CC BY
21
DOI: 10.23868/201707020
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТОВ ILI/TOLL-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ И NF-KB В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ЧАСТОТОЙ 1 ГГЦ
И.В. Терехов 1, В.С. Никифоров 2, С.С. Бондарь 1, Н.В. Бондарь 3, А.А. Воеводин 4
1 Тульский государственный университет, Тула, Россия
2 Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
3 Орловский государственный университет им. И.С. Тургенева, Орел, Россия
4 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
The effect of low-intensity electromagnetic irradiation with a frequency of 1 GHz on the content of the components of the IL1/TOLL signaling pathway and NF-kB in mononuclear cells of whole blood
I.V. Terekhov1, V.S. Nikiforov2, S.S. Bandar1, N.V. Bondar 3, AA. Voevodin 4 1 Tula State Medical University, Tula, Russia
2North-Western State Medical University n. a. I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
3 Orel State University, Orel, Russia
4 S.K. Kirov Military Medical Academy, Saint-Petersburg, Russia
Сигнальный путь IL1/TOLL и ядерный фактор транскрипции NF-kB играют ключевую роль в защите от патогенных микроорганизмов, поэтому нарушения их функциональной активности под влиянием факторов химической и физической природы (активные формы кислорода, эндо и экзотоксины и т.п.) могут неблагоприятно отражаться на течении патологического процесса. Однако, несмотря на важную роль в обеспечении резистентности организма к инфекциям и саногенезе, значение ILI/TOLL-сигнального пути при бактериальных инфекциях, в том числе в постклиническую фазу, исследовано недостаточно полно. Также не в полной мере охарактеризовано влияние низкоинтенсивных излучений близких по частоте к используемым в радиосвязи стандартам GSM, на содержание в иммунокомпетентных клетках, в частности, мононуклеарах периферической крови (МНК) компонентов сигнального пути, а также ядерного фактора транскрипции NF-kB.
Цель исследования — изучение влияния микроволнового излучения частотой 1ГГц на содержание в МНК практически здоровых лиц и пациентов, перенесших внебольнич-ную пневмонию, компонентов IL-l/TOLL-сигнального пути и ядерного фактора транскрипции NF-kB.
Методом иммуноферментного анализа оценивали содержание в МНК компонентов ядерного фактора транскрипции NF-кВ, протеинкиназ р38, ТАК1, протеинов TRIM25, GADD45A и Bcl-xl, а также продукцию ИЛ-4, ИЛ-12, RANTES, кателицидина и ММП-12 после облучения цельной крови низкоинтенсивным электромагнитным излучением частотой 1 ГГц
Установлено, что в субклиническую фазу у пациентов с внебольничной бактериальной пневмонией (ВП) снижается содержание в МНК компонентов NF-kB, в частности, р50, р65, p52, RelB, IKKa, IKKp, а также уровень фосфо-рилирования kBa. Напротив, уровень с-Rel и IKKy в МНК реконвалесцентов с ВП, превышает значения практически здоровых лиц. Указанные изменения сопровождаются снижением продукции цитокинов ИЛ-4, ИЛ-12, RANTES и кателицидина.
В исследовании показано, что низкоинтенсивное излучение частотой 1 ГГц стимулирует повышение в МНК содержания р65, IKKa, TAK1, TRIM25, а также способствует усилению продукции ИЛ-4, ИЛ-12 и LL37. Кроме того, микроволны оказывают стимулирующее влияние на фосфорилирование терминальной протеинкиназы МАРК/ SAPK-сигнального пути — р38, наиболее выраженное у ре-конвалесцентов ВП.
Таким образом, на постклинической стадии внеболь-ничной пневмонии происходит угнетение функциональной активности ILI/TOLL-сигнального пути и ядерного фактора
e-mail: [email protected]
Signaling pathway IL1/TOLL and the nuclear transcription factor NF-KB plays a key role in the protection against pathogenic microorganisms, therefore, the violation of their functional activity under the influence of the chemical and physical nature (reactive oxygen species, endo and exotoxins, etc.) may adversely affect the course of pathological process. However, despite its important role in ensuring the resistance of the organism to infections and sanogenesis, the value of ILI/TOLL-signaling pathway in bacterial infection, including post-clinical phase, was studied insufficiently. Also not fully characterized the impact of low-intensity radiation close in frequency to those used in radio standards GSM, on the content of immunocompetent cells, particularly peripheral blood mononuclear cells (MNCs) of the components of signaling pathways and nuclear transcription factor NF-KB.The purpose of the study was to evaluate the influence of microwave radiation with a frequency of 1 GHz into the contents in the MNCs of healthy individuals and of patients with community-acquired pneumonia, components of the IL-1/TOLL-signaling pathways and nuclear transcription factor NF-KB.ELISA evaluated the contents in the MNC component of the nuclear transcription factor NF-KB, P38 protein kinases, TAK1, TRIM25 proteins, GADD45A and Bcl-xl, as well as the production of IL-4, IL-12, RANTES, cathelicidin and MMP-12 after exposure to low-intensity electromagnetic radiation with a frequency of 1 GHz on whole blood.Proved that subclinical phase in patients with community-acquired bacterial pneumonia (cap) reduces the content in the OLS components of NF-KB, in particular, P50, P65, p52, RelB, IKKa, IKKp, and the level of kBa phosphorylation. On the contrary, the level of C-Rel and IKKy in the MNC of patients with VP greater than healthy individuals. These changes are accompanied by reduced production of cytokines IL-4, IL-12, RANTES and cathelicidin.The study found that low-intensity radiation of 1 GHz stimulates the increase in the MNC content of P65, IKKa, TAK1, TRIM25, and also contributes to the increased production of IL-4, IL-12 and LL37. In addition, microwaves have a stimulating effect on phosphorylation of the terminal kinase MARK/SAPK-signaling pathway — P38, which is most pronounced at the convalescent EP. Thus, in the post-clinical stage of community-acquired pneumonia is the inhibition of the functional activity of the IL1/TOLL-signaling pathways and nuclear transcription factor NF-KB, which is manifested by reduced production of MNCs cytokines that regulate the adaptive immune response (IL-4, IL-12). Effect on the cells of whole blood by microwaves with frequency of 1GHz is associated with activation of NF-KB, contributing to the increased production of IL-4, IL-12 and cathelicidin with
транскрипции ЫР-кБ, что проявляется снижением продукции МНК цитокинов, регулирующих адаптивный иммунный ответ (ИЛ-4, ИЛ-12). Воздействие на клетки цельной крови микроволнами частотой 1 ГГц сопровождается активацией ЫР-кБ, способствующим повышению продукции ИЛ-4, ИЛ-12 и кателицидина с увеличением содержания в МНК протеинов 9АйП45А и ТР1М25, что обеспечивает нормализацию неспецифической резистентности и иммунологической реактивности у больных ВП.
Ключевые слова: 11_1/Т01_1_-сишальный путь, ЫР-кБ, ТР1М25, микроволны.
the increase in MNK proteins GADD45A and TRIM25, which ensures the normalization of nonspecific resistance and immunological reactivity in patients with pneumonia.
Keywords: IL1/TOLL-signaling pathway, NF-kB, TRIM25, microwave.
Введение
11_-1/Т01_1_-сигнальный путь, играя важную роль в формировании иммунного ответа на внедрение во внутреннюю среду организма разнообразных инфекционных агентов, обеспечивает их рецепцию с последующей активацией механизмов саногенеза [1, 2]. 11_-1/Т01_1_-сигнальный путь инициирует ответ острой фазы, проводя к исполнительному аппарату клетки сигналы от толл-подобных рецепторов (Т1_П), распознающих различные по своей химической природе паттерны патогенности, за счет активации терминальных протеинкиназ МАРК/БАРК-сигнального пути, в частности, р38, Л\1К и ЕЯК [2, 3]. Ведущую роль в передаче сигнала от бактериальных патогенов с Т1_П внутрь клетки играют адапторные протеины Муй88/Т1ПАР, активируя транскрипционный фактор ЫР-кБ, участвующий в реализации программ саногенеза при развитии бактериальной инфекции [3, 4]. Ответ на внутриклеточные патогены, в том числе вирусы и микоплазмы, выступающие, как правило, в ассоциации с бактериальными возбудителями, опосредуется ПЮ-Гсигнальным путем, в котором ключевую регуляторную роль играет протеин ТП1М25 [1, 5, 6]. Общим звеном указанных сигнальных путей, обеспечивающим их перекрестную активацию, является протеинкиназа ТАК1 [7].
Хорошо известно, что воздействие на организм достаточно мощных стрессоров, таких как микроорганизмы, вирусы, а также массивная терапия гормонами коры надпочечников, приводят к дисре-гуляции внутриклеточных молекулярных механизмов саногенеза, в частности, угнетению активности ЫР-кБ с подавлением функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови (МНК), способствуя затяжному течению заболевания или развитию повторной инфекции, определяя необходимость поиска дополнительных факторов, способных восстанавливать активность внутриклеточных сигнальных путей с одновременной нормализацией клеточной реактивности [4, 8, 9].
Одним из таких факторов является низкоинтенсивное электромагнитное излучение (ЭМИ) край-невысокочастотного и сверхвысокочастотного диапазонов [9, 10]. В частности, ЭМИ частотой 1 ГГц, соответствующее частоте колебаний молекул воды, проявляет выраженную биотропную активность, оказывая влияние на пролиферацию и дифференци-ровку фибробластов, а также иммунокомпетентных клеток цельной крови [10, 11]. Кроме того, микроволны частотой 1 ГГц стимулируют продукцию противовирусных интерферонов и отдельных цитокинов, способствуя повышению неспецифической защиты организма, а также усилению адаптивного иммунного ответа [12, 13].
Учитывая актуальность поиска новых факторов регуляции внутриклеточных процессов, целью на-
стоящего исследования являлось изучение влияния микроволнового излучения на частоте резонансной прозрачности водосодержащих сред на содержание в МНК практически здоровых лиц и пациентов, перенесших острый инфекционно-воспалительный процесс нижних отделов респираторного тракта, компонентов IL-l/TOLL-сигнального пути и ядерного фактора транскрипции NF-kB.
Материал и методы
Проведение клинического исследования было одобрено Ученым советом и Локальным этическим комитетом медицинского института ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет» (Протокол № 2 от 01.09.2014). Все пациенты и доноры подписывали информированное согласие.
Материалом для исследования служила венозная кровь, которую забирали в утренние часы (с 7:00 до 7:30) из локтевой вены. В основную (опытную) группу входили 30 пациентов мужского пола (средний возраст — 26±5,2 г.) с бактериальной внебольничной пневмонией нетяжелого течения (60—65 баллов по шкале PORT) на 15—17 сут. заболевания (непосредственно перед выпиской из клиники). Контрольную группу составили 15 практически здоровых доноров крови в возрасте 20—37 лет (средний возраст — 27±6 лет).
Каждый образец крови был разделен на 2 части, и в каждой группе были сформированы 2 подгруппы:
1 и 2. Образцы крови подгрупп 1 не подвергались воздействию микроволн, образцы крови подгрупп 2 — подвергались.
Диагноз пневмонии был верифицирован в соответствии с клиническим рекомендациями [14]. Критериями включения пациентов в исследование являлись: рентгенологическая верификация инфиль-тративных изменений в легких, односторонний сегментарный характер инфильтративных изменений, бактериологическая верификация грамположитель-ных микроорганизмов, являющихся типичными возбудителями пневмонии (s. pneumoniae, s. aureus), а также m. pneumoniae, неосложненное течение заболевания, положительный эффект проводимой терапии (уменьшение объема инфильтративных изменений не менее чем на 2/3 от исходного уровня к моменту выписки из стационара). Все пациенты получали парентеральную антибиотикотерапию цефалоспоринами III поколения (цефотаксим), в среднесуточной дозе
2 г, либо кларитромицином в среднесуточной дозе 1 г, нестероидные противовоспалительные препараты, физиотерапевтическое лечение.
Облучение образцов крови проводили с помощью генератора сигналов HP8664A с использованием излучающей антенны магнитного типа в дальней зоне облучателя, в условиях постоянного перемешивания [15].
В работе использовали наборы для культивирования и митогенной стимуляции клеток цельной крови «Цитокин-Стимул-Бест» (Вектор Бест, Россия). 1 мл цельной крови в стерильных условиях вносили во флакон, содержащий 4 мл поддерживающей среды DMEM, гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Образцы крови подгрупп 2 подвергали воздействию микроволн частотой 1 ГГц плотностью потока мощности 0,05 мкВт/см2 в течение 40 мин., затем все образцы крови помещали в термостат (37°С) и инкубировали в течение 24 ч.
После инкубации из флаконов с образцами крови забирали 1 мл супернатанта для определения концентрации матриксной металлопротеиназы-12 (ММП-12), интерлейкинов (ИЛ) 4 и 12, хемокина, продуцируемого активированными Т-лимфоцитами (RANTES), эндогенного антимикробного пептида — кателицидина (LL37), антиапоптотического протеина Bcl-xl с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Для получения фракции МНК 4 мл клеточной суспензии наслаивали на раствор фиколл-веро-графина (р =1,077, МедБиоСпектр, Россия) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 30 мин. Выделенные МНК дважды отмывали в фосфатно-солевом буфере и 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5х106 клеток, лизировали, используя раствор следующего состава (Sigma-Aldrich, США): 10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl,
1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7,
2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 10% глицерола, 0,1% SDS, 0,5% деоксихолата, 1 mM PMSF (матричный 0,3 М раствор в DMSO). В лизирующий раствор добавляли (ex tempore) 1% коктейля ингибитора протеаз (Sigma-Aldrich, США), выдерживали на льду (при t = +4—5°C) в течение 15 мин., аликво-тировали и замораживали при -76°С.
В полученных лизатах методом ИФА оценивали содержание E3-убиквитин-лигазы TRIM25, проте-инкиназы ТАК1 (MAP3K7), изоформ а, ß, у киназы ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (IKKa, IKKß, IKKy) и уровень субъединиц р65, p50, c-Rel, RelB, NF-kB2 (р52) ядерного фактора транскрипции NF-kB. Кроме того, определяли уровень фосфорилирования по серину в положении 32 ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (kBa), а также уровень фосфорилирования по треонину/тирозину в положении 180/182 митоген-активируемой протеинкиназы р38.
Иммуноферментный анализ проводили на анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия): разрешение фотометрирования не меньше 0,001 ед. оптической плотности (0,03%) и точность измерения оптической плотности не меньше 0,5%.
Для определения исследуемых факторов в лиза-тах МНК использовали наборы реактивов KH00221, KH00071 (Thermo Fisher Scientific, США), CSB-EL024461HU, CSB-EL005420HU, CSB-EL011572HU, CSB-EL01 3429HU, CSB-EL011 574HU, CSB-EL019554HU, CSB-EL009161HU, CSB-EL015760HU (Cusabio Biotech, Китай), EK1111, EK1121, EK4101 (Panomix, США); в клеточных супернатантах — CSB-
E13208h, CSB-E14948h, CSB-EL027199HU (Cusabio Biotech, Китай), BMS287 (Bender Medsystems, Австрия), SEA111Hu (Cloud-Clone, США), MG51042 (IBL, Германия).
Подсчет клеток и анализ их жизнеспособности выполняли на счетчике клеток TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность выделенных МНК превышала 90%.
Статистическую обработку осуществляли с применением программы Statistics 7.0. Результаты исследования представлены в виде: медиана выборки; 25 и 75 процентили (25%, 75%). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий в несвязанных выборках оценивали с помощью U-критерия Манна — Уитни, в связанных — с использованием Т-критерия Уилкоксона.
Результаты и обсуждение
Исходный уровень исследованных факторов в МНК и клеточных супернатантах в образцах необ-лученной крови представлен в табл. 1.
Проведенный анализ межгрупповых различий в необлученных образцах у реконвалесцентов с ВП и практически здоровых лиц свидетельствует о статистически значимом снижении содержания протеина р50 в основной группе, в сравнении с группой контроля, на 18,4%, RelB на 13,2%, NF-kB2 на 33,3%, IKKa на 29,0%, IKKp на 3,8%, сопровождавшимся уменьшением фосфорилирования kBa на 29,0%. На этом фоне в основной группе, в сравнении с группой контроля, имело место повышение концентрации IKKy на 11,1%, c-Rel на 18,3%, GADD45A на 25,3%, а также отмечалась тенденция к повышению уровня протеинкиназы р38 на 5,9%, протекавшая на фоне статистически значимого снижения в МНК уровня Bcl-xl на 25,0%.
В клеточном супернатанте основной группы, в сравнении с контрольной группой, отмечено статистически значимое снижение концентрации ИЛ-12 на 11,6%, ИЛ-4 на 21,5%, RANTES на 6,1%, на фоне тенденции к сокращению продукции эндогенного антимикробного пептида LL37 на 11,6%. Указанные изменения сопровождались повышенным уровнем ММП-12 на 21,6%.
Выявленные нарушения свидетельствуют о повышении содержания в МНК реконвалесцентов с вне-больничной пневмонией компонентов МАРК/SAPK-сигнального пути и снижении отдельных субъединиц ядерного фактора транскрипции NF-kB, ассоциированном со снижением продукции клетками ИЛ-4, ИЛ-12 и RANTES. Пониженная продукция указанных цитокинов, очевидно, является следствием угнетения адаптивного иммунного ответа за счет снижения функциональной активности Т-хелперов 1 и 2 типов, являющихся основными продуцентами соответствующих медиаторов [8, 12].
Результаты воздействия на клетки крови низкоинтенсивного электромагнитного излучения частотой 1 ГГц представлены в табл. 2.
Оценка различий исследуемых показателей в подгруппах 2 основной и контрольной групп, подвергнутых воздействию низкоинтенсивных микроволн частотой 1ГГц, представлена в табл. 3.
Таблица 1. Исходное содержание исследованных факторов в МНК и клеточных супернатантах (результаты представлены как медиана (Me), нижний (25%) и верхний (75%) квартили)
Фактор
Контрольная группа (подгруппа № 1)
Основная группа (подгруппа № 1)
Ме 25% 75% Ме 25% 75%
IкBa, ед/нг 1,07 0,605 1,495 0,76 0,63 1,17 p<0,001
p38, ед/нг 1,705 1,66 1,86 1,805 1,69 1,915 p = 0,68
TRIM25, нг/мл 0,8 0,65 1,015 0,81 0,6 1,0 P = 0,9
нг/мл 0,733 0,663 0,814 0,677 0,436 0,711 p = 0,021
^р, нг/мл 0,582 0,475 0,679 0,56 0,347 0,649 p = 0,0001
нг/мл 0,461 0,437 0,496 0,512 0,436 0,644 p = 0,011
TAK1, нг/мл 1,052 0,974 1,105 1,038 1,003 1,181 p = 0,91
p50, нг/мл 0,859 0,734 0,907 0,701 0,629 0,765 p<0,001
p65, нг/мл 0,736 0,682 0,813 0,709 0,667 0,873 p = 0,25
RelB, нг/мл 0,75 0,727 0,759 0,651 0,626 0,686 p = 0,016
c-Rel, нг/мл 0,47 0,447 0,479 0,529 0,453 0,547 p<0,001
NF-кB2, нг/мл 0,403 0,3 0,554 0,269 0,269 0,824 p = 0,09
ММП-12, нг/мл 0,855 0,765 0,865 1,04 0,75 1,24 p<0,001
LL37, нг/мл 7,34 6,28 8,66 6,49 5,79 7,12 P=0,1
RANTES, пг/мл 0,313 0,307 0,326 0,294 0,28 0,323 p<0,001
ИЛ-4, пг/мл 3,115 2,675 3,315 2,445 1,935 2,545 p = 0,87
ИЛ-12, пг/мл 2,585 2,115 2,825 2,285 2,105 2,905 p=0,87
Bcl-xl, нг/мл 0,66 0,57 0,82 0,495 0,415 0,61 p<0,001
GADD45A, нг/мл 0,447 0,39 0,606 0,56 0,343 0,688 p<0,001
р — статистическая значимость различий исследованных факторов у реконвалесцентов с ВП и практически здоровых лиц.
р
Таблица 2. Содержание исследованных факторов в МНК и клеточных супернатантах после воздействия микроволн частотой 1 ГГц (результаты представлены как медиана (Me), нижний (25%) и верхний (75%) квартили)
Контрольная группа Основная группа
Фактор (подгруппа № 2) (подгруппа № 2)
Ме 25% 75% Ме 25% 75%
ед/нг 1,08 0,608 1,501 0,763 0,633 1,18
p38, ед/нг 1,974 1,922 2,154 2,683 2,512 2,846
TRIM25, нг/мл 0,891 0,724 1,13 0,884 0,655 1,091
нг/мл 0,767 0,694 0,852 0,722 0,465 0,758
^р, нг/мл 0,59 0,48 0,685 0,566 0,351 0,657
нг/мл 0,466 0,446 0,501 0,519 0,442 0,652
TAK1, нг/мл 1,144 1,061 1,202 1,109 1,072 1,262
p50, нг/мл 0,866 0,743 0,914 0,707 0,635 0,772
p65, нг/мл 0,744 0,692 0,821 0,724 0,681 0,892
RelB, нг/мл 0,755 0,735 0,764 0,654 0,628 0,689
c-Rel, нг/мл 0,474 0,457 0,483 0,533 0,456 0,551
NF-кB2, нг/мл 0,406 0,307 0,558 0,271 0,271 0,83
ММП-12, нг/мл 0,99 0,886 1,002 1,115 0,804 1,329
LL37, нг/мл 7,598 6,501 8,965 6,831 6,095 7,495
RANTES, пг/мл 0,316 0,312 0,329 0,296 0,282 0,325
ИЛ-4, пг/мл 3,215 2,761 3,421 2,525 1,998 2,628
ИЛ-12, пг/мл 2,675 2,19 2,923 2,32 2,137 2,949
Bcl-xl, нг/мл 0,661 0,572 0,821 0,502 0,421 0,619
GADD45A, нг/мл 0,457 0,41 0,619 0,567 0,347 0,696
Таблица 3. Различия исследуемых показателей в подгруппах основной группы и группы контроля, подвергнутых облучению (результаты в % представлены как медиана (Me), нижний (25%) и верхний (75%) квартили)
Контрольная группа (подгруппа № 2) Основная группа (подгруппа № 2) Фактор -
Ме 25% 75% р Ме 25% 75% р
ед/нг 0,39 0,5 0,4 0,053 0,4 0,5 0,9 0,051
p38, ед/нг 15,8 15,8 15,8 0,005 48,6 48,6 48,6 0,002
TRIM25, нг/мл 11,4 11,4 11,3 0,02 9,1 9,2 9,1 0,002
нг/мл 4,6 4,7 4,7 0,02 6,6 6,7 6,6 0,002
^р, нг/мл 1,4 1,1 0,9 0,034 0,89 1,2 1,2 0,12
нг/мл 1,1 2,1 1,0 0,12 1,4 1,4 1,2 0,037
TAK1, нг/мл 8,7 8,9 8,8 0,02 6,8 6,9 6,9 0,002
p50, нг/мл 0,8 1,2 0,8 0,06 0,9 1,0 0,9 0,055
p65, нг/мл 1,1 1,5 1,0 0,002 2,1 2,1 2,2 0,002
RelB, нг/мл 0,7 1,1 0,7 0,064 0,5 0,3 0,4 0,07
c-Rel, нг/мл 0,9 2,2 0,8 0,034 0,8 0,7 0,7 0,034
NF-кB2, нг/мл 0,7 2,3 0,7 0,034 0,8 0,7 0,7 0,002
ММП-12, нг/мл 15,8 15,8 15,8 0,001 7,2 7,2 7,2 0,002
LL37, нг/мл 3,5 3,5 3,5 0,002 5,3 5,3 5,3 0,002
RANTES, пг/мл 1,0 1,6 0,9 0,015 0,7 0,7 0,6 0,051
ИЛ-4, пг/мл 3,2 3,2 3,2 0,002 3,3 3,3 3,3 0,002
ИЛ-12, пг/мл 3,5 3,5 3,5 0,002 1,5 1,5 1,5 0,02
Bcl-xl, нг/мл 0,2 0,4 0,1 0,21 1,4 1,4 1,5 0,004
GADD45A, нг/мл 2,2 5,1 2,1 0,003 1,2 1,2 1,2 0,006
р — статистическая значимость различий исследованных факторов в крови у реконвалесцентов с ВП и практически здоровых лиц под влиянием микроволн (отношение показателей в образцах крови, подвергнутых облучению и необлученных).
Проведенный анализ последствий однократного воздействия на клетки цельной крови низкоинтенсивными микроволнами частотой 1 ГГц выявил повышение в группе реконвалесцентов ВП уровня фосфорилирования протеинкиназы р38, определяющей, в том числе, активность фактора транскрипции АР-1. На этом фоне уровни протеинкиназы ТАК1 и ЕЗ-убиквитин-лигазы ТШМ25 более значимо повышались у практически здоровых лиц.
Кроме того, было обнаружено, что в основной группе содержание каталитической субъединицы протеинкиназы ингибитора ядерного фактора транскрипции — 1ККа, обеспечивающей фосфорилирова-ние ингибитора ядерного фактора ЫР-кБ, а также !ККу, регулирующего активность комплекса, возрастало более существенно, чем в группе контроля. Напротив, уровень !ККр под влиянием облучения повышался несколько больше у практически здоровых лиц. Указанные изменения сопровождались близкими значениями динамики фосфорилирования !кБ в обеих подгруппах, определяя соответствующее изменение транскрипционной активности ЫР-кБ.
Также было доказано, что микроволны оказывают определенное влияние на продукцию клетками ци-токинов и эффекторных факторов саногенеза, экспрессия генов которых контролируется факторами транскрипции ЫР-кВ и АР-1. Проведенный анализ показал, что микроволны стимулируют повышение содержания в клетке антиапоптотического белка — Бс1-х1, уровень которого в облученных образцах крови основной группы возрастал более существенно,
чем в группе контроля, определяя торможение программ апоптоза и аутофагии МНК у обследованных больных. На этом фоне уровень □Айй45А у практически здоровых лиц оказался более чувствительным к воздействию низкоинтенсивных микроволн, чем у реконвалесцентов ВП.
Таким образом, микроволны частотой 1 ГГц изменяют содержание в МНК ключевых компонентов, обеспечивающих регуляцию адаптивного иммунного ответа и неспецифической клеточной резистентности. Стимулируя фосфорилирование протеинкиназ р38 и !кБ, микроволны способствуют нормализации активности 11_-1/Т01_1_-сигнального пути и продукции цитокинов, регулирующих адаптивный иммунный ответ [6, 7, 12]. Кроме того, облучение стимулирует продукцию клетками эндогенного антимикробного пептида — 1_1_37 и фактора ремоделирования межклеточного матрикса — ММП-12, повышая неспецифическую клеточную резистентность, активируя репаративные процессы в тканях, способствуя разрешению инфильтративных изменений [4, 16, 17]. Оказывая стимулирующее влияние на процессы, контролируемые фактором транскрипции ЫР-кБ, под воздействием микроволн в клетках повышается содержание протеина □Айй45А, обеспечивающего коррекцию генотоксических проявлений инфекционного процесса, а также усиление неспецифической клеточной резистентности [18].
Проведенный анализ последствий воздействия на клетки цельной крови низкоинтенсивных микроволн частотой 1 ГГц показал, что облучение оказывает
более выраженное влияние на уровень отдельных факторов в группе реконвалесцентов ВП, в сравнении с практически здоровыми лицами. Так, у пациентов, перенесших пневмонию, значительно изменялся уровень фосфорилирования р38, 1кВа, а также содержание протеинов TRIM25 и Bcl-xl, протеинкина-зы IKKa, субъединицы p65 фактора транскрипции NF-кВ. Указанные изменения сопровождались более существенным повышением продукции ИЛ-4 и кателицидина, отражающим усиление гуморального звена иммунологической реактивности клеток цельной крови. При этом повышение содержания TRIM25 в МНК реконвалесцентов ВП свидетельствует об усилении противовирусной защиты под влиянием микроволн. Являясь одним из ключевых компонентов RIG-I-сигнальной системы, обеспечивающей распознавание проникших в цитозоль чужеродных нуклеиновых кислот, TRIM25 участвует в защите клетки от таких патогенов, как вирус гриппа, являющимся актуальным возбудителем суперинфекции у больных ВП.
Анализ потенциальных биофизических механизмов формирования эффектов электромагнитного излучения (ЭМИ) резонансных частот, свидетельствует в пользу гипотезы первичной рецепции ЭМИ молекулами воды, связанными с биологически активными молекулами, с трансформацией и переносом энергии микроволн на биомолекулы с последующим изменением их биохимической активности [10]. Указанный эффект сопровождается модификацией межмолекулярных взаимодействий, модулирующих биохимические процессы в клетке [19].
Выявленные эффекты, в частности, изменение содержания в МНК отдельных компонентов NF-кВ, сравнительно невелики по абсолютному уровню, тем не менее, надежно регистрируются при использовании количественного иммуноферментного анализа, отличающегося высокой чувствительностью. Данное обстоятельство свидетельствует в пользу физиологичного характера воздействия низкоинтенсивных микроволн на внутриклеточные молекулярные системы. Каскадный механизм активации эффек-торных факторов позволяет клетке реагировать на единичные молекулярные сигналы, многократное усиление которых компонентами сигнальных путей, в том числе протеинкиназами МАРК/SAPK-сигнального пути, обеспечивает формирование клеточного ответа необходимой направленности и силы [3, 4, 7, 14, 20]. При этом однократное воздействие ЭМИ, приводящее к изменению уровня фосфорили-рования ингибитора kBa на 0,3—0,4%, определяю-
ЛИТЕРАТУРА:
1. Алямкина Е.А., Долгова Е.В., Проскурина А.С. и др. Внутриклеточные системы обнаружения экзогенных нуклеиновых кислот и механизмы запуска иммунных реакций в ответ на интер-нализацию экзогенной ДНК. Медицинская иммунология 2013; 5: 413-30.
2. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 2010; 11(5): 373-84.
3. Zarubin T., Han J. Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway. Cell Res. 2005; 15(1): 11.
4. Quinton L.J., Jones M.R., Simms B.T. et al. Functions and regulation of nf-kappab rela during pneumococcal pneumonia. J. Immunol. 2007; 178(3): 1896-903.
5. Stack J., Doyle S.L., Connolly D.J. et al. TRAM is required for TLR2 endosomal signaling to type I IFN induction. J. Immunol. 2014; 193(12): 6090-102.
щее соответствующее повышение активности NF-кВ, сопровождается изменением продукции цитокинов и эффекторных молекул иммунного ответа, отличающимся на порядок от изменений содержания регуля-торных молекул.
Заключение
Фаза реконвалесценции острого инфекционно-воспалительного процесса нижних отделов респираторного тракта при ВП отличается повышенным уровнем в МНК фактора c-Rel, регуляторной субъединицы IKKy и протеина GADD45A, и пониженным содержанием р50, RelB, р52, IKKa, IKKß, Bcl-xl и фосфорилированной формы kBa. Кроме того у реконвалесцентов ВП, в сравнении с практически здоровыми лицами, отмечается снижение продукции ИЛ-4 и RANTES и увеличение секреции ММП-12.
Указанные изменения протекают наряду с повышением содержания в МНК фосфорилированной формы протеинкиназы р38, свидетельствующим в пользу активации МАРK/SAPK-сигнального пути у реконвалесцентов ВП [4]. Подобные изменения продукции цитокинов и внутриклеточных компонентов отражают угнетение адаптивного иммунного ответа вследствие дисрегуляции молекулярных процессов в МНК, ассоциирующихся с постклинической стадией инфекционно-воспалительного процесса, что может привести к развитию у таких пациентов реин-фекции и суперинфекции нижних отделов респираторного тракта, а также определять склонность к затяжному и атипичному течению заболевания [21].
На этом фоне воздействие на клетки цельной крови низкоинтенсивного ЭМИ частотой 1 ГГц способствует повышению уровня фосфорилирования р38 и kBa, стимулирует увеличение содержания в клетке протеинов TRIM25 и Bcl-xl, протеинкина-зы IKKa, субъединицы р65 фактора транскрипции NF^B, повышая продукцию цитокинов и эндогенных антимикробных пептидов [12, 13, 16, 17].
Полученные результаты позволяют рассматривать низкоинтенсивное ЭМИ частотой 1 ГГц в качестве фактора физической природы, который может оказывать модулирующее влияние на активность внутриклеточных сигнальных путей и обладает-имму-ностимулирующим действием [12, 13]. Микроволны частотой 1 ГГц способствуют усилению неспецифической защиты, репарации, ускорению ремодели-рования и обновления внеклеточного матрикса, в том числе, за счет повышения исходно сниженной активности ядерного фактора транскрипции NF^B [10, 11].
6. Gack M.U., Shin Y.C., Joo C.H. et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature 2007; 446(7138): 916-20.
7. Omori E., Matsumoto K., Sanjo H. et al. TAK1 is a master regulator of epidermal homeostasis involving skin inflammation and apoptosis. J. Biol. Chem. 2006; 281(28): 19610-7.
8. Raphael I., Nalawade S., Eagar T.N. et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine 2015; 74(1): 5-17.
9. Sinitsyn N.I., Yolkin V.A., Gulyaev Yu.V. et al. Special function of the «millimeter wavelength waves - aqueous medium» system in nature. Critical Reviews in Biomedical Engineering 2000; 28(1-2): 269-305.
10. Petrosyan V.I. Resonance RF Emission from Water. Technical Physics Letters 2005; 31(12): 1007-8.
11. Sunkari V.G., Aranovitch B., Portwood N. et al. Effect of low-intensity electromagnetic field on fibroblast migration and proliferation. Electromagnetic Biology and Medicine 2011; 30(2): 80-5.
12. Солодухин К.А., Никифоров В.С., Бондарь С.С. и др. Влияние низкоинтенсивного СВЧ-облучения на внутриклеточные процессы в мононуклеарах при пневмонии. Медицинская иммунология 2012; 14(6): 541-4.
13. Терехов И.В., Бондарь С.С., Хадарцев А.А. Лабораторное определение внутриклеточных факторов противовирусной защиты при внебольничной пневмонии в оценке эффектов низкоинтенсивного СВЧ-излучения. Клиническая лабораторная диагностика 2016; 61(6): 380-4.
14. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С. и др. Вне-больничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2010; 12(3): 186-225.
15. Терехов И.В., Хадарцев А.А., Бондарь С.С. Состояние рецеп-торзависимых сигнальных путей в агранулоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии под влиянием микроволнового излучения. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2016; 93(3): 23-8.
16. Pomerantz J.L., Baltimore D. NF-kappaB activation by a signaling complex containing TRAF2, TANK and TBK1, a novel IKK-related kinase. EMBO J. 1999; 18(23): 6694-704.
17. Millet P., McCall C., Yoza B. RelB: an outlier in leukocyte biology. Journal of Leukocyte Biology 2013; 94(5): 941-51.
18. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В. и др. Геноток-сические поражения и болезни. Молекулярная медицина 2013; 3: 3-19.
19. Галль Л.Н., Галль H.P. Механизм межмолекуляpной пеpедачи энеpгии и воcпpиятия cвеpxcлабыx воздействий химиче^ими и биолог/пегими ^стемами. Биофизика 2009; 54(3): 563-74.
20. Потехина Е.С., Надеждина Е.С Митоген-активируемые про-теинкиназные каскады и участие в них Ste20-подобных протеинки-наз. Успехи биологической химии 2002; 42: 235-56.
21. Лебедева М.Н., Грищенко А.В. Особенности течения повторных внебольничных пневмоний у военнослужащих по призыву. Военно-медицинский журнал 2009; 330(7): 24-8.
Поступила: 28.08.2016
