CC BY
1УДК: 616.36-091.83
РОЛЬ ЯДЕРНОГО АППАРАТА ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ.
Исаева Нилуфар
Phd, старший преподователь Университет Альфраганус, кафедра «Медицина»
Аннотация.
При резекции печени, наряду с митотическим делением печеночных клеток также происходит миграция ядрышек гепатоцитов, более того данный процесс стимулируется, особенно на 7 сутки после операционного периода, что может свидетельствовать о регенераторном значение выхода ядрышка в цитоплазму клетки. Увеличение числа многоядрышковых гепатоцитов, согласно литературным данным, свидетельствует об активации белок-синтетической функции клетки печени.
Ключевые слова: печень, гепатоцит, резекция, миграция, ядрышко, регенерация.
Актуальность. Печень является уникальным органом, поддерживающим гомеостаз. Она осуществляет трансформацию экзогенных аминокислот, углеводов, липидов и витаминов, синтез сывороточных белков, образование желчи, детоксикацию и экскрецию в желчь эндогенных продуктов обмена и ксенобиотиков. Среди элементов ядерного аппарата гепатоцитов важное значение имеет очень маленькое тельце - ядрышко. Наши исследования показали, что при необходимости синтеза большого количества белка для нужд самой печени или организма, ядрышко гепатоцитов кроликов может мигрировать в цитоплазму и участвовать в синтетических процессах.[1, 2, 8]
Для того чтобы установить, существует ли данный феномен выхода ядрышка не только у кроликов, но также и у других млекопитающих, нами были выбраны широко используемые лабораторные животные - белые беспородные крысы, а в качестве эксперимента - 25% резекция печени (левая латеральная доля печени). Половозрелые животные массой 180-200г под
легким этаминаловым наркозом подвергались лапаротомии и производилась резекция печени по общепринятой методике. Затем животные забивались в сроки 3, 7, 15 и 30 сутки после операции. Кусочки печени обрабатывались вышеуказанными способами, а гистологические препараты как от контрольных-интактных, так и оперированных опытных животных, анализировали под микроскопом.
Первое научное исследование процесса регенерации печени проведено в 1931 году. E. M. Hiqins и R.M. Anderson. Для изучения механизма регенерации применялись различные экспериментальные подходы, в основу которых было положено оценка регенерации печени, после её химического повреждения, хирургической резекции in vivo, а также исследования пролиферации гепатоцитов в первичной культуре в присутствии факторов риска in vitra.
Наиболее широко изученным примером регенерации печени является модель ее вырастания после резекции. Отмечено, что после резекции ткани печени происходит компенсаторная регенерация с образованием новых клеточных элементов путем митотического деления оставшихся. Таким образом, регенерация печени — это процесс компенсаторного роста, в котором резецированная доля не вырастает, а увеличивается, масса оставшихся долей как следствие пролиферации клеток. [5;6;12] Уровень пролиферативной активности гепатоцитов в определенной степени зависит от объема резекции: чем большая часть печени удаляется во время операции, тем выше пролиферативный пул клеток. Удаление менее 40% ткани сопровождается малым синтезом ДНК, что заставляет высказать предположение о недостаточности пускового эффекта удаления малого количества ткани (возможно, при этих обстоятельствах не развивается функциональный дефицит). Известно, что после резекции 60--70% ткани печени оставшаяся часть испытывает значительный энергетический недостаток, сохраняющийся в течение 1-х суток. В дальнейшем происходит повышение энергетического статуса и приближение его к исходным величинам через 5-7суток.
Цель исследования. Изучить влияние резекции на миграцию ядрышка и изучить роль миграции ядрышка на регенеративные процессы печени у крыс.
Материалы и методы. Материалом служит печень половозрелых крыс, обоих полов. Эксперимент проведён на 25 беспородных белых крысах массой 180-200 гр. с соблюдением принципов гуманного обращения с животными, изложенными в Хельсинской декларации и Европейской конвенций по защите
позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях [2]. Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к корму и воде. Животные подвергались 25% резекции печени, и были декапитированы на 3, 5, 7, 15 и 30 сутки после резекции, под этаминаловым наркозом (40 мг/кг массы тела животного). Для морфометрического и светооптического исследований (микроскоп LEICA GALEN III) гистологические препараты фиксировали в 10%-м забуференном водном растворе формальдегида и проводили исследование по общепринятой методике. Морфометрическое исследование препаратов печени проводили при увеличении в 1000 раз на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилин-эозином, используя метод наложения точечных морфометрических сеток [1]. Определяли количество одноядерных и двуядерных гепатоцитов, диаметр гепатоцитов, ядер и ядрышек [10]. Статистическую обработку результатов исследования проводили методом вариационной статистики при помощи пакета программ «Statistica 10» с использованием параметрического t-критерия Стьюдента [3]. Различия сравниваемых величин считали статистически значимыми при р <0,05. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для лабораторных или иных целей.
Срезы для гистологических исследований окрашивали гематоксилин -эозином, а фотографирование препаратов производили при помощи микроскопа модели N-800M, под иммерсионным объективом (х100). Опытную группу составили 26 крыс. Материалом исследования была печень половозрелых беспородных крыс.
Результаты исследования: Результаты проведенных исследований показали, что наиболее важные данные получены при анализе морфологической картины животных, подвергнутых 25% резекции печени. В ранние сроки эксперимента (3-7сутки), как фигуры митотического деления, так и выход ядрышек был незначительным (3-5%). Однако количество выходящих ядрышек заметно увеличилось на 15 сутки примерно 8-10 раз (предварительные данные), по сравнению с контролем, на небольшом участке поле зрения обнаруживалось несколько выделяющиеся ядрышки (рис.1). Гепатоциты имеют полигональную форму, цитоплазма их окрашена оксифильно, ядра содержат 2- 3 мелкие ядрышки или иногда одно крупное. На рис.1 в центре находится двуядерный гепатоциты, каждое ядро которого
содержат по одному ядрышку, а рядом другой гепатоцит, в котором хорошо заметно как ядрышко выбухает в сторону цитоплазмы, очевидно, находится на стадии пенетрации ядерной оболочки.
- к **тТ с-У
& ' -4 %
IV® уЯ 4
Я^ЙГ* ^ * ¿Ь
? л? ^ ' ' „ Ш
Ш
к V -VÍA* Vj> ш -ш
Рис. 1. Печень крысы при частичной ее резекции. Окраска Г.-Э. В одноядерном гепатоците крупное ядрышко находится на стадии выхода через ядерную оболочку. Ув. об. х100
1
К 30 суткам послеоперационного периода количество выделяющихся ядрышек (1,75±0,88) значительно убавилось, приближаясь к норме. Таким образом, при резекции печени наряду с увеличением количества митозов на 3 -5 сутки эксперимента, заметно возрастает выход ядрышек (1,31±0,21**) в печеночных клетках с образованием много ядерных, так и молодых клеток. Характерной чертой митотической активности гепатоцитов при малых резекция является то, что она протекает без достижения пиковых показателей, то есть не происходит выраженной синхронизации митотических циклов гепатоцитов. Этот факт послужил основанием для некоторых авторов рассматривать восстановление массы печени после такой резекции (10-30% паренхимы печени) как своеобразную модель нарушения регенерации [Mitchell C. et al., 2005].
Считается, что подобная динамика пролиферации объясняется более поздним наступлением пика активности основных факторов роста и циклинов D1, A, E [Mitchell C. et al., 2005]. На основании этого некоторые авторы
рассматривают пролиферацию гепатоцитов после малых резекций (10-30% паренхимы печени) как своеобразную модель нарушения митотического цикла гепатоцитов, при котором невозможно синхронизация пролиферации клеток [Lambotte L. et al., 1997, Li J. et al., 2009]. Полученные данные свидетельствуют не только об увеличении двуядерных гепатоцитов, но также об участии их в клеточном обновлении в печени, следовательно, в процессах регенерации органа. Одним из показателей интенсификации регенераторных процессов в печени является увеличение содержания двуядерных гепатоцитов (Т.А. Залетаева, 1963; Б.П. Солопаев 1980; Л.К. Романова, 1984; И.В. Ступин и соавт., 1995 и др.). Механизм их происхождения не совсем ясен. Большинство исследователей в настоящее время отрицают амитотическое деление ядер в любой ткани.
В то же время появились косвенные подтверждения тому, что значительная часть митозов в печени является ацитокинетическими, что и приводит к образованию двуядерных гепатоцитов [2;3;4].
Через 3 суток после резекции в печени подопытных животных обнаруживалось множетсво митотически делящихся гепатоцитов. Большое количество делящихся гепатоцитов обнаруживалось вплоть до 7 суток после операции, далее их становилось меньше. Однако единичные фигуры митозов встречались и через 10 суток после операции. На завершающих этапах регенерации среди гепатоцитов чаще встречались двуядерные клетки. (8,89±2,1**)
Рис 2. Печень крысы после частичной ее резекции. Окраска гематоксилин-эозином. А. В центре рисунка фигура митотического
деления гепатоцита. Ув. об.х 40
Диаметр ядрышек одноядерных гепатоцитов увеличивается на 5 сутки (2,59±0,44**) и далее стабильно идет на спад. На 30 сутки (2,59±0,44**) он близок к контрольному, диаметр ядрышек двуядерных клеток резко возрастает на 5 сутки (1,97±0,31**) и начинает уменьшаться до 15 суток(1,41±0,74*), далее следует скачкообразное увеличение на 30 сутки (1,71±0,88**) отклоненное от контроля
Количество ядрышек одноядерных клеток незначительно увеличивается на 5 сутки (1,90±1,05), далее до 30 суток оно стабильно уменьшается. На 30 сутки показатель немного меньше контрольного (1,75±0,88). Число ядрышек двуядерных клеток резко снижается на 5 сутки (1,31±0,21 **). До 10 дня не изменяется (1,31±0,21**). После 15 дня начинает расти (1,51±0,84**) и к 30 дню показатель приближен к контролю (1,68±0,95).
При резекции печени в регенераторных процессах наряду с митозом (3 -5 сутки) участвуют и ядрышки гепатоцитов, их выход увеличивается на 15 сутки эксперимента, следовательно, в восстановлении утраченной массы органа обязательно участвуют ядрышки.
Восстановление структуры печени в постнатальном онтогенезе изучали достаточно интенсивно (Солопаев Б.П., 1970; Верин П.К., 1971; Григорьев Н.И., 1975; Втюрин Б.В., Пальцын А.А.,1975; Коваленко И.А., 1975; Палигина Л.С.,1975;Сидорова В.Ф.,1976; Дубовая Т.К. и соавт., 1977; Садовникова В.В., Садовникова И.В., Иванова Н.А., 2001; Грищенков и соавт., 2001; Батанов А.Н., 2001; Fabricant J. 1968, 1969; Rabes Н. Et al., 1976; Kirs he et al.,1980; Pezzino et al.,1980; Lope P., McMahon J., 1984; и др.). Биологический смысл двуядерных гепатоцитов долгое время оставался не ясным. В настоящее время большинство исследователей полагают, что образование двуядерных гепатоцитов из одноядерных при репаративной регенерации представляет собой резерв полиплоидизации (С.И. Телепнева, 1968; Г.Д. Туманишвили, И.Г. Кахидзе, П.В. Челидзе, 1975;)
Выводы: Анализ морфологической картины животных, подвергнутых 25%- резекции печени, в ранние сроки эксперимента (3-7 сутки), показал, что в пострезекционном периоде как фигуры митотического деления, так и выход ядрышек был очень незначительным (3-5%). Однако на 15 сутки пострезекционного периода количество двуядерных гепатоцитов и мигрирующих ядрышек заметно увеличилось. Изученные данные показали,
что количество двуядерных гепатоцитов не только увеличевается, но также участвуют в клеточном обновлении печени, а, следовательно, и в процессах регенерации органа. Таким образом, можно заключить, что при резекции печени, наряду с митотическим делением печеночных клеток также происходит миграция гранулярных компонентов ядрышек гепатоцитов, более того данный процесс стимулируется, особенно на 7 сутки после операционного периода, что может свидетельствовать о регенераторном значение выхода ядрышка в цитоплазму клетки. Увеличение числа многоядрышковых гепатоцитов, согласно литературным данным, свидетельствует об активации белок-синтетической функции клетки. Так или иначе увеличение числа двуядерных и двуядрышковых гепатоцитов, вместе с гипертрофией печеночных клеток, можно расценивать как единый компенсаторно-приспособительный механизм, направленный на нормализацию структуры и функции органа.
Список литературы
1. Садриддинов А. Ф., Исаева Н. З. Этапы миграции ядрышек гепатоцитов печени у некоторых видов млекапитающих. - «Тиббиётда янги кун» 3 (31) 2020 г., 582-585 стр.
2. Садриддинов А.Ф. Значение ядрышка во взаимосвязи полиплодиии многоядерности печеночных клеток - «Австрийский журнал технических и естественных наук», январь-февраль 2014 г., №2, с.64-73;
3. Хельсинская декларация всемирной медицинской ассоциации: этические принципы медицинских исследований с участием человека в качестве объекта исследования (Сеул,2008). Морфолопя. 2010;2(4):69-72
4. Зацепина О.В. Локализация ДНК в ядрышках клеток млекопитающих. «Цитология». 1992. т. 34. № 5. С.34-39.
5. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы / Бабаева А.Г. - М.: Издательство РАМН, 2009. - 336 с.
6. Романова ЛП, Малышев ИИ. Роль двуядерных гепатоцитов в регенерации печени после механической травмы в раннем онтогенезе у крыс. Вестн Чувашского Ун-та. 2011; 3:398-402.
7. Скуратов АГ, Лызиков АН, Зиновкин ДА, Чешик ИА, Петренев ДР. Морфометрические параметры регенерации печени при частичной гепатэктомии и трансплантации мезенхимальных стволовых клеток
в эксперименте. Весщ Нац Акад Навук
Беларусь Сер Мед Навук. 2016; 4:57-65.
8. St. Mironescu and C. Dragomir, Nucleolar Behavior in Regenerating Liver of Normal and Whole-bodyirradiated Rats. Cancer Res. 1967;27:1819-1830.
9. Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascues J., Lamond A.I. The multifunctional nucleolus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8:574-585
10. Hernandez-Verdun D The nucleolus: a model for the organization of nuclear functions. Histochem Cell Biol. 2006, 126:135-148
