний атомов этой группы являются характерными для ИК-спектра любого белка и имеют близкое положение спектральных полос и интенсивность [5].
Оптические постоянные воды при ^ = 25°С в полосах поглощения 3400 см-1 и 1640 см-1, ПА-6 и легкой нефти, использованные при последующих расчетах, были взяты из справочника [4]. Как видно, ИК-спектры основных компонентов биотканей имеют неперекрывающиеся характеристические полосы поглощения. Таким образом, инфракрасные спектры в средней ИК-области могут дать богатую информацию о компонентном составе объектов биологического происхождения.
5,
\
7
6
Объект Аналог Полосы поглощения Характерные химические группы
Белок полиамид ПА-6 3300 см-1 1540 см-1 пептидная
Жир легкая нефть 2930 см-1 1460 см-1 глицирин, жирные кислоты
Влага вода при 25°С 3400 см-1 1640 см-1 водородная
Таблица 1. Компоненты биотканей и их аналоги
Так как аналитические полосы подобранных аналогов лежат в диапазоне 30001500 см-1, то одним из основных требований, предъявляемым к материалу для изготовления элемента МНПВО, является достаточно высокое пропускание и отсутствие собственных полос поглощения в указанном интервале частот. Необходимость стерилизации элемента от остатков биотканей предполагает также высокую химическую стойкость материала к воздействию кислот и щелочей.
Так как биологические ткани в состоянии in vivo представляют из себя толстые пленки, то показатель преломления элемента МНПВО должен по возможности выбираться так, чтобы исключить при данном угле падения искажение спектров. Таким образом, элемент МНПВО должен иметь минимально возможный показатель преломления, что обеспечит повышенное пропускание за счет снижения потерь вследствие отражений от входной и выходной граней, возможность получить неискаженный спектр и усиленное поглощение [6].
Название материала Хим. состав n(X, мкм) Рабочий диа-позон, мкм т,% в слое 10 мм Химическая устойчивость
Германий Ge 4,02(4,25) 2,0-12 47,2 Не растворим в воде, соляной, серной кислотах и в щелочах.
КРС-5 (броми-диодид таллия) 42%TlBr 58% TlI 2,38(4,25) 0,9-40 71 Не реагирует с ацетоном и пиридом, растворим в этиловом спирте, кислотах и воде.
КРС-6 (таллий йод, таллий бром) 40%TlBr 60% TlI 2,2(2,8) 0,4-25 75,5 Нерастворим в воде, реагирует с этиловым спир-том,кислотами.
Селенит Цинка (Иртран-4) ZnSe 2,4(10) 2,0-16 78 Не реагирует с щелочами, водой и кислотами.
Алмаз С 2,4(10) 0,4-100 65 Не растворим.
Таблица 2. Традиционные материалы для изготовления элемента МНПВО
При выборе материала для изготовления элемента МНПВО был произведен анализ всей совокупности определяющих факторов, который позволил выявить достаточно широкий круг оптических материалов, перспективных для использования при решении данной задачи. В табл. 2 представлены элементы, которые традиционно используют для изготовления элементов МНПВО. Исходя из того, что максимальный показатель преломления предполагаемого исследуемого образца П2 тах = 1,803, а также с учетом
выше перечисленных требований к материалу объекта, максимально приемлемый элемент МНПВО должен быть выполнен из стекла марок КРС-5 и КРС-6, но, к сожалению, эти стекла довольно токсичны, особенно при шлифовке и полировке. Следовательно, предлагается использовать Иртран-4, который имеет аналогичный показатель преломления и близкую спектральную область прозрачности.
При расчете элемента МНПВО необходимо определить величину рабочего угла, для чего необходимо вычислить величины критических углов для каждого из компонентов биологической ткани по предложенной ниже формуле:
Окр = агс^п—. (5)
п1
где п2 - показатель преломления объекта исследования, П] - показатель преломления материала элемента МНПВО. Результаты расчетов сведены в табл. 3:
Материал п2.тахМ Окр, иРад
Полиамид (ПА-6) 1,803 1,628 42,71 48,69
Легкая нефть 1,517 1,476 39,20 37,95
Вода 1,488 1,355 38,31 34,37
Таблица 3. Оптические характеристики аналогов
Как видно из табл. 3, наибольшее значение критического угла Окр тах составляет
приблизительно 49°. При применении спектроскопии НПВО в качестве аналитического метода выполняется простое правило, позволяющее устранить деформации и сдвиги, обусловленные дисперсией показателя преломления - измерения всегда проводят при угле падения выше критического [2]. Величину рабочего угла выбирают из условия: О = ОкР тах + 3 ^ 5° . Таким образом, О = 53° .
Основной характеристикой элемента МНПВО является отимальное число отражений, которое определяется показателем преломления и поглощения, данные о которых берутся у аналогов. По полученным данным с использованием программых продуктов и формул Френеля (3) и (4) вычисляются энергетические коэффициенты отражения аналогов в двух плоскостях поляризации, представленные на рис. 3.
Для обеспечения линейной (или близкой к ней) зависимости необходимо,
чтобы оптимальное значение коэффициента отражения в каждом из спектров удовлетворяло условию:
Р (V)^опт < 0 5
Аопп (У) - °,5 (6)
где N - реализуемое число отражений. Из формулы следует, что добиться выполнения этого условия можно, лишь варьируя числом отражений N.
Рис. 3. Спектры НПВО биологических тканей: 1 - энергетическое отражение воды; 2 - энергетическое отражение нефти; 3 - энергетическое отражение полиамида
В табл. 4. представлены расчеты значения оптимального числа отражений для каждого из спектров и соответствующие им коэффициенты отражения, полученные с учетом условия оптимального фотометрирования.
Материал JлNопт КЕ N опт
полиамид (ПА-6) 0,2308 0,3999 1 2
легкая нефть 0,4883 0,4361 6 4
вода 0,4827 0,3192 3 2
Таблица 4. Оптимальное число отражений для каждого компонента
Из табл. 4 берем N = 6, что обеспечивает достаточную контрастность спектров НПВО. Эта величина при фиксированном угле падения будет определять отношение
длины элемента МНПВО к его толщине :
N = 2(0). (7)
где N - число отражений, / - длина элемента МНПВО, I - толщина элемента, 0 - угол падения на рабочую грань. Так как луч проходит границу сред по нормали, то угол скоса торцевой грани элемента МНПВО будет равен расчетному углу падения на широкую грань элемента МНПВО, т.е. 53°.
Работа элемента МНПВО зависит от трех факторов: качества исходного материала, полировки поверхности и соблюдения геометрических размеров. Строгие требования к соблюдению линейных размеров объясняются следующим. Отношение выбирается так, чтобы центральный луч проходил через середину входной и выходной граней. При несоблюдении этого условия, т.е. при наличии А/ и на выходе из пла-
стины может наблюдаться разделение светового потока на два отстоящих друг от друга пучка. Световой поток должен быть сфокусирован на входную грань либо падать на нее параллельным пучком [3].
Конструкция приставки МНПВО требует применение элемента двойного прохождения. Исходя из условий применения элемента МНПВО и конструктивных соображений, его параметры выбираются на основе формул (8) и (9):
* = ^ (О), (8)
N
1_
Б
■ < ■
в1п О
Б1П
V п1 У
(9)
где величина определяет возможное отклонение лучей. Таким образом, длина и толщина элемента МНПВО составила соответственно I = 10,1 мм и * = 2,12 мм
Вид Б
Вид А
мти
Рис. 4. Схема проектируемого узла МНПО: 1 - элемент МНПВО;
2 - рабочая поверхность; 3 - световод из Иртрана-4; 4 - оболочка блока
Конструктивно макет приставки выполнен на общем основании, на котором неподвижно закреплены узлы. Для преобразования светового потока спектрофотометра и введения его в световод используется сферическое зеркало, которое отклоняет поток на 90о и в горизонтальной плоскости формирует требуемое пятно рассеяния. Для обеспечения подвижности оптической иглы световой поток передается в нее с помощью световода, выполненного из материалов, прозрачных в данной области спектра. Для обеспечения съемности иглы предусмотрена конструкция, напоминающая соединение шприц-игла. Для возвращения потока в канал спектрофотометра разработана схема, зеркальная к задающей части.
Моделирование в програмной среде Земакс показало, что распространение света внутри элемента МНПВО происходит в соответствии с расчетом. Светопропускание системы составило, в среднем по всему диапазону - 23%, что вполне достаточно для проведения данного исследования.
Юстировка системы осуществляется непосредственно в кюветной камере с помощью встроенного в спектрофотометре лазерного излучателя.
Необходимые размеры элемента МНПВО должны быть выдержаны с высокой точностью. Даже небольшие отклонения от допусков могут привести к попаданию центральных лучей на край выходных граней, зачастую закругленных [7].
Заключение
Предложенные в работе методический и инструментальный подход и выполненные модельные расчеты позволили разработать оптическую схему установки для работы в составе серийного Фурье ИК-спектрофотометра RS-88, которая обеспечивает возможность контроля биотканей и клинического анализа крови в состоянии in vivo. Важным преимуществом метода НПВО является простота применения. Образец достаточно прижать к отражающей грани, при этом необязателен оптический контакт, достаточно физического, лишь бы образец находился в пределах глубины проникновения [2].
Литература
1. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. - М.: Мир, 1987.
2. Золотарев В.М. Физическая оптика. - СПб.: СПбГУ ИТМО, 2001.
3. Харрик Н. Спектроскопия внутреннего отражения. - М.: Мир, 1970.
4. Золотарев В.М. Справочник: Оптические постоянные природных и технических сред. - Л.: Химия, 1984.
5. Мамедов Р.К. Развитие методов и техники спектроскопии НПВО и МНПВО: Дис. ... докт. тех. наук. - СПб, 2005.
6. Малышев В.И. Введение в экспериментальную спектроскопию. - М.: Наука, 1979.
7. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Оптические методы исследования молекулярных систем. -М., 1994.
