Научная статья на тему 'РОЛЬ РЕАКТИВНОЙ ГЛИИ В МОДУЛЯЦИИ НЕЙРО- И СИНАПТОГЕНЕЗА IN VITRO'

РОЛЬ РЕАКТИВНОЙ ГЛИИ В МОДУЛЯЦИИ НЕЙРО- И СИНАПТОГЕНЕЗА IN VITRO Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
199
28
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГИППОКАМП / НЕЙРОГЕНЕЗ / ЛИПОПОЛИСАХАРИД / НЕЙРОВОСПАЛЕНИЕ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Виноградова Анна Вячеславовна, Тучина Оксана Павловна

Введение. Активация глиальных клеток липополисахаридом (ЛПС) приводит к выделению провоспалительных цитокинов и развитию нейровоспаления, что, в свою очередь, влияет на процессы нейро- и сипнаптогенеза. Однако конкретные механизмы нейроглиальных и астроцит-микроглиальных взаимодействий в этих процессах остаются предметом дискуссии. Цель исследования. Изучение роли микроглии в приобретении астроцитами реактивного фенотипа in vitro, а также влияния ЛПС и астроцит-кондиционированной среды на нейро- и синаптогенез гиппокампальных нейронов in vitro методами иммуноцитохимии. Методы. Исследование проводили на глиальных и нейрональных культурах клеток гиппокампа крысы. ЛПС добавляли к чистой культуре астроцитов и смешанной глиальной культуре в концентрации 1 и 10мкг/мл на 6,12 и 24 ч. После этого клетки фиксировали, окрашивали глиальные культуры на астроцитарный маркер GFAP. К культуре нейронов гиппокампа добавляли ЛПС в концентрации 10мкг/мл на 6 и 12 ч, а также астроцит-кондиционированную среду, затем клетки фиксировали и окрашивали на маркер пролиферации клеток Ki67, пресинаптический (Syn1) и постсинаптические (PSD95) белки. Результаты. Количество GFAP увеличилось в смешанной глиальной культуре через 6 и 12 ч инкубации с ЛПС, в культуре астроцитов экспрессия GFAP, напротив, снижается. Добавление к нейронам ЛПС и астроцит-кондиционированной среды привело к снижению пролиферации клеток и увеличению количества постсинаптического белка PSD95, в то время как количество Syn1 изменилось только в случае добавления ЛПС непосредственно к нейронам. Заключение. В нашем исследовании показано, что астроциты in vitro приобретают характерный реактивный фенотип только в присутствии микроглиальных клеток, о чем свидетельствует увеличение количества GFAP. Астроциты, инкубированные с ЛПС, способны модулировать пролиферацию нейронов и процессы синаптогенеза in vitro.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Виноградова Анна Вячеславовна, Тучина Оксана Павловна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ROLE OF REACTIVE GLIA IN MODULATION OF NEUROAND SYNAPTOGENESIS IN VITRO

Introduction. Activation of glial cells by lipopolysaccharide leads to the release of proinflammatory cytokines and the development of neuroinflammation, which, in turn, affects the processes of neuro- and synaptogenesis. However, the specific mechanisms of neuroglial and astrocytemicroglial interactions in these processes remain the subject of discussion. Aim of the study. Our aim was to study the role of microglia in the acquisition of a reactive phenotype by astrocytes in vitro, and the effect of lipopolysaccharide and astrocyte-conditioned medium on the neuro- and synaptogenesis of hippocampal neurons in vitro by immunocytochemistry methods. Methods. The study was carried out on glial and neuronal cell cultures from rat hippocampus. Lipopolysaccharide was added to mixed glial culture and pure astrocyte culture at concentrations of 1 and 10 μg/ml for 6, 12 and 24 hours. The cells were then fixed, stained for astrocytic marker GFAP. Lipopolysaccharide at a concentration of 10 μg/ml at 6 and 12 hours, as well as an astrocyte-conditioned medium were added to the culture of hippocampal neurons which were later fixed and stained for the marker of cell proliferation Ki67, presynaptic (Syn1) andpostsynaptic (PSD95) proteins. Results. The number of GFAP increased in mixed glial cultures after 6 and 12 h of incubation with lipopolysaccharide; in astrocyte culture, GFAP on the contrary, decreased. The addition of lipopolysaccharide and astrocyte-conditioned medium to neurons led to a decrease in cell proliferation and an increase in the amount of postsynaptic protein PSD95, while the amount of Syn1 changed only in case when lipopolysaccharide was added directly to neurons. Conclusion. In our work it was determined that astrocytes acquire a characteristic reactive phenotype only in the presence of microglial cells in vitro, as evidenced by an increase in the amount of GFAP. Astrocytes incubated with lipopolysaccharide are capable of modulating neuronal proliferation and synaptogenesis processes in vitro.

Текст научной работы на тему «РОЛЬ РЕАКТИВНОЙ ГЛИИ В МОДУЛЯЦИИ НЕЙРО- И СИНАПТОГЕНЕЗА IN VITRO»

© А.В. Виноградова, О.П. Тучина, 2021 https://doi.org/10.29296/24999490-2021-06-10

РОЛЬ РЕАКТИВНОЙ ГЛИИ В МОДУЛЯЦИИ НЕЙРО- И СИНАПТОГЕНЕЗА IN VITRO

А.В. Виноградова, О.П. Тучина

ФГАОУ ВО «БФУ им. Иммануила Канта», лаборатория синтетической биологии, Институт живых систем, Российская Федерация, 236041, Калининград, ул. Университетская, д. 2 E-mail: [email protected]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Виноградова Анна Вячеславовна — магистрант Института живых систем БФУ им. Иммануила Канта. Тел.: +7 (906) 23261-97. E-mail: [email protected]. ORCID: 0000-0003-4825-458X

Тучина Оксана Павловна — зав. лабораторией синтетической биологии Института живых систем БФУ им. Иммануила Канта. Кандидат биологических наук, доцент. Тел.: +7 (905) 247-50-63. E-mail: [email protected]. ORCID: 0000-0003-1480-1311

Введение. Активация глиальных клеток липополисахаридом (ЛПС) приводит к выделению провоспалительных цитокинов и развитию нейровоспаления, что, в свою очередь, влияет на процессы нейро- и сипнаптогенеза. Однако конкретные механизмы нейроглиальных и астроцит-микроглиальных взаимодействий в этих процессах остаются предметом дискуссии.

Цель исследования. Изучение роли микроглии в приобретении астроцитами реактивного фенотипа in vitro, а также влияния ЛПС и астроцит-кондиционированной среды на нейро- и синаптогенез гиппокампальных нейронов in vitro методами имму-ноцитохимии.

Методы. Исследование проводили на глиальных и нейрональных культурах клеток гиппокампа крысы. ЛПС добавляли к чистой культуре астроцитов и смешанной глиальной культуре в концентрации 1 и 10мкг/мл на 6,12 и 24 ч. После этого клетки фиксировали, окрашивали глиальные культуры на астроцитарный маркер GFAP. К культуре нейронов гиппокампа добавляли ЛПС в концентрации 10мкг/мл на 6 и 12 ч, а также астроцит-кондиционированную среду, затем клетки фиксировали и окрашивали на маркер пролиферации клеток Ki67, пресинаптический (Syn1) и постсинаптические (PSD95) белки.

Результаты. Количество GFAP увеличилось в смешанной глиальной культуре через 6 и 12 ч инкубации с ЛПС, в культуре астроцитов экспрессия GFAP, напротив, снижается. Добавление к нейронам ЛПС и астроцит-кондиционированной среды привело к снижению пролиферации клеток и увеличению количества постсинаптического белка PSD95, в то время как количество Syn1 изменилось только в случае добавления ЛПС непосредственно к нейронам.

Заключение. В нашем исследовании показано, что астроциты in vitro приобретают характерный реактивный фенотип только в присутствии микроглиальных клеток, о чем свидетельствует увеличение количества GFAP. Астроциты, инкубированные с ЛПС, способны модулировать пролиферацию нейронов и процессы синаптогенеза in vitro.

Ключевые слова: гиппокамп, нейрогенез, липополисахарид, нейровоспаление

ROLE OF REACTIVE GLIA IN MODULATION OF NEURO- AND SYNAPTOGENESIS IN VITRO

A.V. Vinogradova, O.P. Tuchina

Immanuel Kant Baltic Federal University, Laboratory for Synthetic biology, School of Life Sciences, ul. Universitetskaya, 2, Kaliningrad, 236041, Russian Federation E-mail: [email protected]

INFORMATION ABOUT THE AUTHORS

Vinogradova Anna Vyacheslavovna — Master student School of Life Sciences, Immanuel Kant Baltic federal University. Tel.: +7 (906) 232-61-97. E-mail: [email protected]. ORCID: 0000-0003-4825-458X

Tuchina Oksana Pavlovna — head of laboratory for Synthetic biology, School of Life Sciences, Immanuel Kant Baltic federal University. PhD, docent. Tel.: +7(905) 247-50-63. E-mail: [email protected]. ORCID: 0000-0003-1480-1311

Introduction. Activation of glial cells by lipopolysaccharide leads to the release of proinflammatory cytokines and the development of neuroinflammation, which, in turn, affects the processes of neuro- and synaptogenesis. However, the specific mechanisms of neuroglial and astrocytemicroglial interactions in these processes remain the subject of discussion.

Aim of the study. Our aim was to study the role of microglia in the acquisition of a reactive phenotype by astrocytes in vitro, and the effect of lipopolysaccharide and astrocyte-conditioned medium on the neuro- and synaptogenesis of hippocampal neurons in vitro by immunocytochemistry methods.

Methods. The study was carried out on glial and neuronal cell cultures from rat hippocampus. Lipopolysaccharide was added to mixed glial culture and pure astrocyte culture at concentrations of 1 and 10 ^g/ml for 6, 12 and 24 hours. The cells were then fixed, stained for astrocytic marker GFAP. Lipopolysaccharide at a concentration of 10^g/ml at 6 and 12 hours, as well as an astrocyte-conditioned medium

were added to the culture of hippocampal neurons which were later fixed and stained for the marker of cell proliferation Ki67, presynaptic (Syn1) and postsynaptic (PSD95) proteins.

Results. The number of GFAP increased in mixed glial cultures after 6 and 12 h of incubation with lipopolysaccharide; in astrocyte culture, GFAP on the contrary, decreased. The addition of lipopolysaccharide and astrocyte-conditioned medium to neurons led to a decrease in cell proliferation and an increase in the amount of postsynaptic protein PSD95, while the amount of Syn1 changed only in case when lipopolysaccharide was added directly to neurons.

Conclusion. In our work it was determined that astrocytes acquire a characteristic reactive phenotype only in the presence of microglial cells in vitro, as evidenced by an increase in the amount of GFAP. Astrocytes incubated with lipopolysaccharide are capable of modulating neuronal proliferation and synaptogenesis processes in vitro.

Key words: hippocampus, neurogenesis, lipopolysaccharide, neuroinflammation

ВВЕДЕНИЕ

Глиальные клетки играют ключевую роль в поддержании гематоэнцефалического барьера, регулируют региональный кровоток, обеспечивают трофическую, антиоксидантную и метаболическую поддержку нейронов, участвуют в синаптической передаче и локальных иммунных реакциях, а также регулируют синапто- и нейрогенез [1]. Астроциты и микроглия характеризуются региональной гетерогенностью экспрессии маркеров [2], а также фено-типическими преобразованиями клеток в ответ на патоген- и травма-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs и DAMPs) в нервной ткани [3]. Так, в ответ на интраперитонеальное введение липо-полисахарида (ЛПС), компонента клеточной стенки грамотрицательных бактерий, происходит активация макрофагов и выделение провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли-a (TNFa), ин-терлейкинов (IL)-ip и -6, которые детектируются афферентными окончаниями блуждающего нерва, а также эндотелиальными и глиальными клетками области area postrema, запуская холинергический противовоспалительный путь [4]. Небольшое количество ЛПС способно проникать через гематоэн-цефалический барьер (например, в циркумвентри-кулярных органах) и, возможно, непосредственно воздействовать на клетки нервной ткани [5]. Активация микроглиальных клеток ЛПС и(или) медиаторами воспаления приводит к поляризации микро-глии по типу М1, выделению провоспалительных цитокинов и развитию нейровоспаления [6], что, в свою очередь, модулирует процессы нейро- и синап-тогенеза в мозге [7, 8]. Однако конкретные механизмы нейроглиальных и астроцит-микроглиальных взаимодействий в этих процессах остаются предметом дискуссии. Так, Liddelow и соавт. (2017) предложена модель, согласно которой активированная микроглия стимулирует преобразование астроцитов в нейротоксический фенотип А1 [9], что подтверждается исследованиями You и соавт. (2017) [10].

Целью нашего исследования было изучить роль микроглии в приобретении астроцитами реактивного фенотипа в культуре клеток, а также проанализировать влияние ЛПС и астроцит-кон-диционированной среды на нейро- и синаптогенез гиппокампальных нейронов in vitro методами имму-ноцитохимии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Животные

Для приготовления культур клеток гиппокампа использовали 3-дневных крыс линии Wistar. Животных содержали в стандартных условиях вивария при световом режиме 12/12, доступе к корму и воде ad libitum. Эксперименты проводили в соответствии с этическими правилами работы с животными («Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» приказ Министерства здравоохранения РФ» от 01.04.2016 №199н и European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123).

Клеточные культуры

В работе использовали реактивы для приготовления клеточных культур от Thermo Fisher Scientific (США), реактивы для гистологии от Sigma Aldrich (США), антитела для иммуногистохимии (ИГХ) и среду для приготовления препаратов от Abcam (Великобритания). Смешанные глиальные и астроци-тарные культуры готовили по протоколу Tamashiro и соавт. [11]. Культуры выращивали в культуральных флаконах T-75 в среде DMEM с фетальной бычьей сывороткой (FBS) до плотности покрытия 80%, затем клетки рассаживали в 6-луночные планшеты на стекла, покрытые полилизином. Подготовку культуры нейронов проводили по протоколу Beaudoin и соавт. [12]. Нейроны в течение 2 нед. выращивали в 6-луночных планшетах на стеклах, покрытых полилизином. Для индуцирования воспаления использовали ЛПС E. coli (026:B6, Sigma-Aldrich, США). ЛПС добавляли непосредственно в лунки планшета к гли-альным/нейрональным клеткам в концентрации 1 и 10 мкг/мл, а также использовали астроцит-кондици-онированную среду. Для приготовления астроцит-кондиционированной среды использовали астроци-ты в флаконах T-75 со средой DMEM без FBS, куда добавляли ЛПС в концентрации 10 мкг/мл, через 6 и 12 ч среду от астроцитов забирали и добавляли к ней-рональной культуре на 12 ч.

Иммуногистохимическое окрашивание

Глиальные клетки фиксировали спустя 6, 12 и 24 ч, нейрональные — спустя 12 ч в растворе 4% параформальдегида, промывали 3 раза натрий-фосфатным буфером (pH 7,4) и затем проводили ИГХ

окрашивание антителами на маркеры астроцитов (глиальный кислый фибриллярный белок GFAP), нейронов (PSD95, Synapsin I) и маркер пролиферации Ki67. После промывания натрий-фосфатным буфером к культурам добавляли 5% FBS с 0,3% Triton X и оставляли на шейкере на 1 сут. Затем 5% FBS заменяли на 1% FBS и добавляли первичные антитела. После инкубации с первичными антителами в течение 1 сут клетки промывали 3 раза натрий -фосфатным буфером и инкубировали в течение 10 ч со вторичными антителами, конъюгированны-ми с флуоресцентными метками Alexa488/555/647. После инкубации со вторичными антителами клетки промывали 3 раза натрий-фосфатным буфером и делали препараты с использованием заливочной среды Fluoroshield с DAPI для визуализации клеточных ядер.

Конфокальная и флуоресцентная микроскопия

Препараты сканировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM780 (Zeiss, Германия) с использованием ультрафиолетового (355 нм) и гелий-неоновых (543, 633 нм) лазеров и настройкой соответствующих каналов, с использованием объектива х20, а также фотографировали на флуоресцентном микроскопе AxioImager (Zeiss, Германия) с

использованием флуоресцентной лампы и фильтров для БАР1, GFP, ёБКеё.

Анализ данных и статистика

Для анализа количества пролиферирующих нейронов проводили подсчет Ю67+-клеток, в остальных случаях определяли уровень флуоресценции с использованием протокола для анализа изображений в программном обеспечении ImageJ. Статистическую обработку данных для полученных значений скорректированной интенсивности флуоресценции проводили в Past3 и РЯ1БМ8. Проверка на нормальность распределения — с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, определение статистической значимости — многофакторный анализ АКОУА с последующим тестом Тьюки или критерием Манна—Уитни. Статистически значимыми считали следующие значения: * — р<0,05; ** — р<0,01; *** — р<0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе интенсивности флуоресценции GFAP+-астроцитов в смешанной глиальной культуре (в присутствии микроглии) обнаружено, что количество GFAP не изменяется в случае инкубации культуры с 1 мкг/мл ЛПС в течение 6 ч, в то время как при инкубации с 10 мкг/мл ЛПС в течение того

Рис. 1. Интенсивность флуоресценции GFAP+ астроцитов в смешанной культуре астроцитов и микроглии (a) и чистой культуре астроцитов (б) в контроле и при добавлении ЛПС 1 и 10мкг/мл на 6, 12 и 24 ч. Значения представлены как среднее значение ±SE, Для А n=20 для контроля, n=40 для инкубации с ЛПС 1 мкг/мл в течение 24 ч, n=30 для остальных экспериментальных групп. Для (Б) n=20 для контроля, n=30 для инкубации с ЛПС 10мкг/мл в течение 6 и 24 ч и 1мкг/мл в течение 12 ч, n=35для инкубации с ЛПС 10мкг/мл в течение 12 ч, n=40 для инкубации с ЛПС 1 мкг/мл в течение 6 и 24 ч. ANOVA; критерий Манна—Уитни Примечание. * -p<0,05; ** -p<0,01; *** -p<0,001.

Fig. 1. The fluorescence intensity of GFAP + astrocytes in a mixed culture of astrocytes and microglia (а) and in a pure

culture of astrocytes (b) in the control and after addition of 1 and 10 ng/ml LPS for 6, 12 and 24 hours. The values are

presented as mean value ±SE, For A n=20for control, n=40for incubation with LPS 1 ng/mlfor 24 hours, n=30

for the rest of the experimental groups. For (B( n=20 for control, n=30 for incubation with LPS 10 ng/ml for 6 and 24 hours

and 1 ng/ml for 12 hours, n=35 for incubation with LPS 10ng/ml for 12 hours, n=40 for incubation with 1 ng/ml LPS

for 6 and 24 hours. ANOVA; Mann-Whitney test

Note. * -p<0,05; ** -p<0,01; *** -p<0,001.

же времени — статистически значимо увеличивается по сравнению с контролем. Также наблюдалось увеличение интенсивности флуоресценции GFAP+-астроцитов при инкубации с 1 и 10 мкг/мл ЛПС в течение 12 ч. Спустя 24 ч после инкубации с ЛПС значимых изменений в интенсивности флуоресценции GFAP не наблюдалось (рис. 1а). При анализе интенсивности флуоресценции GFAP+-астроцитов в чистой культуре обнаружено, что количество GFAP уменьшилось при инкубации с ЛПС в концентрации 1 и 10 мкг/мл в течение 12 ч. При этом спустя 6 и 24 ч изменений не произошло (рис. 1б). Согласно исследованиям, увеличение экспрессии GFAP является типичным признаком патологии центральной нервной системы и используется для идентификации реактивных астроцитов [13]. GFAP является астроцит-специфичным промежуточным филаментом, поэтому его количество и распределение в клетке может служить показателем фенотипи-ческого статуса астроцита, а также, возможно, и его функционального состояния. Полученные данные согласуются с результатами исследований о повышении уровня GFAP при реактивном глиозе. Увеличение интенсивности флуоресценции GFAP в смешанной глиальной культуре и, наоборот, снижение в чистой культуре астроцитов свидетельствует о ключевой роли микроглии в приобретении астроцитами реактивного фенотипа, по крайней мере in vitro. Показано, что основные изменения в количестве GFAP в ответ на ЛПС происходят в течение первых 6—12 ч, а спустя 24 ч после стимуляции уровень GFAP возвращается к контрольным значениям и астроциты, вероятно, возвращаются в состояние покоя. Следует отметить, что in vitro, а также in vivo в мозге грызунов присутствуют популяции как GFAP+, так и GFAP--астроцитов. GFAP- астроциты также способны фе-нотипически изменяться под воздействием ЛПС, однако мы не учитывали эту популяцию в наших исследованиях.

Так как статистически значимые изменения GFAP наблюдались только в случае инкубации гли-альной культуры с ЛПС в течение 6 и 12 ч, эти временные точки были выбраны для анализа пролифе-ративной активности в культуре нейронов. Анализ количества Ю67+-клеток в культуре нейронов показал, что добавление ЛПС в концентрации 10 мкг/мл на 6 ч не повлияло на их пролиферацию, однако, спустя 12 ч наблюдалось уменьшение количества Ki67+-клеток. Известно, что нейроны экспрессируют TLR4 и реагируют на стимуляцию ЛПС выделением хемо-кинов RANTES и CXCL1, а также фактора некроза опухолей (TNFa) и IL-6 in vitro [14]. В зависимости от концентрации TNFa может оказывать как стимулирующее действие на пролиферацию нервных стволовых клеток, так и вызывать их апоптоз, в то время как IL-6 стимулирует нейро- и глионегез [8].

Однако основным источником интерлейкинов, в том числе IL-6, в мозге являются глиальные клетки. Известно, что при активации микроглиальных

Рис. 2. Влияние ЛПС и астроцит-кондиционированной среды на пролиферацию (а) и синаптогенез (б, в) в культуре нейронов гиппокампа. а — количество пролифери-рующих нейронов в культуре (%), идентифицированных с помощью ИГХокраски на маркер пролиферации Ki67. б — интенсивность флуоресценции нейронов, ИГХ окрашенных на маркер Synapsin1. в — интенсивность флуоресценции нейронов, ИГХ окрашенных на маркер PSD95. Значения представлены как среднее значение ±SE. ANOVA; критерий Манна—Уитни Примечание. * -p<0,05; ** -p<0,01; *** -p<0,001. Fig. 2. Influence of LPS and astrocyte-conditioned medium on proliferation (а) and synaptogenesis (b, c) of cultured hippocampal neurons. а — the number of proliferating neurons in culture (%) identified by immunohistochemical staining for the proliferation marker Ki67. b — intensity of fluorescence of neurons immunohistochemically stained for the Synapsin1. c — fluorescence intensity of neurons immunohistochemically stained for the PSD95. Values are presented as mean ±SE. ANOVA; Mann—Whitney test Note. * -p<0,05; ** -p<0,01; *** -p<0,001.

клеток ЛПС они выделяют IL-6, который стимулирует экспрессию геп-сидина астроцитами, а это в свою очередь способствует нарушению метаболизма железа и гибели нейронов [10]. В нашем исследовании добавление к нейронам среды, в которой культивировались астроциты, активированные 10 мкг/мл ЛПС в течение 6 ч (астроцит-кондициониро-ванная среда), значительно снизило пролиферативную активность нейронов (рис. 2а, 3б). Использование астроцит-кондиционированной среды позволило исключить вероятность физических взаимодействий между нейронами и клетками глии. Таким образом, активированные ЛПС астроциты также способны выделять сигнальные молекулы, регулирующие уровень нейрогенеза в условиях развития воспалительной реакции.

Анализ интенсивности флуоресценции нейронов, ИГХ окрашенных на маркер синапсов, пресинап-тический белок Synapsin 1, показал, что при добавлении к нейрональ-ной культуре ЛПС в концентрации 10 мкг/мл на 6 ч количество синап-сина увеличивается, однако спустя 12 ч наблюдается его уменьшение. Добавление DMEM и астроцит-кон-диционированной среды не вызывали изменений в уровне синапсина (рис. 2б, 3в). При анализе препаратов нейрональной культуры было обнаружено, что относительная интенсивность флуоресценции при окрашивании на маркер постсинаптического белка PSD95 значительно увеличилась при культивировании нейронов на астроцит-кондиционированной среде с добавлением 10 мкг/мл ЛПС на 12 ч (рис. 2в, 3г). Значительной разницы в интенсивности флуоресценции в экспериментальных группах нейрональных культур, к которым добавляли ЛПС, чистую среду для культивирования глии (DMEM), а также среду, кондиционированную неактивированными астроцитами, не наблюдалось. Увеличение количества постсинаптического белка (PSD95) при добавлении к нейронам астроци-тарной культуры, инкубированной с ЛПС, может говорить о том, что реактивные астроциты способствуют формированию синапсов, т.е. синап-тогенезу.

Контроль А+М ЛПС 12 ч А ЛПС 12 ч

a (a) W GFAP V V GFAP V

Контроль ЛПС 12 ч АКС-ЛПС 6 ч

б (b) DAPI К!67 V V DAPI Ki67 DAPI Ki67 V

Контроль ЛПС 6 ч ЛПС 12 ч

в (с) DAPI Syn1 ss \ ■ - r '" • - v; ■T-- у . ">1 DAPI Synl _ J* * ■

Контроль ЛПС 12 ч АКС-ЛПС 12 ч

г (d) DAPI PSD95 V V DAPI " PSD95 V — V DAPI V V - V

Рис. 3. Микрофотографии культуры глиальных клеток (а) и нейронов гиппокампа (б—г). а — ОЕАР+-астроциты в смешанной глиаль-ной (А+М) и чистой астроцитарной (А) культуре клеток. Белыми стрелками указаны отдельные астроциты. б — пролиферация в культуре нейронов гиппокампа. Белыми стрелками показаны Ki67+-пролиферирующие клетки. АКС — астроцит-кондиционированная среда. в, г: Синаптогенез в культуре нейронов гиппокампа, окрашенных антитела к маркерам пре- и постсинаптический белков Synapsinl и PSD95 соответственно. Белыми стрелками указаны скопления постсинаптического белка PSD95. Окрашивание ядер клеток — DAPI. Масштаб — 50 ^м

Fig. 3. Micrographs of the cultured glial cells (a) and hippocampal neurons (b—d). A — GFAP+ astrocytes in mixed glial (A+M) and pure astrocytic (A) cell cultures. Individual astrocytes are indicated by white arrows. b — рroliferation of hippocampal neurons in culture. White arrows indicate Ki67+-proliferating cells. AKC is an astrocyte-conditioned medium. c and d: Synaptogenesis in the hippocampal neuronal culture stained with antibodies to pre- and postsynaptic proteins Synapsinl and PSD95, respectively. White arrows indicate the clusters of the postsynaptic protein PSD95. Staining of cell nuclei — DAPI. Scale — 50/m

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В случае добавления ЛПС к смешанной глиаль-ной культуре количество GFAP в астроцитах увеличивалось, что свидетельствует о ключевой роли ми-кроглии в приобретении астроцитами реактивного фенотипа, по крайней мере, in vitro. Также стоит отметить, что основные изменения в количестве GFAP происходят в течение первых 6—12 ч, а спустя 24 ч количество GFAP возвращается к контрольным значениям.

В нейрональной культуре инкубация с ЛПС в течение 12 ч приводила к снижению количества Ki67+-клеток. Добавление к нейрональной культуре среды от реактивных астроцитов, инкубированных с ЛПС в течение 6 ч, привело к снижению пролиферации нейронов. Таким образом, активированные ЛПС астро-циты способны выделять сигнальные молекулы, регулирующие уровень нейрогенеза в условиях развития воспалительной реакции. Увеличение количества постсинаптического белка (PSD95) при добавлении к

нейронам астроцитарной культуры, инкубированной с ЛПС, может говорить о том, что реактивные астро-циты способствуют синаптогенезу.

Таким образом, нейровоспаление, вызванное ЛПС, модулирует не только пролиферацию нейронов, но и процессы синаптической пластичности in vitro, однако, роль глиальных клеток в этих процессах

неоднозначна и требует дальнейших исследований.

* * *

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований №20-015-00470 «Роль микроРНК в регуляции IL-10-индуцируемого нейрогенеза во взрослом мозге».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Ben Haim L., Rowitch D.H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 2016; 18 (1): 31-41. https://doi.org/10.1038/ nrn.2016.159.

2. Тучина О.П., Адамовская С.С. Региональная гетерогенность астроцитов в отношении экспрессии глиального фибриллярного кислого белка и синтетазы глутамина in vitro. Современные проблемы науки и образования. 2020; 2: 158-62. https://doi. org/10.17513/spno.29751

[Tuchina O.P., Adamovskaya S.S. Regional heterogeneity of astrocytes in respect to glial fibrillary acidic protein and glutamine synthetase in vitro. Modern problems of science and education. 2020; 2: 158-62. https://doi.org/10.17513/spno.29751 (in Russian)].

3. Franco R., Fernandez-Suarez D. Alternatively activated microglia and macrophages

in the central nervous system. Progress in Neurobiology. 2015; 131: 65-86. https://doi. org/10.1016/j.pneurobio.2015.05.003.

4. Тучина О.П. Нейро-иммунные взаимодействия в холинергическом противовоспалительном пути. Гены и клетки. 2020; XV (1): 23-8. https://doi. org/10.23868/202003003

[Tuchina O.P. Neuro-immune interactions in cholinergic anti-inflammatory pathway. Genes and Cells. 2020; XV (1): 23-8. https:// doi.org/10.23868/202003003 (in Russian)].

5. Banks W.A., Robinson S.M. Minimal penetration of lipopolysaccharide across the murine blood-brain barrier. Brain Behav Immun. 2009; 24 (1): 102-9. https://doi. org/10.1016/j.bbi.2009.09.001.

6. Патлай Н.И., Сотников Е.Б., Курилова

Е.А., Тучина О.П. Ранние изменения реактивного профиля глиальных клеток гиппокампа мыши в ответ на липополисахарид. Современные проблемы науки и образования. 2020; 6: 136-9. https://doi.org/10.17513/spno.30310 [Patlay N.I., Sotnikov E.B., Kurilova E.A., Tuchina O.P. Early changes in the reactive profile of mouse hippocampal glial cells in response to lipopolysaccharide. Modern problems of science and education. 2020; 6: 136-9. https://doi.org/10.17513/ spno.30310 (in Russian)].

7. Сотников Е.Б., Патлай Н.И., Николаева А.Ю., Тучина О.П. Экспрессия глиальных маркеров, цитокинов и маркеров нейрогенеза в гиппокампе мыши при старении и в ответ на липополисахарид. Молекулярная медицина. 2021; 19 (3): 38-43. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-03-06

[Sotnikov E.B., Patlay N.I., Nikolaeva A.Y., Tuchina O.P. Expression of glial markers, cytokines and markers of neurogenesis in the mouse hippocampus during aging and in response to lipopolysaccharide. Molekulyarnaya meditsina 2021; 19 (3): 38-43. https:// doi.org/10.29296/24999490-2021-03-06 (in Russian)].

8. Патлай Н.И., Сотников Е.Б., Тучина О.П. Роль микроглиальных цитокинов в модуляции нейрогенеза во взрослом мозге. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2020; 5: 15-23. https://doi. org/10.17513/mjpfi.13062

[Patlay N.I., Sotnikov E.B., Tuchina O.P. The role of microglial cytokines in the modulation of neurogenesis in the adult brain. International journal of applied and funda-

mental studies. 2020; 5: 15-23. https://doi. org/10.17513/mjpfi.13062 (in Russian)].

9. Liddelow S.A., Guttenplan K.A., Clarke L.E., Bennett F.C., Bohlen C.J., Schirmer L., Bennett M.L., Munch A.E., Chung W.-S., Peterson T.C., Wilton D.K., Frouin A., Napier B.A., Panicker N., Kumar M., Buckwalter M.S., Rowitch D.H., Dawson V.L., Dawson T.M., Stevens B., Barres B.A. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 2017; 541: 481-7. https:// doi.org/10.1038/nature21029.

10. You L.-H., Yan C.-Z., Zheng B.-J., Ci Y.-Z., Chang S.-Y., Yu P., Gao G.-F., Li H.-Y., Dong T.-Y., Chang Y.-Z. Astrocyte hepcidin is a key factor in LPS-induced neuronal apoptosis. Cell Death Dis. 2017; 8: e2676. https://doi. org/10.1038/cddis.2017.93.

11. Tamashiro T.T., Dalgard C.L., Byrnes K.R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis Exp. 2012; 2: e3814. https://doi. org/10.3791/3814.

12. Beaudoin G.M.J., Lee S.-H., Singh D., Yuan Y., Ng Y.-G., Reichardt L.F., Arikkath J. Cultur-ing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 2012; 7: 1741-54. https://doi. org/10.1038/nprot.2012.099.

13. Middeldorp J., Hol E.M. GFAP in health and disease. Progress in Neurobiology. 2011; 421-43. https://doi.org/10.1016/j.pneuro-bio.2011.01.005.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

14. Leow-Dyke S., Allen C., Denes A., Nilsson O., Maysami S., Bowie A.G., Rothwell N.J., Pinteaux E. Neuronal Toll-like receptor

4 signaling induces brain endothelial activation and neutrophil transmigration in vitro. J. Neuroinflammation. 2012; 9: 230-5. https://doi.org/10.1186/1742-2094-9-230.

Для цитирования: Виноградова А.В., Тучина О.П. Роль реактивной глии в модуляции нейро- и синаптогенеза in vitro. Молекулярная медицина. 2021; 19 (6): 59-64. https://doi.org/10.29296/24999490-2021-06-10

Поступила 26 июля 2021 г.

For citation: Vinogradova A.V., Tuchina O.P. Role of reactive glia in modulation of neuro- and synaptogenesis in vitro. Molekulyarnaya meditsina. 2021; 19 (6): 59-64 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2021-06-10

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.