CC BY
75
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2013 УДК 616.988+616.916.1]-053.7-07
СЕМЕЙСТВО MYC ГЕНОВ В СОЛИДНО-ПСЕВДОПАПИЛЛЯРНОЙ ОПУХОЛИ
ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Е.Н. Гордиенко, О.В. Паклина, И.А. Чекмарева, Д.Л. Ротин, Д.С. Горин
Институт хирургии им А.В. Вишневского, г. Москва
В работе проведено изучение молекулярных нарушений генов c-Myc и N-Myc в солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы. Исследованы 24 образца опухолей полученных от 21 больного, из них: 19 первичных, 1 рецидивная, 4 метастаза. Флуоресцентная гибридизация in situ была проведена с использованием локусспецифических ДНК-проб (молекулярных зондов) к локусам 2p24, 6q23, 8q24 фирмы «Vysis, Abbott Laboratories Inc», США Показано, что амплификация гена N-Myc в солидно-псевдопапиллярной опухоли может быть еще одним подтверждением ее нейрогенного происхождения
Ключевые слова: солидно-псевдопапиллярная опухоль, поджелудочная железа, амплификация гена, морфология, прогноз.
Солидно-псевдопапиллярная опухоль (СППО) редкая злокачественная опухоль, составляющая 0,2 - 2,7% от общего числа злокачественных опухолей и около 6% всех экзокринных образований поджелудочной железы [22, 23, 30]. СППО возникает во второй - третьей декаде жизни преимущественно у лиц женского пола, хотя описаны случаи у мужчин и детей [21, 25, 33, 37].
В классификации ВОЗ СППО относятся к опухолям с неизвестным гистогенезом [3]. В ранних классификациях опухолей поджелудочной железы (ПЖ) они рассматривались в группе нефункционирую-щих опухолей из островковых клеток. Позднее, была выдвинута гипотеза происхождения данной опухоли из клеток полового гребня. Авторы предполагают, что в процессе эмбриогенеза закладка поджелудочной железы и полового гребня находятся близко друг к другу, поэтому клетки из полового гребня могут мигрировать в поджелудочную железу и, как следствие, под влиянием дисгормональных нарушений может развиться СППО, что косвенно подтверждается экспрессией прогестерон-
рецепторов опухолевыми клетками. [29, 35]. В подтверждение данной гипотезы Deshpande V с соавт. (2010) описали три случая подобных новообразований в яичниках со сходной с СППО-морфологией и иммунопрофилем [10]. В противовес данной гипотезе - «эмбриональной миграции» Heiser PW с соавт. (2008) на созданной экспериментальной модели на мышах путем активации ß-катенина в клетках поджелудочной железы, индуцировали рост опухоли, морфологически сходной с человеческой СППО, поэтому авторы предложили гипотезу развития данных опухолей из клеток-предшественников протокового эпителия [18]. Ряд исследователей, выявив диффузную экспрессию CD117 и DOG1 опухолевыми клетками СППО, предположили, что гистогенез СППО близок к гистогенезу гастроинтестинальных стромаль-ных опухолей, однако отсутствовали мутации с-KIT и PDGFRA. Более того, выявленная сходная экспрессия DOG1 как в центроацинарных клетках поджелудочной железы, так и в СППО, не исключает происхождение данной опухоли из дериватов ацинарных структур [2, 6].
В последнее время в литературе активно обсуждается гипотеза происхождения СППО из производных не полового гребня, а нервной пластинки. Например, Chen c соавт. (2004) придерживаются данной гипотезы на основании выявленной ими меланоцитарной дифференци-ровки в СППО [8]. Cavard и соавт. (2009) поддерживают эту же гипотезу, исходя из активации генов и регуляторных белков, участвующих в Wnt-и Notch сигнальных путях, а также наличия экспрессии маркеров нейрогенной дифференцировки (SOX10 и TuJ-1) [7]. По данным Li L. И Guo Y. с соавт. (2011), клетки СППО обладают уникальной околоядерной точечной экспрессией онкомаркера CD99, первоначально характерного для группы опухолей нейроэктодермального происхождения [16,20]. Также была выявлена очаговая экспрессия еще одного маркера нейроэктодермальных опухолей FLI-1, однако мутация гена EWS/FLI-1 не была подтверждена при молекулярных исследованиях [32]. Более того, иммуногисто-химическая (ИГХ) экспрессия опухолевыми клетками белка Р-катенина, являющегося рецептором Wnt пути, а также мутация гена Р-катенина, расположенного в 3 экзоне (CTNNB1) характерна не только для СППО, но и для медуллобластом, и примитивных нейроэктодермальных опухолей [1,14,17]. Во всех опухолях нервной системы также задействованы гены семейства Myc (c-Myc и N-Myc), при этом в большинстве случаев, отмечалась не только повышенная ИГХ- экспрессия белков генов семейства Myc, но и молекулярные нарушения в самих генах [4,26,27,28]. Известно, что активированные гены семейства Myc в постнатальном периоде обладают способностью вызывать опухолевый рост, особенно в комбинации с другими онкогенами [13].
Целью нашего исследования явилось изучение молекулярных нарушений генов c-Myc и N-Myc в солидно- псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.
Материалы и методы
В исследовании использованы 24 образца опухолей полученных от 21 больного, из них: 19 первичных, 1 рецидивная,
4 метастаза. Флуоресцентная гибридизация in situ была проведена с использованием локусспецифических ДНК-проб (молекулярных зондов) к локусам 2p24, 6q23, 8q24 фирмы «Vysis, Abbott Laboratories Inc», США. Использовали парафиновые блоки фрагментов опухолей с предварительной гистологической окраской срезов для выбора наиболее репрезентативных участков для дальнейшего исследования. Далее срезы обрабатывали по следующей методике: депарафинация срезов в серии ксилолов, дегидратация в спиртах восходящей концентрации, обработка пепсином, денатурация и гибридизация с ДНК-зондами в гибридизационной камере HYBrite в течение 16-18 часов, отмывка, контрастирование и заключение препарата среду в DAPI I. По окончании реакции гибридизации срезы изучали во флюоресцентном микроскопе «Axio Imager A2» («Karl Zeiss», Германия). Изображение фиксировали с помощью цифровой CCD-видеокамеры «Axiocam» («Karl Zeiss»).
Результаты оценивались после подсчета сигналов в 200 отдельно лежащих ядрах. В качестве контроля использовали непораженную ткань поджелудочной железы. Сбалансированным считали профиль при наличие в 90 % ядер двух сигналов от контрольной пробы и двух сигналов от исследуемой пробы. В случае наличия в 90 % ядер двух сигналов от контрольной пробы и более двух сигналов от исследуемой пробы выявлялась амплификация.
Результаты и обсуждение
Клинические данные по больным и макроскопическая характеристика опухолей приведены в таблице 1.
Все больные исключительно женского пола, возраст колебался от 18 до 67 лет, средний возраст составил 34,4 года, при этом до 45 лет 17 больных (81%), после 45 - 4 (19%). Клинически доброкачественное поведение опухоли (без развития рецидивов и метастазов) отмечалось у 17 больных (81%). У четырех пациентов (19%) на момент наблюдения имелись метастазы опухоли, из них: в печень - 2 случая, лимфоузлы - 2, желудок - 2, селезенку - 1, большой сальник - 1, брыжейку тонкой и толстой кишки - 1. Размеры ме-
Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2013 г.
Таблица 1
Морфологические и молекулярно-биологические особенности _опухолей поджелудочной железы_
№ п/п Возраст Пол Размер опухо-лисм Наличие рецидива или метастазов Экспрессия в-кате-нина ЕВН-анализ
Ген С-тус Ген ]]-тус
1 18 ж 5,5 да* да сбалансированный профиль амплификация
2 33 ж 2,5 нет да нет сигнала нет сигнала
3 67 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация
4 44 ж 13 да** да сбалансированный профиль амплификация
5 48 ж 6.5 да*** да нет сигнала нет сигнала
6 19 ж 4 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
7 49 ж 9 да**** да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
8 31 ж 0,6 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
9 36 ж 2,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
10 59 ж 5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
11 42 ж 2 нет да нет сигнала нет сигнала
12 24 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация
13 25 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
14 21 ж 11 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
15 23 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация
16 29 ж 11 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
17 24 ж 17 нет да нет сигнала нет сигнала
18 35 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация
19 31 ж 15 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
20 39 ж 5,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль
21 25 ж 2,5 нет да сбалансированный профиль амплификация
* метастазы в парапанкреатические лимфоузлы
**рецидив в культю поджелудочной железы с вовлечением в процесс левой почки, метастазы в печень, большой сальник, брыжейку тонкой и толстой кишки
*** метастазы в желудок, селезенку ****метастазы в печень
Рис. 1а. Операционный материал. Опухолевая ткань мягкая, розоватые солидные участки чередуются с кистозными полостями заполненными крошащим
Рис. 1б. Псевдососс в СППО. Окраска ге и эозином. Ув. 200
; стру
Рис. 1в. Дистрофические изменения в СППО в виде скопления кристаллов холестерина и многоядерных клеток инородных тел. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100
Рис. 1г. Дистрофические изменения в СППО в виде очагов миксоматоза и участков обызвествления. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50_
с
тастазов от 0,3 (в лимфоузлах) до 25 см (в печени). Длительность периода от первичной опухоли до появления метастазов составила 3, 72, 122 мес. В одном случае наблюдалось одномоментное выявление метастазов (в печень) и первичной опухоли. В одном случае отмечался рецидив опухоли в культе поджелудочной железы через 46 месяцев.
Макроскопически СППО были представлены одиночным или множественными узлами размерами от 0,6 до 17 см (средний размер 6,2 см). Опухолевые узлы были инкапсулированы и хорошо отграничены от окружающей паренхимы железы. На разрезе опухолевая ткань мягкая, светло-коричневые или розоватые солидные участки чередовались с кистозными полостями и участками кровоизлияний. Кисты были заполнены темно бурым густым содержимым с крошащимися массами (рис. 1а). Макроскопически преобладал солидный вариант строения опухоли - 12 случаев (57,1%), также встречался кистозно-солидный - 8 (38,1%) и кистозный - 1 (4,8%). Микроскопически опухоли были представлены сравнительно мономорфными полигональными клетками, окружающими множество тонких капилляроподобных кровеносных сосудов (рис. 1б). Строма была представлена нежными фиброваскулярными прослойками с очагами миксоматоза и гиа-линоза. Также в ряде опухолей наблюдались дистрофические изменения в виде скопления шаровидных клеток с пенистой цитоплазмой
(пенистые макрофаги), кристаллов холестерина, многоядерных клеток инородных тел, очагов миксоматоза, участков обызвествления и кровоизлияний (рис. 1в, г).
Характерным гистологическим признаком являлось наличие по периферии опухоли так называемых «озер крови» с включением отдельных опухолевых клеток или их комплексов (рис. 2а). Макро- и микроскопическая характеристика метастазов и рецидивных опухолей была аналогична первичным СППО. Для подтверждения диагноза СППО во всех образцах проводилось ИГХ исследование опухоли на Р-катенин. Ядерная и ци-топлазматическая экспрессия в- катенина отмечена в 21 случае (100%) (рис. 2б).
Флуоресцентная гибридизация in situ: в 4 случаях (после длительной фиксации в формалине) материал оказался непригоден для анализа результатов флуоресцентной гибридизации in situ из-за невозможности визуализировать сигналы от ДНК-зондов. Во остальных случаях (17) получен сбалансированный сигнал гена c-Myc (рис. 2в). Амплификация гена N-Myc выявлена в 7 из 17 случаев (41%), при этом в двух случаях опухоли проявляли агрессивное клиническое течение с развитием метастазов (табл. 1, рис. 2г).
Известно, что Wnt и Notch сигнальные пути в период эмбриогенеза отвечают за дифференцировку нормальных тканей, в том числе играют ключевую роль в развитии нервной системы (рис. 3а,б).
н 1 1 ^^Н v j I Жш Е /
Рис. 2а. «Озера крови» в СППО. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50 Рис. 2б. Экспрессия в-катенина клетками СППО. Метод иммуногистохимии. Ув. 50
Рис. 2в. Сбалансированный сигнал гена C-myc в клетках СППО, метод флуорисцентной гибридизации in situ, х600
Рис. 2г. Амплификация гена N-myc в клетках СППО, метод флуорисцентной гибридизации in situ, х600
Рис. 3а. WNT-сигнальный путь
В эмбриональном периоде р-катенин выступает в качестве посредника диффе-ренцировки нервного гребня, подавляет эпидермальную дифференцировку и активирует пигментацию и рост нервных волокон [34]. Однако, некоторые исследования указывают на роль Wnt сигнализации в поддержании плюрипотентности и регулировании роста эмбриональных стволовых клеток [5,24]. В постнатальном периоде эти сигнальные пути связаны с патогенезом примитивных «бластных» опухолей нервной системы таких как нейроб-ластома, медуллобластома, ретинобла-
стома, глиобластома и примитивные ней-роэктодермальные опухоли [11,15,19]. Кроме того, имеется связь Notch-пути с геном N-Myc, который является белком-мишенью Huwel убиквитин лигазы в Notch сигнализации [36].
Выводы
Амплификация гена N-Myc в СППО может быть еще одним подтверждением ее нейрогенного происхождения. Однако, данная опухоль обладает низким потенциалом злокачественности и редко мета-стазирует и рецидивирует в отличие от агрессивного течения бластных опухолей
Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2013 г.
нервной системы. Возникают опухоли намного позднее и протекают более благоприятно. Возможно, это связано с тем, что свою агрессивность опухоли нервной системы проявляют в результате взаимодействия многих онкогенов. С другой стороны, у больных медуллобластомой и PNET экспрессия р-катенина рассматривается в качестве маркера благоприятного исхода в отличие от других типов опухо-
лей (рак кишки, молочной железы, печени), в которых его ядерная экспрессия связана с прогрессированием заболевания [9,12]. По предположению Tiemann K и соавт., мутации ß-катенина могут не влиять на скорость пролиферации в СППО в связи с активацией ингибиторов циклин-зависимой киназы p21 и p27, играющих важную роль в прекращении активирована Wnt сигнализации [31].
Рис. 3б. Notch- сигнальный путь
Литература
1. Solid-pseudopapillary tumors of the pancreas are genetically distinct from pancreatic ductal adenocarcinomas and almost always harbor betacatenin mutations / S.C. Abraham [et al.] // Am J Pathol. -2002. - Vol. 160. - P. 1361-1369.
2. Discovered on gastrointestinal stromal tumor 1 (DOG1) is expressed in pancreatic centroacinar cells and in solid-pseudopapillary neoplasms - novel evidence for a histogenetic relationship / F. Bergmann [et al.] // Hum Pathol. - 2011. - Vol. 42. - P. 817-823.
3. World Health Organization international histological classification of tumors of the Digestive System / F.T. Bosman [et al.]. -4th ed. - Lion, 2010.
4. Glioblastoma subclasses can be defined by activity among signal transduction pathways and associated genomic alterations / C. Brennan [et al.] // PLoS One. -2009. - Vol. 77. - P. 52-54.
5. Promoting human embryonic stem cell renewal or differentiation by modulating Wnt signal and culture conditions / L. Cai [et al.] // Cell Res. - 2007. - Vol. 17. -P. 62-72.
6. Positive immunohistochemical staining of KIT in solid-pseudopapillary neoplasms of the pancreas is not associated with KIT/PDGFRA mutations / D. Cao [et al.] // Mod Pathol. - 2006. - Vol. 19. -P. 1157-1163.
7. Gene expression profiling provides insights into the pathways involved in solid pseudopapillaryneoplasm of the pancreas / C. Cavard [et al.] // J Pathol. - 2009. -Vol. 218, №2. - P. 201- 209.
8. Melanocytic differentiation in a solid pseudopapillary tumor of the pancreas: case report / C. Chen [et al.] // J Ga-stroenterol. - 2004. - Vol. 39. - P. 579583.
9. Wnt/Wingless pathway activation and chromosome 6 loss characterize a distinct molecular sub-group of medullo blastomas associated with a favorable prognosis / S.C. Clifford [et al.] // Cell Cycle. -2006. - Vol. 5. - P. 2666-2670.
10. Deshpande V. Solid pseudopapillary neoplasm of the ovary: a report of 3 primary ovarian tumors resembling those of the pancreas / V. Deshpande, E. Oliva, R.H. Young // Am J Surg Pathol. - 2010.
- Vol. 34. - P. 1514-1520.
11. Histopathological and molecular prognostic markers in medulloblastoma: c-myc, N-myc, TrkC, and anaplasia / C.G. Eberhart [et al.] // J Neuropathol Exp Neurol.
- 2004. - Vol. 63. - P. 441-449.
12. Medulloblastoma: clinicopathological correlates of SHH, WNT, and non-SHH/WNT molecular subgroups / D.W. Ellison [et al.] // Acta Neuropathol. -2011. - Vol. 121. - P. 381-396.
13. Fredrik J. Swartling Myc proteins in brain tumor development and maintenance / J. Fredrik // Ups J Med Sci. - 2012. - Vol. 117, № 2. - P. 122-131.
14. TP53, b-catenin and c-myc/ N-myc status in embryonal tumours with ependymo blastic rosettes / M. Gessi [et al.] // Neuropathology and Applied Neurobiology. -2011. - Vol. 37. - P. 406-413.
15. Targeting Notch pathway induces growth inhibition and differentiation of neurob-lastoma cells / Giulia Ferrari-Toninelli [et al.] // Neuro Oncol. - 2010. - Vol. 12, № 12. - P. 1231-1243.
16. Paranuclear dot-like immunostaining for CD99: a unique staining pattern for diagnosing solid-pseudopapillary neoplasm of the pancreas / Y. Guo [et al.] // Am J Surg Pa-thol. - 2011. - Vol. 35, № 6. - P. 799-806.
17. An investigation of WNT pathway activation and association with survival in central nervous system primitive neuroectodermal tumours (CNS PNET) / H.A. Rogers [et al.] // Br J Cancer. - 2009. -Vol. 100, № 8. - P. 1292-1302.
18. Stabilization of beta-catenin induces pancreas tumor formation / P.W. Heiser [et al.] // Gastroenterology. - 2008. - Vol. 135. - P. 1288-1300.
19. Comparative analyses of gene copy number and mRNA expression in glioblastoma multiforme tumors and xenografts / J.G.
Hodgson [et al.] // Neuro Oncol. - 2009. -Vol. 11. - P. 477-487.
20. Immunohistochemical evaluation of solid pseudopapillary tumors of the pancreas: the expression pattern of CD99 is highly unique / L. Li [et al.] // Cancer Lett. -2011. - Vol. 310, № 1. - P. 9-14.
21. Solid pseudo-papillary neoplasm of the pancreas: distinct patterns of onset, diagnosis, and prognosis for male versus female patients / M.C. Machado [et al.] // Surgery. - 2008. - Vol. 143. - P. 29-34.
22. Solid-pseudopapillary tumor of the pancreas: a surgical enigma? / R.C. Martin [et al.] // Ann Surg Oncol. - 2002. - Vol. 9. - P. 35-40.
23. Mulkeen A.L. Less common neoplasms of the pancreas / A.L. Mulkeen, P.S. Yoo, C. Cha // World J Gastroenterol. - 2006.
- Vol. 12. - P. 3180-3185.
24. Synergistic action of Wnt and LIF in maintaining pluripotency of mouse ES cells / K. Ogawa [et al.] // Biochem Bio-phys Res Commun. - 2006. - Vol. 343. -P. 159-166.
25. Papavramidis T. Solid pseudopapillary tumors of the pancreas: review of 718 patients reported in English literature / T. Papavrami-dis, S. Papavramidis // J Amer Coll Surg. -2005. - Vol. 200. - P. 965-972.
26. gliomas with primitive neuroectodermal tumor-like components: a clinic pathologic and genetic study of 53 cases / A. Perry [et al.] // Brain Pathol. - 2009. - Vol. 19.
- P. 81-90.
27. Outcome prediction in pediatric medul-loblastoma based on DNA copy-number aberrations of chromosomes 6q and 17q and the MYC and MYCN loci / S. Pfister [et al.] // J Clin Oncol. - 2009. - Vol. 27.
- P. 1627-1636.
28. N-myc amplification and neuronal differentiation in human primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system / E.
Rouah [et al.] // Cancer Res. - 1989. - Vol. 49. - P. 1797-1801.
29. Clinical and biological behavior of pancreatic solid pseudopapillary tumors: report on 31 consecutive patients / R. Salvia [et al.] // J Surg Oncol. - 2007. - Vol. 95. - P. 304-310.
30. Santini D. Solid-Papillary Tumors of the Pancreas: Histopathology / D. Santini, F. Poli, S. Lega // J Pancreas (Online). -
2006. - Vol. 7. - P. 131-136.
31. Solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas show an interruption of the Wnt-signaling pathway and express gene products of 11q / K. Tiemann [et al.] // Mod Pathol. -
2007. - Vol. 20. - P. 955-960.
32. Solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas are associated with FLI-1 ex-pression,but not with EWS/FLI-1 translocation / K. Tiemann [et al.] // Mod. Pathol. - 2006. - Vol. 19. - P.1409-1413.
33. Solid and cystic tumor of the pancreas in an adult male / T. Tsunoda [et al.] // Acta Pathol Jpn. - 1991. - Vol. 41. -P. 763-770.
34. Activation of beta-catenin signaling programs embryonic epidermis to hair follicle fate / Yuhang Zhang [et al.] // Development. - 2008. - Vol. 135, № 12. -P. 2161-2172.
35. Mucinous cystic tumors of the pancreas: clinicopathological features, prognosis, and relationship to other mucinous cystic tumors / G. Zamboni [et al.] // Am J Surg Pathol. - 1999. - Vol. 23. - P. 410-422.
36. The HECT-domain ubiquitin ligase Huwe1 controls neural differentiation and proliferation by destabilizing the N-Myc oncoprotein / X. Zhao [et al.] // Nat Cell Biol. - 2008. - Vol. 10. - P. 643-653.
37. Solid-cystic papillary tumor of the pancreas in children / H. Zhou [et al.] // Pe-diatr Surg Int. - 2001. - Vol. 17. -P. 614-620.
MYC FAMILY GENES IN SOLID-PSEUDOPAPILLARY TUMORS OF THE PANCREAS
E.N. Gordienko, O.V. Pakhlinа, I.A. Chekmareva, D.L. Rothin, D.S. Gorin
In the paper the study of molecular disorder genes c-Myc and N-Myc in solid-pseudopapillary tumor of the pancreas. Examined 24 samples of tumors obtained from 21 patients, including 19 primary, recurrent 1, 4 metastasis. Fluorescence in situ hybridization was performed using DNA samples lokusspetsificheskih to the loci 2p24, 6q23, 8q24 company «Vysis, Abbott Laboratories Inc», demonstrated that amplification of the N-Myc gene in solid-pseudopapillary tumor can be another confirming its neurogenic origin
Key words: the solid-pseudopapillary tumor of the pancreas, gene amplification, morphology, prognosis.
Паклина О.В. - д-р мед. наук, заведующая патологоанатомическим отделением ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.
123098, г. Москва, ул. Маршала Новикова, д. 23.
Ротин Д.Л. - канд. мед. наук, ст. научный сотрудник патологоанатомической лаборатории НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН.
125047, г. Москва, ул. 4-я Тверская-Ямская, д. 16.
