Морфофункциональные закономерности развития нейронных сетей в диссоциированных культурах клеток гиппокампа

Широкова О.М.; Фрумкина Л.Е.; Ведунова М.В.; Митрошина Е.В.; Захаров Ю.Н.; Хаспеков Л.Г.; Мухина И.В.

ІЬНЬІЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ 1НЫХ СЕТЕЙ ВАННЫХ КУЛЬТУРАХ ІОКАМПА

О.М. Широкова, аспирант кафедры нейродинамики и нейробиологии1;

Л.Е. Фрумкина, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории ультраструктуры и цитохимии мозга Отдела исследований мозга2;

М.В. Ведунова, к.б.н., старший научный сотрудник проблемной научной группы клеточных технологий НИИ ПФМ3;

Е.В. Митрошина, младший научный сотрудник проблемной научной группы клеточных технологий НИИ ПФМ3;

Ю.Н. Захаров, к.ф.-м.н., доцент кафедры общей физики1;

Л.Г. Хаспеков, д.б.н., зав. лабораторией экспериментальной нейроцитологии Отдела исследований мозга2;

И.В. Мухина, д.б.н., профессор, зав. ЦНИЛ НИИ ПФМ3; зав. кафедрой нормальной физиологии3;

профессор кафедры нейродинамики и нейробиологии1, сотрудник лаборатории по исследованию матрикса мозга1

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского — Национальный исследовательский

университет, Н. Новгород, 603950, проспект Гагарина, 23;

2Научный центр неврологии Российской академии медицинских наук, Москва, 125367, Волоколамское шоссе, д. 80;

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603005, пл. Минина и Пожарского, 10/1

Цель исследования — изучение закономерностей морфофункционального развития нейронных сетей, формируемых длительно культивируемыми клетками гиппокампа.

Материалы и методы. Методом электронной микроскопии исследованы ультраструктурные характеристики развивающихся межклеточных контактов в нейронной сети, формируемой культивируемыми клетками гиппокампа 18-дневных эмбрионов мыши, в сопоставлении с динамикой функциональной сетевой активности нейронов, оцениваемой по параметрам мультиклеточного флюоресцентного Са2+-имиджинга. Параллельно иммуноцитохимическим методом определяли изменения количественного соотношения и взаиморасположения культивируемых нейронов и глиальных клеток.

Результаты. В первичной диссоциированной культуре клеток гиппокампа к 3-4-й неделе in vitro происходит постепенное формирование зрелых синаптических контактов, что коррелирует с усложнением Са2+-активности нейронов сети. К этому времени отдельные нейроны располагаются равномерным монослоем в окружении многочисленных глиальных клеток. Полученные данные отражают морфофункциональные закономерности различных этапов развития культуры как биологической модели онтогенеза нейронных сетей in vitro.

Ключевые слова: первичные диссоциированные культуры гиппокампа; нейронные сети; синаптогенез; электронная микроскопия; Са2+-имиджинг.

English

Morphofunctional Patterns of Neuronal Networks Developing in Dissociated Hippocampal Cell Cultures

О.М. shirokova, Postgraduate, the Department of Neurodynamics and Neurobiology1;

Lf. Frumkina, PhD, Leading Research Worker, Laboratory of Brain Ultrastructure and Cytochemistry, Brain Research Department2;

Для контактов: Широкова Олеся Михайловна, тел. моб. +7 920-054-51-52; e-mail: shirokovaom@gmail.com

/ту/ттту/тттттту/ттту/ттту/тттттту/ттту/тттттту/тттултттту/тттулту/' 6 СТМ J 2013 — 5(2) О.М. Широкова, Л.Е. Фрумкина, М.В. Ведунова, Е.В. Митрошина, Ю.Н. Захаров, Л.Г. Хаспеков, ...

М.V. Vedunova, PhD, Senior Research Worker, the Scientific Problem Group of Cell Technologies,

Scientific Research Institute of Applied and Fundamental Medicine3;

Е.V. Mitroshina, Junior Research Worker, the Scientific Problem Group of Cell Technologies, Scientific Research Institute of Applied and Fundamental Medicine3;

Y.N. Zakharov, PhD, Associate Professor, the Department of General Physics1;

L.G. Khaspekov, D.Bio.Sc., Head of Laboratory of Experimental Neurocytology, Brain Research Department2;

I.V. Mukhina, D.Bio.Sc., Professor, Head of Central Scientific Research Laboratory of Scientific Research Institute of Applied and Fundamental Medicine3; Head of the Department of Normal Physiology3; Professor of the Department of Neurodynamics and Neurobiology1; Researcher of the Brain Matrix Research Laboratory1

1Nizhny Novgorod State University named after N.I. Lobachevsky — National Research University, Gagarin Avenue, 23,

Nizhny Novgorod, Russian Federation, 603950;

Scientific Centre of Neurology of Russian Academy of Medical Sciences, Volokolamskoye Road, 80, Moscow,

Russian Federation, 125367;

3Nizhny Novgorod State Medical Academy, Minin and Pozharsky Square, 10/1, Nizhny Novgorod, Russian Federation, 603005

The aim of investigation was to study the morphofunctional patterns of neuronal network developing in primary long-term hippocampal cell cultures.

Materials and Methods. The ultrastructural features of developing intercellular contacts in neuronal network formed by cultured hippocampal cells of 18 day-old mouse embryos were studied. The sequence of ultrastructural development of these contacts was compared with dynamics of functional network neuronal activity estimated by parameters of multicellular fluorescent Ca2+-imaging. At the same time the changes of quantitative interrelation and positional relationship of neurons and glial cells were immunocitochemically determined.

Results. In primary hippocampal cell culture at 3th—4st weeks in vitro the gradual formation of mature synaptic contacts correlates with appearence of complex Ca2+ neuronal network activity. In this period individual neurons forms a uniform monolayer distributed among numerous glial cells. Thus the results obtained reflect morphofunctional patterns of different stages of cultural development as a biological model of neuronal network ontogenesis.

Key words: primary dissociated hippocampal cultures; neuronal networks; synaptogenesis; electron microscopy; Ca2+-imaging.

Формирование нейронных сетей — одно из проявлений пластичности развивающейся нервной системы в норме и патологии, поэтому вопрос морфофункционального развития головного мозга является центральным как в нейробиологии, так и в медицине. Нарушение межклеточных контактов в онтогенезе приводит впоследствии к развитию патологических нейронных сетей, лежащих в основе изменения психических функций мозга, формирования эпилепсии и многих других заболеваний центральной нервной системы.

Для исследования различных аспектов функционирования и строения головного мозга существует ряд биологических моделей: поведенческие модели in vivo, переживающие срезы мозга, культуры ткани и диссоциированных клеток различных структур ЦНС и т.д. Одной из наиболее адекватных моделей для исследования закономерностей межклеточных взаимодействий и формирования нормальных и/или патологических межнейронных и нейроглиальных связей в процессе их развития являются первичные диссоциированные культуры, в которых процессы жизнедеятельности нейронов и глиальных клеток становятся доступными для наблюдения и манипуляций. Кроме того, при низкой клеточной плотности культур исследование локализации и миграции различных клеток в процессе развития нейронных сетей упрощается. Наконец, данная модель позволяет проводить хронические эксперименты в течение длительного времени (до года и более) [1, 2].

В настоящее время хорошо изучены особенности развития культур клеток гиппокампа: морфологические изменения клеточных элементов [3-5], синаптоге-нез [6, 7], динамика экспрессии определенных типов

рецепторов [8], изменение характера электрической активности [9]. Однако, поскольку комплексные исследования морфофункционального состояния клеток эмбрионального гиппокампа в процессе их длительного культивирования не проводились, характер корреляции ультраструктурных изменений формирующихся межнейронных связей с динамикой их функциональной активности остается неясным.

Цель исследования — изучение закономерностей морфофункционального развития диссоциированных клеток эмбрионального гиппокампа при длительном культивировании.

Материалы и методы. Развитие нейронных сетей в процессе культивирования оценивалось по функциональным характеристикам Са2+-имиджинга, клеточному составу формирующейся нейроглиальной сети и ультраструктуре межклеточных контактов.

Диссоциированные культуры гиппокампа. Объектом исследования служили диссоциированные культуры клеток гиппокампа 18-дневных эмбрионов мышей линии СВА. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в приказе Минздрава России от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Гиппокамп механически измельчали, после чего обрабатывали 0,25% трипсином (Invitrogen, США). Для приготовления культур суспензию клеток, полученную путем ферментативной и механической диссоциации, наносили на покрытые опорным субстратом (полиэтиленимином, Sigma, США) покровные стекла (по 40 мкл суспензии на стекло), помещенные в чашки Петри диаметром

35 мм. В каждую чашку вносили по 1 мл нейробазаль-ной среды Neurobasal™ (Invitrogen), содержащей 2% биоактивной добавки В27 (Invitrogen), 2 мМ L-глутамина (Invitrogen) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия). Через сутки для дальнейшего культивирования использовали среду с меньшим содержанием сыворотки (0,5%). Смену среды проводили через день. Культуры содержали в СО2-инкубаторе (5% СО2, 95% воздуха), при температуре 35,5°С. В экспериментах использовали культуры на 5, 7, 10, 14, 21 и 30-й день in vitro (DIV).

Кальциевый имиджинг. Мониторинг функциональной активности осуществляли путем измерения динамики концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) с использованием специфического флюоресцентного кальциевого красителя Oregon Green BAPTA-1 АМ (Invitrogen) и конфокального лазерного микроскопа Zeiss LSM 510 (Германия). Регистрацию изменения интенсивности флюоресценции красителя в ответ на повышение [Ca2+]i осуществляли при частоте смены кадров 4 с-1. По полученным сериям изображений строили графики временной зависимости интенсивности флюоресценции для каждой клетки в поле зрения (рис. 1), определяли частоту и длительность Са2+-осцилляций, а также число спонтанно осциллирующих клеток. По форме Са2+-осцилляций с помощью программного обеспечения, реализованного на базе MATlab, выявляли природу осциллирующих клеток, что позволяло в дальнейшем анализировать динамику [Ca2+]i только в нейронах.

Иммуноцитохимия. Для цитологической характеристики и определения качественного и количественного клеточного состава культур их фиксировали в ледяном метиловом спирте и иммуноцитохимически маркировали глию глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP), а нейроны — ядерным белком NeuN (Invitrogen). Первичные антитела (Abcam) с GFAP визуализировали с помощью вторичных антикуриных антител, связанных с флюоресцентным маркером Cy5 (Millipor, США) (максимальное значение коэффици-

ента поглощения — на длине волны 650 нм, излучения — 670 нм). Для визуализации первичных антител к ядерному белку NeuN использовали вторичные ан-тимышиные антитела с флюоресцентным маркером Alexa 430 (Invitrogen) (максимальное значение коэффициента поглощения — на длине волны 434 нм, излучения — 539 нм). Исследования проводили на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510. Коэффициент соотношения нейронов и глии рассчитывали как отношение количества нейронов к проценту площади, занимаемой глиальными клетками. Значения представлены в усл. ед. в расчете на мм2.

Электронная микроскопия. Для ультраструктурных исследований культуры последовательно фиксировали в глутаровом альдегиде (2,5%) на фосфатном буфере (рН=7,4) и в четырехокиси осмия (1%), обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, обрабатывали смесью 100% этилового спирта с ЭПОН-812 без катализатора (1:1) в течение 1 ч, заключали в ЭПОН-812 без катализатора на 10 ч и, наконец, в ЭПОН-812 с катализатором (42,7% ЭПОН-812, 43,2% DDSA, 14,2% MNA, 2% DMP). Ультратонкие срезы готовили на уль-тратоме ULTRACUT (Reichert-Jung, Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FIE, Нидерланды).

Методы статистики. Полученные данные изменения флюоресценции красителя Oregon Green BAPTA-1 АМ, отражающие динамику [Ca2+]i (частоту и длительность Са2+-осцилляций), выражали в виде среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (m). Достоверность статистических различий выборок определяли с помощью непараметрического теста Манна-Уитни, статистически значимыми считали различия выборок при р<0,05.

Результаты. Иммуноцитохимическое исследование выявило изменения во взаимном расположении и количественном соотношении нейронов и глиальных клеток в процессе развития культур. На 5-й день in vitro в толще монослоя нейронов идентифицировались немногочисленные дифференцированные глиальные клетки с

Рис. 1. Графики изменения абсолютной интенсивности флюоресценции Oregon Green BARTA-1 AM во времени на разных стадиях развития; масштаб по горизонтали — 20 с, по вертикали — 20 усл. ед.

уттттштхтттттттттш!ттттштхтттттттттш!ттттш!тттттш!ттят' 8 СТМ j 2013 — 5(2) О.М. Широкова, Л.Е. Фрумкина, М.В. Ведунова, Е.В. Митрошина, Ю.Н. Захаров, Л.Г. Хаспеков, ...

простой формой отростков (рис. 2, а-в). К 10-му дню нейроны уже не образовывали сплошной монослой, а распределялись среди множества глиальных элементов с более сложной формой отростков (рис. 2, г-е). На 14-й и 21-й день в культурах преобладали глиальные клетки, а отдельные нейроны располагались равномерно редким монослоем (рис. 2, ж-м).

Первые Са2+-осцилляции, отражающие изменения [Са2+]і, были зарегистрированы уже на 5-й DIV, но только в 1% нейронов (рис. 3, в), и характеризовались низкой частотой (0,012±0,003 Гц) и большой длительностью (12,00±1,64 с) (рис. 3, а, б). На 7-10-й день частота осцилляций незначительно возрастала (до 0,030±0,007 Гц), а их длительность снижалась (до 8,00±0,55 с). Для 14-го DIV было характерно резкое уменьшение длительности осцилляций (до 3,7±0,2 с) и увеличение их частоты (до 0,14±0,03 Гц), а число нейронов, в которых наблюдались спонтанные осцилляции, повышалось до 54% (рис. 3, а, б, в). На 21-й DIV Са2+-осцилляции по длительности и частоте статистически не отличались от 14-го DIV (рис. 3, а, б), однако их рисунок изменялся: среди возникающих спонтанно одиночных изменений [Са2+] с частотой 0,17±0,02 Гц и дли-

тельностью 3,40±0,17 с появлялись «суперосцилляции» длительностью 42,00±5,36 с и частотой 0,010±0,003 Гц, состоящие из большого числа одиночных осцилляций с частотой 0,20±0,02 Гц.

К 30-му дню обнаруживались только «суперосцилляции», отличавшиеся по своему паттерну от наблюдаемого на 21-й DIV: их длительность снижалась до 7,00±0,65 с, а частота повышалась до 0,090±0,006 Гц наряду с повышением частоты одиночных Са2+-сиг-налов в составе «суперосцилляций» до 0,32±0,04 Гц. Кроме того, общее число активных нейронов на 30-й DIV возрастало до 92%.

Ультраструктурный анализ культур на 5-й DIV выявил в нейропиле вакантные постсинаптические уплотнения и преобладание незрелых (десмосомовидных, щелевидных и симметричных) авезикулярных соединений, формирующих нетипичные для зрелого мозга дендродендритные (рис. 4, а, б), соматосоматические (рис. 4, в) и соматодендритные (рис. 4, г) контакты, способные в этот период развития синапсов проводить электрические сигналы. На 7-й DIV десмосомы, локализованные на одном протяжении с симметричным или асимметричным соединением, формировали сме-

Рис. 2. Флюоресцентные изображения диссоциированных культур гиппокампа на 5-й (а, б, в), 10-й (г, д, е), 14-й (ж, з, и) и 21-й (к, л, м) день развития in vitro. Глиальные клетки маркируются первичными антителами к GFAP (а, г, ж, к), ядра нейронов — антителами к ядерному белку NeuN (б, д, з, л); масштаб — 50 мкм

s

З'

а

о

'аз

О

50-

40

30

20

10-

0-

I 'і і і

5 7

10 14 21 21 30

День развития in vitro

0.40 0.35 0.30 0,250.20-

î

сС

О

ce O.IO

і—

£ O.0G

ce

:r ü.OO

S

о

a

я

7 10 14 2' 21 21 ЗС 30

День развития in vitro

б

День развития in vitro

« *

*

а

в

г

Рис. 3. Графики зависимости длительности (а) и частоты (б) на разных временны 1х этапах развития гиппокампальных культур in vitro: сиреневый цвет — среднее значение для осцилляций, светло-зеленый — для суперосцилляций, темно-зеленый — для осцилляций внутри «суперосцилляций»; в — число работающих клеток и г — коэффициент соотношения нейрон/глия на разных временных интервалах развития плотных гиппокампальных культур in vitro; * — p<0,05; ** — p<0,001

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

т

Д

f

■Г

Фил

Д >

x-.-M

-

Цит

Рис. 4. Электронограммы десмо-сомовидных дендродендритных (а, б), соматосоматических (в) и сома-тодендритных (г) авезикулярных контактов (показаны стрелками). 5 □IV. Масштаб — 1 мкм. Здесь и далее: Ак — аксон; Д — дендрит; Фил — филоподия; Цит — цитоплазма; Ш — шипик; ша — шипи-ковый аппарат; Я — ядро; сп — синаптические пузырьки

шанные контакты (рис. 5), представляющие собой промежуточную стадию развития химического синапса. Первые зрелые химические синапсы в этот период развития культур были как асимметричными аксодендрит-ными (рис. 5, б), так и симметричными, в том числе ак-сошипиковыми (рис. 5, г), в которых пресинаптические терминали содержали многочисленные синаптические пузырьки. Через 2 нед культивирования в нейропиле еще присутствовали смешанные контакты (рис. 6, а), но появлялись типичные симметричные (тормозные) аксосоматические (рис. 6, в) и многочисленные асимметричные (возбуждающие) зрелые синапсы, основную

популяцию которых составляли аксошипиковые контакты (рис. 6, г). Кроме того, начинали формироваться перфорированные синапсы (рис. 6, б, г), которые могут повышать эффективность нейротрансмиссии. С 21-го по 30-й DIV обнаруживались сложно организованные перфорированные, дивергентные и конвергентные контакты (рис. 7, в, г), а в шипиках — элементы шипиково-го аппарата (рис. 7, а, б, г).

Необходимо подчеркнуть, что в течение первых трех недель культивирования количество межней-ронных контактов в нейропиле, содержащих сформированные постсинаптические уплотнения, посте-

Рис. 5. Электронограммы смешанных аксодендритных (а, в), асимметричного аксодендритного (б) и симметричного аксошипикового (г) везикулярных синаптических контактов (показаны стрелками). 7 □IV. Масштаб — 1 мкм

Рис. 6. Электронограммы смешанных аксодендритного (а) и аксосоматического (в), перфорированных аксодендритного (б) и аксошипикового (г) синапсов (сплошные стрелки). Пунктирные стрелки — перфорации. 14 □IV. Масштаб — 1 мкм

® en-.,гг ¡р]-

\

ш *

ША

V

Ак

,jy -

Д* - ñ

й?

■# т ■■■•'" г

’ЧВВй*' ¡»RN

д

W'

Г$У

í

s.

і

< r

ш , г

ША1

Ак

%

СП

Рис. 7. Электронограммы аксо-шипиковых (а, б, г) и перфорированного аксодендритного (в) синапсов (показаны стрелками). На г показан сложноорганизованный дивергентный синапс. 21-й (а), 25-й (в, г), 30-й (б) день in vitro. Масштаб — 1 мкм

в

пенно нарастало, что свидетельствует об усилении процессов морфофункциональной дифференциров-ки синапсов.

обсуждение. Характерной чертой развития центральной нервной системы позвоночных является первоначальное образование избыточного количества нейронов, часть из которых (больше 50%) погибает в процессе онтогенеза [10]. Такая же закономерность наблюдалась и в развитии клеток эмбрионального гиппокампа in vitro (см. рис. 2). В первые дни культивирования множество нейронов формировали несинаптические контакты, которые обеспечивали морфофункциональную стабилизацию нейрональной сети на ранних этапах ее развития. Наличие множества свободных постсинаптических уплотнений подтверждает мнение авторов [11] о готовности пост-синаптического сайта мембраны нейронов к формированию зрелого контакта, однако на 5-й DIV сетевая активность практически отсутствовала, поскольку Ca2+-осцилляции регистрировались всего у 1% нейронов. Повышение Са2+-активности на 7-й DIV может быть связано с формированием первых химических синапсов, появление которых отмечалось и другими авторами [5]. Именно в этот период регистрировалась первая пачечная активность в виде случайных спайков и синхронизованных пачек импульсов [12, 13]. На 10-й DIV иммуноцитохимический анализ обнаружил формирование морфологических кластеров, в которых глиальные клетки создавали необходимые условия для функционирования нейронов, что отражалось в повышении количества активных клеток до 20% (см. рис. 3, в). Со 2-й недели культивирования уменьшение длительности Са2+-осцилляций и увеличение их частоты совпадало по времени с дальнейшим усложнением ультраструктуры химических синапсов, среди которых преобладали зрелые аксошипиковые контак-

ты, способствующие, как полагают, повышению эффективности синаптической передачи [14], о высокой активности которой свидетельствуют заполненные везикулами аксонные терминали. 21-й DIV характеризовался появлением кальциевых «суперосцилляций», сопровождавшимся усложнением биоэлектрической активности нейронной сети в виде формирования суперпачек спайков [8, 15, 16]. Наряду с этим на ультра-структурном уровне происходило практически полное исчезновение незрелых в функциональном отношении контактов, что согласуется во времени с данными по синаптогенезу in vivo [4, 17, 18].

Таким образом, полученные нами данные о динамике формирования нейронной сети in vitro на морфофункциональном уровне в целом соответствуют общим представлениям об основных стадиях нейрогенеза и свидетельствуют о том, что культура клеток гиппокампа может рассматриваться как адекватная биологическая модель нейронных сетей головного мозга. Со 2-й недели культивирования для нейронов характерна устойчивая синхронная активность, а основную популяцию синапсов составляют зрелые аксодендритные и аксошипиковые контакты.

Заключение. Диссоциированная культура клеток гиппокампа может рассматриваться как адекватная биологическая модель нейронных сетей головного мозга. Начало исследований зрелых нейронных сетей, формируемых культивируемыми нейронами, следует проводить в срок с 14-го по 21-й день in vitro, когда основную популяцию синапсов составляют зрелые аксодендритные и аксошипиковые асимметричные контакты. В функциональном отношении культуры на этом этапе развития также характеризуются устойчивой синхронной активностью. Численное соотношение нейронов и глии соответствует соотношению клеток в нативном мозге.

Литература

1. Potter S.M., DeMarse T.B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods 2001; 110: 17-24.

2. Kaech S., Banker G. Culturing hippocampal neuron. Nat Protoc 2006; 1: 2406-2415.

3. Gasser U.E., Hatten M.E. Neuron-glia interactions of rat hippocampal cells in vitro: glial-guided neuronal migration and neuronal regulation of glial differentiation. J Neurosci 1990; 10(4): 1276-1285.

4. Bartlett W.P., Banker G.A. An electron microscopic study of the development of axon and dendrites by hippocampal neurons of culture. J Neurosci 1984; 4(8): 1954-1965.

5. Grabrucker A., Vaida B., Bockmann J., Boeckers T.M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res 2009; 338: 333-341.

6. Matteoli M., Verderio C., Krawzeskic K., Mundiglc O., Coca S., Fumagallib G., De Camillic P. Mechanisms of synaptogenesis in hippocampal neurons in primary culture. J Physiology 1995; 89: 51-55.

7. Rao A., Kim E., Sheng M., Craig A. Heterogeneity in the molecular composition of excitatory postsynaptic sites during development of hippocampal neurons in culture. J Neurosci 1998; 18(4): 1217-1229.

8. Wagenaar D.A., Pine J., Potter S.M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience 2006; 7: 11.

9. Basarsky T.A., Parpura V., Haydon P.G. Hippocampal synaptogenesis in cell culture: developmental time course of synapse formation, calcium influx, and synaptic protein distribution. J Neurosci 1994; 14(11): 6402-6411.

10. Николлс Д.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу. М; 2008; 672 с.

11. Fletcher T.L., Camilli P., Bancker G.A. Synaptogenesis in hippocampal cultures evidence indicating that axons and dendrites become completent to from synapses by different stages of neuronal development. J Neurosci 1994; 14(11): 6695-6706.

12. Chiappalone M., Novellino A., Vajda I., Vato A., Martinoia S., van Pelt J. Burst detection algorithms for the analysis of spatio-temporal patterns in cortical networks of neurons. Neurocomputing 2005.

13. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные матрицы — новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. Соврем технол мед 2009; 1: 8-15.

14. Carveley R.K.S., Jones D.G. Contributions of dendritic spines and perforated synapses to synaptic plasticity. Brain Res Rev 1990; 15: 215-249.

15. Gritsun T., Stegenga G., Feber J., Rutten W.L.C. Network bursts in cortical neuronal cultures. In: Proceedings of the 4th International IEEE EMBS conference on neural engineering. 2009.

16. Симонов А.Ю., Пимашкин А.С., Корягина Е.А., Прокин И.С., Миронов В.И., Кастальский И.А., Савихин С.А., Терентьев А.Б., Иудин Д.И., Мухина И.В., Казанцев В.Б. Эффекты сетевой сигнализации в моделях спонтанно развивающихся нейрональных сетей в диссоциированных культурах клеток мозга. В кн.: Материалы XIII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика-2011». М: НИЯУ-МИФИ; 2010; 138-184.

17. Боголепов Н.Н., Фрумкина Л.Е., Яковлева Н.И., Королева С.К. Возможные механизмы формирования синапсов в онтогенезе. Арх анатомии 1987; 5: 20-27.

18. Papa M., Bundman C.M., Greenberger V., Segal M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci 1995; 15(1): 1-11.

References