CC BY
6DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2021-30-25-30 УДК 575.174.015.3:616.5-002.525.2-053.2
И. Ю. Бакутенко1, И. Д. Гаврильчик1, Е. В. Сечко2, А. М. Чичко2, А. В. Сукало2, Н. И. Рябоконь1
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА IRF5 В ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЮВЕНИЛЬНОЙ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ В БЕЛОРУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: [email protected] ^Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83
Ген IRF5 (interferon regulatory factor 5), кодирующий транскрипционный фактор, участвует в регуляции синтеза интерферона и других провоспалительных цитокинов. Предполагается ассоциация гена IRF5 с ювенильной системной красной волчанкой (юСКВ) — хроническим аутоиммунным заболеванием, которое развивается в детском возрасте и отличается от взрослого подтипа рядом проявлений. Целью представленной работы было проведение пилотного исследования полиморфизма rs2004640 гена IRF5 среди детского населения Беларуси и его ассоциации с развитием юСКВ. С использованием ПЦР в реальном времени проведено генотипирование образцов ДНК, полученных от пациентов с диагнозом юСКВ (38 чел.) и в группе клинического контроля без аутоиммунных и воспалительных заболеваний (378 чел.). Определена частота минорного аллеля Т rs2004640 гена IRF5 в белорусской популяции детей (в возрасте до 17 лет). Установлено, что генотип rs2004640 ТТ гена IRF5 ассоциирован с риском развития юСКВ (OR = 2,27; 95% CI 1,08-4,76; р = 0,035), что после дополнительных исследований может послужить усовершенствованию ранней диагностики юСКВ.
Ключевые слова: ювенильная системная красная волчанка, IRF5, генетический полиморфизм.
Введение
Системная красная волчанка (СКВ) — это хроническое аутоиммунное ревматическое заболевание, поражающие большое количество систем и органов человека, которое может привести к значительному ухудшению качества жизни и даже к смерти. Ювенильная форма СКВ (юСКВ), в отличие от взрослой подгруппы, развивается в возрасте до 17 лет и встречается достаточно редко: средняя частота возникновения составляет 0,3-0,9 случаев на 100 тыс. детей в год, а средняя распространенность заболевания достигает 3,3-8,8 на 100 тыс. детей [1]. Это примерно в 10 раз реже, чем у ювенильного идиопатического артрита — наиболее распространенного аутоиммунного ревматического заболевания детей [2]. Среди заболевших юСКВ девочки составляют более 80% случаев, а медианный возраст дебюта заболевания колеблется между 11 и 12 годами, с крайне редкими случаями начала болезни до 5 лет. По сравнению
со взрослой формой СКВ юСКВ имеет более тяжелое течение с быстрым прогрессированием и более высокой смертностью [1].
СКВ и юСКВ характеризуются патологиями соединительной ткани, при этом поражаются микрососуды, кожа и внутренние органы, особенно почки. Патогенетический механизм развития симптомов этих заболеваний включает в себя выработку аутоантител, аутоиммунное воспаление и гибель клеток с выделением дополнительного количества аутоантигенов, что делает нарастающее воспаление хроническим. Вторично возникает поражение микрососудов, на стенках которых откладываются иммуно-комплексы аутоантител со своими мишенями. У части пациентов особенно сильно повреждаются капилляры почек, что приводит к развитию волчаночного нефрита, зачастую определяющего выживаемость пострадавших [3].
Ювенильная СКВ, как и взрослая форма СКВ, является многофакторным заболеванием,
причины которого сочетают воздействие внешней среды (ультрафиолет, некоторые лекарственные препараты, инфекции и другие средовые факторы) и генетическую предрасположенность. Генетическая составляющая включает комплексы генов, участвующих в таких клеточных процессах, как апоптоз и дальнейшее устранение апоптотических телец, не-тоз и утилизация внеклеточных нуклеиновых кислот, регуляция синтеза интерферонов I типа и элиминация внутриклеточных нуклеиновых кислот, синтез компонентов комплемента и формирование центральной иммунологической толерантности [4].
Среди этих генов связь со взрослой формой заболевания [5, 6], а также с юСКВ в отдельных популяциях [6, 7] установлена для гена IRF5. Этот ген интересен тем, что кодирует интерферон регулирующий фактор ГОГ5, белок из группы транскрипционных факторов, которые вовлечены во множественные процессы в организме, включая вирус-опосредованную активацию интерферона, клеточный рост и дифференциацию, апоптоз и активность иммунной системы. Транскрипционный фактор ГОР5 помимо своей основной функции — регуляции экспрессии гена интерферона — участвует также в регуляции активности генов других провоспалительных цитокинов и известен как фактор предрасположенности к ряду аутоиммунных расстройств (ревматоидного артрита, рассеянного склероза, синдрома Шегрена, СКВ) в самых разных этнических группах [8]. IFNa — это типичный пример интерферонов I типа, которые являются провоспалительными цитокинами и активно синтезируются в ответ на проникновение антигенов в организм. Однако повышенный уровень IFNa в крови способен привести к потере иммунологической толерантности и усилению пролиферации ау-тореактивных Т- и В-клеток. Известно, что у пациентов с СКВ выражен повышенный уровень IFNa, а порядка 50% заболевших имеют измененный под действием IFNa паттерн экспрессии моноцитов. Более того, использование препаратов IFNa при лечении вирусного гепатита С приводит к развитию волчаночноподоб-ных состояний, исчезающих с прекращением приема препарата [8].
Из всех известных полиморфизмов гена 1КР5 хорошо изучен в отношении риска раз-
вития СКВ в этнически различных популяциях [9, 10] rs2004640 (T>G), расположенный в донорном сайте сплайсинга интрона 3 этого гена. Однако данных о влиянии носительства замены в локусе rs2004640 на развитие юСКВ чрезвычайно мало [6, 7].
Исходя из всего вышеизложенного, а также принимая во внимание необходимость поиска генетических маркеров предрасположенности к юСКВ, целью нашей работы было изучение частот минорного аллеля и генотипов полиморфизма rs2004640 (G/T) гена IRF5 в популяции белорусских детей и связи этих генетических вариантов с риском развития юСКВ. Ниже представлены результаты проведенного нами пилотного исследования на небольшой выборке пациентов с диагнозом юСКВ.
Материалы и методы
Участники исследования
В проведенном исследовании «случай - контроль» принимали участие пациенты, проходившие в 2012-2020 гг. лечение в Учреждении здравоохранения «2-я городская детская клиническая больница» г. Минска, являющемся клинической базой 1-й кафедры детских болезней Учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет». Все пациенты включены в исследование после получения информированного согласия родителей.
Группа юСКВ состояла из 38 пациентов с дебютом заболевания до 17 лет, из них 34 — женского пола. Диагноз юСКВ был поставлен в соответствии с международными критериями EULAR/ACR [11]. Среднее значение возраста пациентов составило 13,8±3,0 лет, средний возраст дебюта заболевания — 11,9±3,2 лет.
Группа сравнения (клинического контроля) состояла из 378 пациентов без аутоиммунных, острых или хронических воспалительных заболеваний, со средним возрастом 14,4±2,5 лет (из них 163 — женского пола).
Выделение ДНК и генотипирование
Тотальная ДНК выделена стандартным фенол-хлороформным методом из образцов венозной крови, полученной в стерильные пробирки с ЭДТА [12]. Оценка концентрации и чистоты тотальной ДНК проведена с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Образцы ДНК до начала генотипирования были доведе-
ны до концентрации 100 нг/мкл и хранились в лабораторной коллекции при -20 °С.
Генотипирование всех образцов ДНК проведено с использованием ПЦР в реальном времени. Синтез и поставка праймеров и реактивов для ПЦР осуществлялась ОДО «Праймтех» (Республика Беларусь) (табл. 1). Стандартная ПЦР проводилась в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 100 нг геномной ДНК, 2х премикс для ПЦР-РВ, праймеры, дважды меченные флуоресцентные зонды и воду (mQ), на приборе QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США).
Результаты и обсуждение
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма ге2004640 гена ¡№5 в исследуемой группе контроля соответствовали закону Харди-Вайнберга. Частота минорного аллеля Т в этой же группе оказалась ниже среднего значения, характерного для Западной Европы (46,2% против 53,2%), и даже находилась несколько ниже диапазона межпопуляцион-ных колебаний в этом регионе (от 50,0% до 57,0%) [15]. Однако сравнение с данными по российской популяции (42,6%) [16] показывает, что частота Т аллеля в белорусской популяции занимает промежуточное значение между Западной Европой и Россией, что укладывается в представление об общей эволюционной истории этих популяций.
Результаты сравнительного анализа распределения частот генотипов и аллелей в группах пациентов с юСКВ и контроля представлены в таблице 2. По аналогии со взрослой формой СКВ установлена повышенная частота аллеля Т в группе с юСКВ ДО = 1,69 при р = 0,042), что соответствует опубликованным ранее данным по другим популяциям [6, 7].
Анализ распределения генотипов показал разнонаправленные тенденции относитель-
Статистический анализ Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программного пакета SNPassoc для R v4.0.3 [13] и поправкой на пол. Наличие ассоциации генотипа/аллеля с заболеванием считали значимым приp < 0,05, а направленность связи определяли по величине отношения шансов (OR— odd ratio) и 95% доверительного интервала (95% CI — 95% confidence interval). Анализ сцепления генетических локусов осуществлялся с помощью веб-инструмента LDpair [14].
но риска развития юСКВ: генотип ТТ значимо чаще встречается среди пациентов с юСКВ ДО = 2,27 при р = 0,035), тогда как несущий одну рисковую аллель генотип GT имеет тенденцию к меньшему распространению, чем в контрольной группе (OR = 0,73 при р > 0,05). С учетом того, что доминантная генетическая модель GT+TT не связана значимо с риском развития юСКВ (р = 0,248), мы предполагаем, что именно носительство гомозиготного генотипа ТТ является фактором риска развития юСКВ.
Молекулярно-генетические пути вовлечения аллеля Т (или генотипа ТТ) ге2004640 в патогенез юСКВ не изучены. Известно, что замена ну-клеотидов G/T в локусе ге2004640, находящемся в интроне гена ¡КР5, приводит к переключению альтернативного сплайсинга первого экзона с 1А на 1В. Однако, функциональная роль этой замены едва ли велика по причине того, что количество таких 1В-несущих альтернативных транскриптов гораздо меньше, чем исходных 1А-несущих, а данных, подтверждающих значимость альтернативного сплайсинга в экспрессии белка ГОР5, нет [17]. Тем не менее, как это уже указывалось выше, аллель Т ге2004640 показывает в мета-анализах значимую ассоциацию с развитием СКВ у взрослых пациентов [9, 10].
Таблица 1
Праймеры, зонды и условия ПЦР для генотипирования локуса rs2004640
Название олигонуклеотидов Последовательность олигонуклеотидов Условия ПЦР
Fw 5' TGAAGACTGGAGTAGGGCG 10 мин 95 °С 40 циклов: 15 с 95 °С 30 с 61°С 20 с 72 °С
Rv 5' GAGGCGCTTTGGAAGTCCC
PrT 5' FAM-CGGGTGGGTGCCTACAGCAG-BHQ1
PrG 5' ROX-CGGGGGGGTGCCTACAGCAG-BHQ2
Таблица 2
Распределение генотипов и аллелей локуса ге2004640 среди пациентов с юСКВ
и контрольной группы
Генотип / аллель Контроль, п (%) юСКВ,п (%) ОЯ [95% С1] Р
GG 112 (29,6) 7 (18,4) 1,00 -
GT 183 (48,4) 17 (44,7) 0,73 [0,36-1,47] 0,381
ТТ 83 (22,0) 14 (36,8) 2,27 [1,08-4,76] 0,035
GT+TT 266 (70,4) 31 (81,6) 1,64 [0,68-3,95] 0,248
G 53,8 40,8 1,00 -
Т 46,2 59,2 1,69 [1,01-2,81] 0,042
Наиболее вероятный, с нашей точки зрения, механизм связи аллеля с заболеваемостью СКВ и юСКВ — это сцепление локуса ге2004640 с инсерционно-делеционным полиморфизмом ге77571059 (-/GCGGG), который расположен на расстоянии в 388 п. н. выше, в области промотора, и при амплификации создает дополнительные сайты посадки фактора транскрипции Sp1, что увеличивает экспрессию белка ГОР5 в ответ на ^Я-опосредованную активацию в миелоид-ных клетках [17, 18]. Проведенный нами био-информатический анализ с использованием веб-инструмента LDpair показал наличие сцепления локусов ге77571059 GCGGG и ге2004640 Т гена 1КР5 (нормализованный коэффициент неравновесности D' = 0,981, коэффициент корреляции г2 = 0,706), что частично подтверждает выдвинутое нами предположение.
Продолжая обсуждение данного предположения, необходимо упомянуть следующие данные. Согласно D. Li с соавторами [18], носители гомозиготного гаплотипа 1КЕ5 ге77571059 GCGGG — ге2004640 Т имеют измененные паттерны экспрессии нейтрофилов и повышенный уровень спонтанного нетоза. Спонтанный нетоз активирует выработку 1Е№а плазмоцитоидными дендритными клетками, а 1ЕКа, в свою очередь, необходим для превращения В-клеток в плазматические клетки, а также для подготовки к нетозу нейтрофилов [18]. Как уже упоминалось выше, пациенты с СКВ имеют повышенные уровни 1Е№а и спонтанного нетоза, что может быть связано с повышенной активностью 1Ш5. Из-за того, что экспрессия гена 1КЕ5 активируется интерферонами I типа, возникновение положительной обратной связи с IFNa может рассматриваться как один из возможных путей патогенеза взрослой и ювенильной форм СКВ.
Заключение
Изучены частоты генотипов и аллелей полиморфизма ге2004640 гена IRF5 в белорусской популяции детей и их связь с риском возникновения юСКВ. Установлено, что частота минорного аллеля Т в белорусской популяции занимает промежуточное значение по сравнению с популяциями Западной Европы и России. Выявлено, что генотип ге2004640 ТТ гена 1КР5 ассоциирован с риском возникновения юСКВ. Полученные результаты дают новые знания о генетической структуре белорусской популяции, а также о биомаркерах риска развития юСКВ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о важности данного исследования не только для изучения генетических особенностей белорусской популяции, но и для юСКВ в целом. Кроме того, они указывают на необходимость проведения дальнейших исследований с целью лучшего понимания генетических сходств и различий между взрослой и ювенильной формами СКВ.
Работа выполнена в рамках задания 6.4 «Мо-лекулярно-генетическая оценка риска аутоиммунных заболеваний» НТП Союзного государства «ДНК-идентификация» (2017-2021 гг.).
Авторы выражают благодарность детям и их родителям, давшим согласие на участие в исследовании; медицинским работникам, принявшим участие в сборе материала, а также сотрудникам лаборатории молекулярных основ стабильности генома Института генетики и цитологии НАНБеларуси, принимавшим участие в 2012-2017 гг. в создании лабораторной коллекции ДНК для использования в научных целях.
Список использованных источников
1. Levy, D. M. Systemic Lupus Erythematosus in Children and Adolescents / D. M. Levy, S. Kamphuis // Pediatric Clinics of North America. - 2012. - Vol. 59, № 2. - P. 345-364.
2. Prevalence and incidence of juvenile idiopathic arthritis: A systematic review / S. Thierry [et al.] // Joint Bone Spine. - 2014. - Vol. 81, № 2. - P. 112-117.
3. Характеристика системной красной волчанки и люпус-нефрита у детей в Республике Беларусь и Республике Татарстан / Т. П. Макарова [и др.] // Росс. вестн. перинатол. педиатр. - 2019. - Т. 64, № 5. - С. 199-203.
4. Кучинская, Е. М. Генетические аспекты патогенеза системной красной волчанки у детей / Е. М. Кучинская, E. Н. Суспицын, M. M. Костик // Современная ревматология. -2020. - Т. 14, № 1. - С. 101-107.
5. Beal, E. IRF5 and B cells in lupus development / E. Beal // Nat Rev Rheumatol. - 2010. -Vol. 6, № 8. - P. 437-437.
6. Identification of new SLE-associated genes with a two-step Bayesian study design / D. L. Armstrong [et al.] // Genes Immun. - 2009. - Vol. 10, № 5. - P. 446-456.
7. Interferon regulatory factor 5 gene polymorphism in Egyptian children with systemic lupus erythematosus / A. Hammad [et al.] // Lupus. -2017. - Vol. 26, № 8. - P. 871-880.
8. Lazzari, E. Regulations of IRF5 activity in the TLR7 and type I IFN pathways / E. Lazzari. -2019 - P. 11307623 Bytes.
9. Association of IRF5 rs2004640 polymorphism and systemic lupus erythematosus: A meta-analysis / J. Wang [et al.] // Int J Rheum Dis. -2019. - Vol. 22, № 9. - P. 1598-1606.
10. Bae, S. C. Association between the interferon regulatory factor 5 rs2004640 functional polymorphism and systemic lupus erythematosus:
an updated meta-analysis / S. C. Bae, Y. H. Lee // Lupus. - 2019. - Vol. 28, № 6. - P. 740-747.
11. 2019 European League Against Rheumatism/American College of Rheumatology classification criteria for systemic lupus erythematosus / M. Aringer [et al.] // Ann Rheum Dis. - 2019. -Vol. 78, № 9. - P. 1151-1159.
12. Green, M. R. Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian blood using proteinase K and phenol / M. R. Green, J. Sam-brook // Cold Spring Harb Protoc. - 2017. -Vol. 2017, № 10. - P. pdb.prot093492.
13. SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies / J.R. Gonzalez [et al.] // Bioinformatics. - 2007. - Vol. 23, № 5. - P. 654-655.
14. Machiela, M. J. LDlink: a web-based application for exploring population-specific haplotype structure and linking correlated alleles of possible functional variants: Fig. 1. / M. J. Machiela, S. J. Chanock // Bioinformatics. - 2015. - Vol. 31, № 21. - P. 3555-3557.
15. The 1000 Genomes Project Consortium. A global reference for human genetic variation / The 1000 Genomes Project Consortium // Nature. -2015. - Vol. 526, № 7571. - P. 68-74.
16. Krylov, M. Yu. Relating interferon regulatory factor 5 rs2004640 Gene polymorphism to increased risk of systemic sclerosis in the patients: Russian Federation cohort / M. Yu. Krylov, L. P. Ananieva, I. A. Guseva // Russ Open Med J. - 2020. - Vol. 9, № 4. - P. e0410.
17. Comprehensive evaluation of the genetic variants of interferon regulatory factor 5 (IRF5) reveals a novel 5 bp length polymorphism as strong risk factor for systemic lupus erythemato-sus / S. Sigurdsson [et al.] // Human Molecular Genetics. - 2008. - Vol. 17, № 6. - P. 872-881.
18. IRF5 genetic risk variants drive myeloid-specific IRF5 hyperactivation and presymptom-atic SLE / D. Li [et al.] // JCI Insight. - 2020. -Vol. 5, № 2. - P. e124020.
I. Y. Bakutenko1, I. D. Haurylchyk1, E. V. Sechko2, A. M. Tchitchko2, A. V. Sukalo2, N. I. Ryabokon1
ROLE OF IRF5 GENE POLYMORPHISM IN PREDISPOSITION TO JUVENILE-ONSET SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS IN THE
BELARUSIAN POPULATION
:State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus
e-mail: [email protected] ^Educational Institution "Belarusian State Medical University" 83 Dzerzhinski Ave., 220116 Minsk, Republic of Belarus
The IRF5 (interferon regulatory factor 5) gene encoding a transcription factor is involved in the regulation of interferon synthesis and other proinflammatory cytokines. It is assumed that the IRF5 gene is associated with juvenile-onset systemic lupus erythematosus (jSLE), a chronic autoimmune disease that develops in childhood and differs from the adult subtype of SLE in a number of its manifestations. The aim of the presented work was to conduct a pilot study of IRF5 rs2004640 polymorphism in the population of children in Belarus and its association with the development of jSLE. Genotyping of DNA samples was performed using real-time PCR in a group of patients diagnosed with jSLE (38 people) and in the clinical control group without autoimmune and inflammatory diseases (378 people). The frequency of the IRF5 rs2004640 minor T allele was determined in the Belarusian population of children (under the age of 17). It was found that the rs2004640 TT genotype is associated with the risk of the jSLE development (OR = 2.27; 95% CI 1.08-4.76; p = 0.035) that after further investigations may improve an early diagnosis ofjSLE.
Keywords: juvenile-onset systemic lupus erythematosus, IRF5, genetic polymorphism.
Дата поступления статьи: 26 февраля 2021 г.
