CC BY
21
10.21518/2079-701X-2018-15-138-143
С.С. БОНДАРЬ1, И.В.ТЕРЕХОВ1, В.С. НИКИФОРОВ2, В.К. ПАРФЕНЮК3, Н.В. БОНДАРЬ4
1 ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет», Тула
2 ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, Санкт-Петербург
3 ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского», Саратов
4 ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет им. И.С. Тургенева», Орел
РОЛЬ СУПРЕССОРА ЦИТОКИНОВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ SOCS7
В РЕГУЛЯЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ИНГИБИТОРА ЯДЕРНОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ NF-KB В МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТАХ И ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ У РЕКОНВАЛЕСЦЕНТОВ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ
В исследовании обсуждается взаимосвязь содержания в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) фосфори-лированной формы ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB и супрессора цитокиновой сигнализации 7 (SOCS7) и продукции МНК цитокинов (ФНОа, ИФНа, ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12), определяющих состояние врожденного и адаптивного иммунного ответа.
Методом иммуноферментного анализа в МНК определяли содержание и уровень фосфорилирования ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (1кВа), а также концентрацию протеина SOCS7. Кроме того, в клеточных супернатантах определяли концентрацию ФНОа, ИФНа, ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12. Взаимосвязи между исследованными факторами оценивали методом линейного регрессионного анализа.
Результаты проведенного исследования свидетельствует о том, что постклиническое течение ВП сопровождается снижением уровня ФНОа и ИЛ-4 и повышением продукции ИНФа. Также в стадию реконвалесценции отмечается снижение фосфорилирования 1кВа и повышение в МНК концентрации SOCS7. Проведенный анализ выявил значимое влияние на уровень фосфорилирования 1кВа содержания в клетке SOCS7. Таким образом, сильное отрицательное влияние SOCS7 на активность 1кВа может быть опосредовано угнетением под его влиянием активности STAT3/5 и МАРК^АРК-зависимых механизмов продукции цитокинов, что позволяет рассматривать указанный фактор в качестве терапевтической мишени для ограничения избыточной иммуносупрессии у реконвалесцентов ВП. Ключевые слова: 1кВа, SOCS7, пневмония.
S.S. BONDAR1, I.V. TEREKHOV1, V.S. NIKIFOROV2, V.K. PARFENYUK3, N.V. BONDAR4
1 Tula State University, Tula, Russia
2 North-Western State Medical University n. a. I. I. Mechnikov, Saint Petersburg, Russia
3 Saratov State Medical University, Saratov, Russia
4 Orel State University, Orel, Russia
THE ROLE OF SUPPRESSOR OF CYTOKINE SIGNALING SOCS7 IN THE REGULATION OF THE PHOSPHORYLATION OF INHIBITOR OF NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR NF-KB IN MONONUCLEAR LEUKOCYTES AND PRODUCTION OF CYTOKINES IN COMMUNITY- ACQUIRED BACTERIAL PNEUMONIA
The study discusses the relationship between the content of NF-КВ and cytokine signaling suppressor 7 (SOCS7) in mononuclear peripheral blood cells (MNC) phosphorylated form of nuclear transcription factor inhibitor (NF-КВ) and the production of MNC cytokines (TNF, IFN, IL-1P, IL-4, IL-10, IL-12) determining the state of congenital and adaptive immune response. The content and level of phosphorylation of the nuclear transcription factor NF-КВ (Ikba) inhibitor and the SOCS7 protein concentration were determined by enzyme immunoassay in MNC. In addition, the concentration of TNF, IFN, IL-1P, IL-4, IL-10, IL-12 was determined in cellular supernatants. The interrelations between the studied factors were evaluated by the method of linear regression analysis.
The results of the study indicate that the stage of recovery of community-acquired pneumonia is accompanied by a decrease in the level of IL-1, TNF and IL-4 and an increase in the production of Information. Also in the stage of convalescence there is a decrease in phosphorylation of Ikba and an increase in the concentration of SOCS7 in the OLS. The analysis revealed a significant effect on the level of phosphorylation of Ikba content in the cell SOCS7. Thus, a strong negative relationship between SOCS7 and phosphorylation of Ikba can be mediated by inhibition under its influence of STAT3/5 and MARK / SAPK-dependent cytokine production mechanisms, which allows to consider this factor as a therapeutic target for limiting excessive immunosuppression in pneumonia. Keywords: 1кВа, SOCS7, pneumonia.
Реактивность иммунокомпетентных клеток (ИКК), регулирующих адаптивный иммунный ответ, в отношении разнообразных внешних стимулов в значительной мере определяется состоянием внутриклеточных сигнальных путей, из которых JAK/STAT/SOCS-сигнальный путь наиболее важен для обеспечения надлежащей клеточной реакции на соответствующие регулирующие сигналы - цитокины и факторы роста [1].
Обеспечивая активацию различных клеточных программ саногенеза, JAK/STAT/SOCS сигнальный путь играет ключевую роль в развитии и поддержании активности адаптивного иммунного ответа в острую стадию инфек-ционно-воспалительной патологии, а также в постклиническую фазу [2]. При этом механизмы саногенеза включают в себя реакции, направленные как на увеличение числа антиген-специфических ИКК за счет усиления пролиферации, так и на их снижение, опосредованное процессом апоптоза и аутофагии. Негативная регуляция воспалительной реакции обеспечивается семейством белков - супрессоров цитокиновой сигнализации, представленным белками SOCS1-7 и PIAS, блокирующих JAK/ STAT-сигнальный путь в ИКК [1, 2, 4]. Вместе с тем SOCS-белки, как показывают результаты проводимых исследований, играют определенную роль в реализации процессов апоптоза и аутофагии, очевидно, не только в ИКК, регулируя процессы старения и обновления тканей, а также их метаболизм, модулируя активность ядерного фактора транскрипции NF-kB [5].
Обеспечивая активацию различных клеточных программ саногенеза, JAK/STAT/SOCS сигнальный путь играет ключевую роль в развитии и поддержании активности адаптивного иммунного ответа в острую стадию инфекционно-воспалительной патологии, а также в постклиническую фазу
Учитывая недостаточно исследованный вопрос о влиянии SOCS-белков на активность ядерного фактора транскрипции NF-kB и продукцию цитокинов, а также на реактивность иммунокомпетентных клеток в постклиническую стадию инфекционно-воспалительного процесса, целью настоящего исследования явилось изучение взаимосвязи фосфорилирования 1кВа, содержанием в МНК супрессора цитокиновой сигнализации SOCS7, а также продукции клетками отдельных цитокинов, регулирующих иммунный ответ у пациентов, перенесших внеболь-ничную пневмонию.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В соответствии с целью настоящей работы обследовано 30 пациентов мужского пола с бактериальной вне-больничной пневмонией нетяжелого течения на 15-17-е сутки заболевания перед выпиской из стационара, составившие основную группу. Средний возраст обследованных пациентов основной группы составил 25 ± 5,5 лет.
Юонтрольную группу составили 1S практически здоровых молодых лиц из числа доноров крови в возрасте от 20 до 33 лет (средний возраст 26 ± 4,3 года).
Результаты корреляционного анализа указывают на сильную отрицательную взаимосвязь содержания в МНК супрессора цитокиновой сигнализации SOCS? и продукции ИЛ-Iß, что свидетельствует об их способности ограничивать продукцию провоспалительных цитокинов
Mатериалом для исследования служила венозная кровь, забиравшаяся в утренние часы из локтевой вены обследуемых лиц. Для проведения исследования внутриклеточных маркеров 1 мл цельной крови вносили во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM, гепарин (2,5 ЕД/ мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Подготовленные таким образом образцы облучали в течение 4S минут аппаратом микроволновой терапии «Акватон-02» (ООО «ТЕЛЕMАK», г. Саратов), на частоте 1,0 ± 0,025 ГГц (плотность потока энергии S0 нВт/см2) [4, 6].
После облучения флаконы помещались на 3 и 24 часа в термостат при 37 °С с последующим выделением на градиенте фиколл-верографина (p = 1,077) MHK и приготовлением лизатов, для чего использовали 1 мл клеточной суспензии, содержащей 0,5 х 106 MHK. Выделенные таким образом MHK дважды отмывали в фосфатно-соле-вом буфере, после чего лизировали, используя буфер следующего состава: 10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCL, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 10% глицерола, 0,1% SDS, 0,5% деоксихолата, 1 mM PMSF (матричный 0,3 M раствор в DMSO). В лизирующий раствор добавляли (ex temporo) 1% коктейля ингибитора протеаз («Sigma-ALdrich», США), выдерживали на льду (при t = + 4-5 0C) в течение 15 минут. Ядерно-цитоплазматические лизаты центрифугировали в течение 10 минут при 15 000 об/мин, с последующим аликвотированием и замораживанием при -76 °С.
Подсчет клеток и анализ жизнеспособности осуществляли с помощью счетчика TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность клеток подготовленных культур составляла не менее 90%.
Образцы крови подвергали облучению с помощью генератора сигналов HP8664A с использованием излучающей антенны магнитного типа в дальней зоне облучателя, непосредственно перед их помещением в термостат в течение 40 минут. Плотность потока энергии микроволн составляла 0,05 мкВт/см2.
В приготовленных ядерно-цитоплазматических лиза-тах методом иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали уровень фосфорилирования ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB - 1кВа по серину в положении 32 (в относительных единицах на нг белка) и концентрацию супрессора цитокиновой сигнализации - белка SOCS7. В клеточных супернатантах определяли концентрацию ФНОа, KH-1ß, ИЛ-4, ИЛ-12 и ИФНа. При проведении ИФА использовали наборы реактивов Cusabio Biotech
(КНР). Анализ проводили на анализаторе Personal LAB (AdaLtis Italia S.p.A., Италия).
Статистическую обработку проводили в программе Statistica 7.0. Результаты исследования представлены в виде: среднее значение признака (x), медиана (Ме), 25 и 75 процентили выборки (25%; 75%). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий в несвязанных выборках оценивали с помощью U-критерия Манна - Уитни. Взаимосвязь показателей исследовали методом многофакторного линейного регрессионного анализа с пошаговым включением переменных в математическую модель.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования представлены в таблице 1.
Результаты проведенного анализа свидетельствуют о снижении продукции у реконвалесцентов ФНОа на 6,4% (U = 690,0, p = 0,0001), ИЛ-1Р на 1,9% (U = 1500,0, p = 0,58), ИЛ-4 на 25,1% (U = 500,0, p = 0,00001), ИЛ-12 на 0,8% (U = 1571,0, p = 0,87). При этом отмечается повышение секреции ИЛ-10 на 1,8% (U = 1499,0, p = 0,58), ИНФа на 55,4% (U = 0,0, p = 0,000001), SOCS7 на 12,3% (U = 1178,0,
р = 0,019). На этом фоне в основной группе уровень фос-форилирования 1кВа был ниже контрольных значений на 4,9% (и = 974,0, р = 0,0005).
Таким образом, в стадию реконвалесценции ВП имеет место статистически значимое снижение степени фосфо-рилирования 1кВа с повышением содержания в МНК супрессора цитокиновой сигнализации - БОСБ7, ассоциирующееся со снижением продукции ФНОа, ИЛ-4 и повышением уровня ИНФа.
Результаты линейного корреляционного анализа исследованных факторов представлены в таблице 2.
Результаты корреляционного анализа указывают на сильную отрицательную взаимосвязь содержания в МНК супрессора цитокиновой сигнализации БОСБ7 и продукции ИЛ-1Р, что свидетельствует об их способности ограничивать продукцию провоспалительных цитокинов. Вместе с тем взаимосвязь БОСБ7 и ИЛ-10 отличается менее выраженным отрицательным характером. Кроме этого, проведенный анализ выявил сильную положительную взаимосвязь уровня фосфорилирования 1кВа с продукцией ФНОа и ИЛ-12, наблюдающуюся на фоне сильной положительной корреляции между данными цитоки-
Таблица 1. Уровень исследуемых факторов у обследованных больных
Фактор
Контрольная группа
Основная группа
1кВа, ед/нг 0,317 0,307 0,313 0,327 0,301 0,28 0,294 0,324
ФНОа, пг/мл 15,5 14,7 15,3 16,3 14,5 13,7 14,0 14,9
ИЛ-1Р, пг/мл 15,4 12,7 16,1 18,1 15,1 12,5 14,7 17,4
ИЛ-4, пг/мл 3,02 2,69 3,15 3,36 2,26 1,97 2,5 2,56
ИЛ-10, пг/мл 14,3 12,9 13,4 15,7 14,6 12,8 14,1 16,0
ИЛ-12, пг/мл 2,5 2,16 2,62 2,87 2,48 2,15 2,3 2,93
ИНФа, пг/мл 11,6 10,1 11,4 13,1 18,0 15,5 17,2 19,6
SOCS7, нг/мл 0,691 0,554 0,725 0,828 0,776 0,728 0,808 0,866
Таблица 2. Корреляции между исследованными показателями в основной группе
ФНОа 1кВа ИЛ-1Р ИЛ-4 ИЛ-10 ИЛ-12 ИНФа SOCS7
ФНОа - 0,79 0,00 -0,01 -0,41 0,68 0,21 -0,06
kBa 0,79 - -0,24 -0,02 -0,52 0,65 0,18 -0,02
ИЛ-1Р 0,00 -0,24 - 0,59 0,29 0,24 0,01 -0,66
ИЛ-4 -0,01 -0,02 0,59 - 0,28 0,29 0,4 -0,25
ИЛ-10 -0,41 -0,52 0,29 0,28 - -0,58 0,48 -0,38
ИЛ-12 0,68 0,65 0,24 0,29 -0,58 - 0,24 0,16
ИНФа 0,21 0,18 0,01 0,4 0,48 0,24 - 0,16
SOCS7 -0,06 -0,02 -0,66 -0,25 -0,38 0,16 0,16 -
Примечание: полужирным шрифтом выделены коэффициенты корреляции с уровнем значимости (р) менее 0,05.
25%
Me
75%
25%
Me
75%
х
х
