Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры клеток гиппокампа in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Физиология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 283-286

УДК 576.535.5

ОЦЕНКА ДИНАМИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ДИССОЦИИРОВАННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГИППОКАМПА IN VITRO

© 2011 г. Е.В. Митрошина 1,г, М.В. Ведунова 1,г, О.М. Широкова1,

Ю.Н. Захаров 1, Я.И. Калинцева 1, И.В. Мухина 2

1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

2 Нижегородская государственная медицинская академия

[email protected]

Поступила в редакцию 03.06.2011

Исследованы закономерности спонтанной кальциевой активности нейрон-глиальной сети диссоциированной культуры гиппокампа на разных сроках морфофункционального развития. Функциональная активность культуры клеток гиппокампа, проявляющаяся в кальциевых осцилляциях и регистрируемая с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, свидетельствовала о формировании в процессе культивирования активных нейрон-глиальных взаимоотношений.

Ключевые слова: диссоциированная культура гиппокампа, нейронная сеть, Са2+-имиджинг, конфокальная микроскопия.

Введение

Изучение процессов формирования и функционирования нейрональных сетей головного мозга - одна из важнейших задач нейробиологии. Выявление закономерностей развития структурно-функциональных отношений между клетками головного мозга является основой для понимания патогенеза и разработки методов лечения целого ряда нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений мозга и т.д. В качестве модели для подобных исследований весьма удобно использовать диссоциированные культуры клеток. В таких культурах формируется активная нейрон-глиальная сеть, которая во многом аналогична нейрон-глиаль-ной сети головного мозга. В процессе онтогенеза культуры изменяется ее функциональная и метаболическая активность [1].

Для оценки функционального состояния и изучения механизмов функционирования нейрональных сетей перспективным является исследование ионных токов в нервных и глиальных клетках. Являясь вторичным мессенджером, ионы кальция играют особую роль в системе внутриклеточной сигнализации. Изменения их концентрации становятся «пусковым толчком» для реализации различных биохимических сигнальных механизмов клетки, поэтому изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция служат надежным показателем функциональной активности нейрон-глиальных сетей. Оптический флуоресцентный кальцие-

вый имиджинг является наиболее информативным методом при измерениях пространственного распределения и изменения концентрации ионов кальция в клетках. Данный метод позволяет судить об изменении концентрации ионов кальция в биологических тканях по интенсивности флуоресценции связанных с ними специфических красителей [2-4].

Цель исследования - изучить закономерности спонтанной кальциевой активности нейрон-глиальной сети диссоциированной культуры гиппокампа на разных сроках морфофункционального развития.

Материалы и методы

В исследовании использованы культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов белых беспородных мышей. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа

0.25%-ным трипсином (Invitrogen 25200-056). Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде ^етоЪаха!™ (Invitrogen 21103-049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко К055) и культивировали на стеклах, предвари-

тельно обработанных полиэтиленимином (Sigma P 3143). Исходная плотность клеточной культуры составила 9000 клеток/мм2. Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях СО2-инкубатора при температуре 35.5оС и газовой смеси, содержащей 5% СО2.

Для исследований динамики изменения концентрации ионов кальция внутри клетки использовался конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 510 NLO Duoscan. В качестве флюорохрома были использованы специфический кальциевый краситель Oregon Green BAPTA-1 (Invitrogen 06807), возбуждаемый линией излучения аргонового лазера 488 нм (флуоресценция которого регистрировалась в полосе 500-530 нм) [4], и астроцитарный маркер Sulforhodamine 101 (SR101) (Invitrogen S359), возбуждаемый излучением гелий-неонового лазера с длиной волны 543 нм (полоса пропускания фильтра фотоприемника второго канала регистрации флуоресценции - 650710 нм) [5]. Данная методика позволяла визуализировать функциональную архитектуру нейрональной сети культуры и идентифицировать изображения нейронов и глиальных клеток.

Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей. Анализ полученных изображений проводился с помощью оригинального программного пакета «Astroscanner». Анализировались временные характеристики функции F(t) средней интенсивности флуоресценции 0GB1. Для детектирования осцилляций был взят порог производной сигнала по времени в размере среднеквадратичного отклонения <з распределения dF/dt. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность переднего фронта осцилляции), общая длительность осцилляции и частота возникновения осцилляций.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали появление спонтанных кальциевых осцилляций в диссоциированной культуре гиппокампа, начиная с 7 дня культивирования in vitro (DIV). На более ранних этапах развития культуры (3 и 5 день in vitro) спонтанных кальциевых осцилляций не выявлено. На 7 день развития in vitro регистрируются редкие и длительные (порядка

11 -13 сек) осцилляции. Именно в это время образуются первые химические синапсы. В ходе онтогенеза культуры возрастает её кальциевая активность, что проявляется в увеличении частоты и снижении длительности кальциевых осцилляций к 21-23 дню культивирования. В

дальнейшем отмечается некоторое увеличение длительности осцилляций и снижение их частоты (рис. 1). Это может объясняться постепенным увеличением количества синаптических контактов между клетками и увеличением числа афферентных взаимодействий.

Также нами было отмечено, что к 10-11 дню развития в диссоциированной культуре гиппокампа помимо отдельных нейронов, генерирующих несинхронизированные кальциевые осцилляции, появляются нейроны, имеющие одинаковые паттерны кальциевой активности, что свидетельствует о формировании нейронных сетей. Сложность рисунка осцилляций Са2+ зависит от стадии структурной организации культуры, так как по мере развития все большее число нейронов оказывается вовлеченным в синхронизованное взаимодействие. Таких сетей в культуре может быть несколько (рис. 2).

К 23 дню in vitro были обнаружены достаточно обширные области нейронов, генерирующих похожие паттерны кальциевых осцилляций. В отличие от нейронов, в культуре гиппокампа вплоть до 30 дня культивирования не было выявлено образование спонтанной сетевой активности астроцитов по данным оптической визуализации динамики внутриклеточного кальция.

К 21 дню в уже сформированной нейрон-глиальной сети наблюдаются нейроны, генерирующие кальциевые «суперосцилляции» (рис. 3). Такие осцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базового уровня флюоресценции, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Длительность «суперосцилляции» составляет 50.97±1.59 секунд.

Такую «суперосциляцию» можно условно подразделить на 3 фазы: а) начало, состоящее из 2-3 осцилляций длительностью 3.56±0.19 с; б) основная фаза, наиболее длительная часть суперосцилляции (24.39±1.69 с), состоящая из нескольких более коротких осцилляций, длительность которых не превышает 2 с (1.29± ±0.04 с) и в) завершающая фаза (18.83±0.73). В завершающей фазе также происходит 2-4 более продолжительных осцилляций, последняя из которых является самой длительной. Появление подобной формы кальциевой активности может быть связано с тем, что при возникновении нескольких пачек электрических импульсов в клетку поступает большое количество ионов кальция, кальциевая буферная система клетки уже не справляется и уровень внутриклеточного кальция существенно повышается на достаточно длительное время, что и фиксируется с помощью конфокальной микроскопии.

День культивирования in vitro

День культивирования in vitro

Рис. 1. Динамика изменения длительности спонтанных кальциевых осцилляций в процессе развития диссоциированной культуры гиппокампа (а); по оси абсцисс - день развития культуры in vitro, по оси ординат - средняя длительность осцилляций, с (M ± m). Динамика изменения частоты спонтанных кальциевых осцилляций в процессе развития диссоциированной культуры гиппокампа (б); по оси абсцисс - день развития культуры in vitro, по оси ординат - средняя частота возникновения кальциевых осцилляций, мин-1 (M ± m). * Статистически значимые различия в сравнении с 14-м днем развития in vitro (р < 0.05 по критерию Стьюдента)

зо і

20

10

100 200 300 400 500 600

80-

60-

40- 1 1 1

20- І!! I ! ! ! !!!!!! ! !

і і I 1 Iі 1 і I 1 Iі 11 1

0---------,-----т------,------,------,------,

100 20и 300 400 500 600 100 200 300 400 500 600

Рис. 2. Растровые диаграммы распределения кальциевых осцилляций во времени различных клеток культуры гиппокампа в процессе развития на 7 DIV (а), 11 DIV (б), 18 DIV (в) и 28 DIV (г). По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время в секундах. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами

dF/F, % tmax tend

^end

t, сек

dF/F, %

^end

t, сек

t

t

t

Рис. 3. Пример кинетики «суперосцилляции» в первичных культурах гиппокампа мыши (23 DIV). На графиках представлен сигнал отдельной клетки, ось абсцисс - время (сек), ось ординат - интенсивность флуоресценции красителя ОО

Заключение

Показано, что в процессе длительного развития диссоциированная культура гиппокампа проходит несколько периодов, связанных с формированием единой функциональной системы, регистрируемой по параметрам кальциевой активности методами флуоресцентного имиджинга.

На определенной стадии развития культуры гиппокампа кальциевые осцилляции нейронов синхронизовались между собой и представляли сложные паттерны кальциевых сигналов.

Глиальные клетки демонстрируют спонтанные кальциевые сигналы, некоррелированные во времени между собой и с сигналами нейрональной сети.

Работа поддержана грантом аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала Высшей школы» (проект № 2.1.1/6223).

Список литературы

1. Distasi C., Ariano P., Zamburlin P., Ferraro M. // Eur. Biophys. J. 2002. V. 31. P. 81-88.

2. Agronskaia A.V., Tertoolen L., Gerritsen H.C. // J. Biomed. Opt. 2004. V. 9. P. 1230-1231.

3. Stosiek C. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 7319-7324.

4. Paredes M., Etzler J.C., Watts L.T., Zheng W., Lechleiter J.D. // Methods. 2008. V. 46. P. 143-151.

5. Nimmerjahn A., Kirchhoff F., Kerr J.N., Heim-chen F. // Nat. Methods. 2004. V. 1. P. 31-37.

ASSESSMENT OF FUNCTIONAL STATE DYNAMICS OF DISSOCIATED HIPPOCAMPAL CELL CULTURE IN VITRO

E. V. Mitroshina, M. V. Vedunova, O.M. Shirokova,

Yu.N. Zakharov, Ya.I. Kalintseva, I.V. Mukhina

The patterns of spontaneous calcium activity of neuron-glial cultures of dissociated hippocampal network at different stages of morphological and functional development have been studied. Calcium oscillations registered by fluorescent confocal microscopy testified to the formation of active neuron-glial relationship in the course of cultivation.

Keywords: dissociated hippocampal culture, neural network, calcium (Ca2+) imaging, confocal microscopy.