CC BY
110
Биологические науки
Клеева Н. А.
к.биол.н., старший преподаватель Проценко Е.П.
д. с.-х. н., к. биол. н., профессор Балабина И. П.
к. биол. н., доцент кафедры общей биологии и экологии Курского ГУ
Плеханов С. Е.
д.б.н., в.н.с. биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Братковская Л. Б.
к.б.н., в.н.с. биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова;
Садчиков А. П.
д.б.н., проф.Биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова
Роль почвенного микробиоценоза в разложении органических остатков
Н. А. Клеева, Е. П. Проценко, И. П. Балабина
В начале нашей исследовательской работы стояла двойная задача: с одной стороны — изучить роль почвенного микробиоценоза в разложении пухо-перовых остатков (ППО), с другой — оценить возможность утилизации ППО методом компостирования с добавлением почвы.
Курская область расположена в поясе умеренно-континентального климата в пределах лесостепной зоны и представляет большой интерес для изучения проблемы взаимодействия человека. Образцы почвы для проведения исследований отбирались на территории агробиостанции Курского государственного университета, расположенного в центральной части г. Курска. Почва опытных участков — серая лесная среднесуглинистая на среднем карбонатном лессовидном суглинке. Она обладают большим разнообразием микроорганизмов, причем численность их уменьшается с глубиной. Максимальная численность (15 млн/г) фиксируется для верхнего гумусового слоя, где сосредоточен наибольший запас питательных элементов[1].
В качестве трудноразлагаемых органических остатков дополнительно вносились в почву отходы, получаемые на пухоперерабатывающих предприятиях, представляющие собой крошку серого цвета с размером частиц от нескольких микрометров до нескольких миллиметров с содержанием целых перьев. Хранение и переработка этого вида отходов затрудняется в связи с маленькой объемной массой, рассыпчатостью и высокой степенью летучести. Структурные образования, формирующие перо, состоят из ороговевшего вещества, основным компонентом которого является кератин. Кератин отличается высокой устойчивостью к воздействию различных реагентов: в воде, растворах нейтральных солей и в разбавленных растворах кислот и щелочей он нерастворим, не подвергается гидролизу под действием ферментов, кроме фермента кератиназы [2].
В настоящее время разработаны технологии преобразования органического сырья, например на основе ферментации, позволяющие получать экологически безопасные продукты — удобрения и кормовые добавки [3]. Однако мелкие пухоперерабатывающие предприятия в целях экономии прибегают к утилизации пуха и пера (отходов производства) сжиганием, что является грубым нарушением экологического законодательства. В этой связи необходим поиск рационального пути преобразования данного вида отходов, исключающий экологические правонарушения. Мы представили возможным утилизировать их компостированием (с высокой долей почвы) с участием почвенной микробиоты [4].
Для изучения количественного и видового состава микробного сообщества при попадании в почву ППО были заложены 2 варианта: I — контроль (серая лесная почва); II - пухо-перовые остатки + почва (1:20). Образцы выдерживали в термостате в стеклянных сосудах на 0,5 л при поддержании влажности 25 % от наименьшей влагоемкости и 280 С. Пробы отбирались на 42 день.
Все микробиологические исследования проводились с применением газо-хроматографического-масс-спектрометрического метода [5, 6]. Пробы анализировались с помощью хромато-масс-спектрометра HP-5973 SMART фирмы Agilent Technologies (США).
Биологические науки
Таблица 1. Состав микробного сообщества серых лесных почв и почвы с внесением ППО
Микроорганизмы,кл/г х106 Почва Почва + ППО
Acetobacter sp. 1,90 1,70
Agrobacterium radiobacter 1,66 1,58
Ochrobactrum sp. 0,45 0,54
Pseudomonas fluorescens 0,32 0,55
P.putida 0,33 0,66
P. vesicularis 0,09 0,12
Riemirella sp. 0,16 0,16
Sphingobacterium spiritovorum 0,23 0,30
Sphingomonas adgesiva 0,16 0,25
Sphingomonas capsulata 0,19 0,40
Xanthomonas sp. 0,21 0,31
FeRed 0,52 0,68
Bacteroides fragilis 0,02 0,00
Bacteroides hypermegas 0,01 0,02
Bacteroides ruminicola 0,13 0,15
Wolinella sp. 0,20 0,21
Desulfovibrio sp. 0,39 0,36
Nitrobacter sp. 0,50 1,16
Cytophaga sp. 0,18 0,19
Arthrobacter sp. 2,35 2,62
Caulobacter sp. 0,56 0,72
Bacillus subtilis 0,69 0,80
Bacillus sp. 0,42 0,43
Clostridium pasteurianum 0,72 1,11
C.perfringens 0,02 0,03
C. propionicum 0,30 0,07
Acetobacterium sp. 0,00 0,06
Butyrivibrio 1-2-13 0,31 0,30
Butyrivibrio 1-4-11 0,26 0,23
Butyrivibrio 7S-14-3 2,38 2,65
Corynebacterium sp. 0,56 0,38
Eubacterium lentum 0,33 0,43
Propionibacterium freudenreichii 0,44 0,40
P. jensenii 7,36 6,44
Propionibacterium sp. 1,48 1,78
Mycobacterium sp. 4,23 4,19
Rhodococcus equi 0,63 0,62
Rhodococcus terrae 1,64 1,78
Ruminococcus sp. 1,57 1,64
Pseudonocardia sp. 0,39 0,43
Streptomyces-Nocardiopsis 1,48 1,80
Nocardia carnea 0,18 0,36
Actinomadura roseola 0,33 0,34
Сумма 36,3 38,9
В результате установлено, что серая лесная почва характеризуется высоким микробным разнообразием (46 видов, принадлежащих к 33 родам) и суммарной численностью до 4 х 107 кл/г (табл.1). После 42 дней почва с добавлением ППО значимо не отличалась от серой лесной почвы по этим микробным характеристикам. Для этого варианта в сравнении с почвой отмечено заметное увеличение только численности нитрификатора второй фазы Nitrobacter (в два раза) и анаэробного азотфиксатора Clostridium pasteurianum (на 40%), что можно рассматривать как последствие наличия дополнительно источника азота (ППО).
В целом, содержание анаэробных видов в сообществе составляло 45 и 43% для почвы и компоста П+ППО, что свидетельствует об анаэробной направленности микробиологических процессов при разложении этого субстрата. Наибольший вклад в анаэробный метаболизм вносят представители рода Clostridium, являющиеся облигатными анаэробами, которые сбраживают углеводы, пептон или аминокислоты и образуют смесь органических кислот, спиртов, а также Н2 и СО2 . Также виды р. Bacteroides — анаэробы или микроаэрофилы, метаболизируют углеводы, пептон или промежуточные продукты метаболизма. Представители рода Eubacterium — строгие анаэробы, из глюкозы или пептона образуют смесь кислот, в том числе большое
количество масляной, уксусной или муравьиной кислоты с видимым выделением Н2. Bacillus subtilis — факультативно анаэробный вид, способный к аммонификации белков [7]. К метаболитам анаэробных бактерий, которые могут снизить качество компоста, как потенциального органического удобрения, относятся масляная кислота, образуемый в процессе жизнедеятельности Eubacterium, Clostridium и Bacteroides , а также сероводород — продукт жизнедеятельности сульфатредуктора Desulfovibrio. Однако, как показало биотестирование, исследуемые образцы не были токсичными, следовательно, образование таких метаболитов не нарушало трофического баланса получаемого органического субстрата [8].
Анализируя метаболические возможности консорциума доминирующих анаэробных видов микробного сообщества можно предположить, что микробиологический процесс трансформации трудноразлагаемых белков пуха начинали виды рода Eubacterium, Clostridium, Bacteroides и Bacillus, т.к. только эти представители анаэробов и факультативного анаэроба, способны к сбраживанию белковых компонентов субстрата. В результате их жизнедеятельности образуются органические субстраты (органические кислоты и спирты) и газы (Н2 и СО2), которые являются основой жизнедеятельности для Acetobacterium и ряда аэробных видов, в частности, Xantobacter. Этот аэробный вид способен расти как в минеральной среде в атмосфере Н2, О2 и СО2 , так и использовать в качестве единственного источника углерода спирты и органические кислоты [9]. Увеличивается численность в образцах содержащих ППО бактерий р. Sphingomo-nas, которые относится к грамм-отрицательным аэробам и является деструктором углеводородов.
К разложению структурных весьма устойчивых к про-теолизу белков, в частности, кератина в большей степени способны микромицеты. Определение численности этой группы микроорганизмов (Fungi) молекулярным методом ГХ-МС по химическому маркеру линолевой кислоте — С18:2 показало, что в опытных образцах содержание микромицетов увеличивается в 2,5 раза, по сравнению с почвой.
Актиномицеты в количестве 108 - 107 кл/г представлены во всех исследованных образцах. Однако их содержание в бактериальном сообществе почвы и в образце почва+ППО составляло не более 14%. Это свидетельствует о том, что выявленный комплекс актиномицетов активно не участвует в процессе разложения ППО. Кроме того, доминирование анаэробных условий не способствовало развитию аэробной актиномицетной составляющей микробного сообщества.
Наряду с изучением бактериального и микромицетного населения проводили определение химических маркеров простейших (Protozoa). Для простейших в качестве такого маркера был выбран альдегид С18 (октадекановый альдегид). При этом использовался коэффициент, позволяющий сравнивать их биомассу по вариантам опыта. В кобразцах с почвой и ППО химических маркеров в два раза меньше, чем в исходной почве. Очевидно, за счет разбавления и того, что исходная серая лесная почва по содержанию тяжелых металлов была в пределах ПДК.
Таким образом, при компостировании ППО в течение 42 дней доминирующий микробиологический процесс— анаэробиоз. Тем не менее, нельзя говорить о преимуществе создания искусственно анаэробных условий для ускорения разложения, так как разложение идет и при активном
Всероссийский журнал научных публикаций № 5(15) 2013
11
Подавление роста бактерий экзометаболитами культуры водоросли ChloreUa
Плеханов С.Е., Братковская Л.Б., Садчиков А.П.
участии аэробных видов, таких как Xantobacter, Sphingomo-nas. Ведущими видами микроорганизмов в трансформации трудноразлагаемого белка ППО являлись, по-видимому, облигатные (Eubacterium, Clostridium, Bacteroides) и факультативные (Bacillus) анаэробы, которые ферментировали в трофической цепи с микромицетами с протеазной (в частности, с кератиназной) активностью. В итоге, можно говорить о возможности разложения ППО в почве с участием микроорганизмов (ускоренное дополнительными компонентами) и получением компоста, который не обладает токсичным действием, что подтверждено биотестированием.
Список использованных источников
1. Агроэкология / В.А.Черников, Р.М. Алексахин, А.В.Голубев и др.; Под ред. В.А.Черникова, А.И.Чекереса. - М.:Колос,
2000 - 536 с.
2. Никитин Б. И., Никитина Н. Б. Производство перо-пуховых изделий. - М.: Агропроиздат,1985. - 240 с.
3. Сидоренко О. Д., Черданцев Е. В. Биологические технологии утилизации отходов животноводства.- М.: Изд-во МСХА, 2001
- 74 с.
4. Проценко Е.П., Клеева Н.А., Фурман Ю.В., Букреева И.А. Способ утилизации пухо-перовой крошки методом компостирования. Патент на изобретение № 2365570. Заявка №20081 11222. Приоритет 24.03.2008. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 августа 2009 г.
5. Верховцева Н. В., Осипов Г. А. Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии в изучении микробных сообществ почв агроценоза. // Проблемы агрохимии и экологии. - 2008. - №1.
- С. 51 - 54.
6. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов. Патент РФ 1 2086642, Класс C12N 1/00, 1/20, C12Q 1/04, Опубликовано 10.08.97, Бюллетень No.22. По заявке № 057595/13 от 24.12.93.
7. Современная микробиология. Прокариоты [под ред. Й. Ленгелера, Г.Древса и Г.Шлегеля], в 2-х томах. - М: Мир,2005.
- 1147 с.
8. Рахлеева А.А., Терехова В.А. Модификация методики биотести рования на основе оценки выживаемости инфузорий Pаramecium caudatum. Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям: I Всерос. научно-практич. конф. с междунар. участием; 23-25 апреля 2008 г., М.: МАКС Пресс. С. 255-256.
9. Определитель бактерий Берджи, 10-е изд., в 2-х томах. - М.: Мир, 1997. -800 с.
В настоящее время ведется поиск эффективных и безопасных методов снижения уровня бактериального загрязнения водоемов, инактивации бактерий в медицинской практике, — одним из которых является фотодина-мическая терапия (ФДТ), заключающаяся в инактивации бактерий активными формами кислорода (АФК), которые образуются при комбинированном воздействии искусственно внесенных фотосенсибилизаторов и света спектрального состава, соответствующего полосам поглощения фотосенсибилизаторов. [1,2,3]. Однако, в водоемах постоянно идут естественные процессы образования АФК в связи с присутствием в водной среде фотосенсибилизаторов (пигментов), субстратов окисления (органических веществ), и металлов переменной валентности. Эти процессы, возможно и определяют антагонистические отношения водорослей и бактерий. Развитие культур микроводорослей сопровождается постепенным накоплением в среде внеклеточных органических веществ (ВОВ) [4]. В фильтратах водорослей обнаружены белки, липиды, аминокислоты, фенольные соединения, углеводы, гормоны, антибиотики, органические кислоты и другие соелинения, некоторые из которых физиологически активны [5].
При выяснении причин гибели бактерий в растущей культуре водоросли Westella botryoides было высказано предположение, что свет может инициировать образование веществ, обладающих антибактериальной активностью из неактивных предшественников, входящих в состав внеклеточных метаболитов. При этом имели в виду фотохимические дериваты хлорофиллидов в период активного роста и липиды в фазу отмирания культуры морской водоросли [6]. Несмотря на имеющиеся данные, остаются неясными причины возможного проявления бактерицидного действия внеклеточных веществ водорослей.
В связи с вышеизложенным в данной работе представлены результаты изучения антибактериальных свойств компонентов внеклеточных метаболитов культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa в лабораторных условиях.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали ак-сеничную культуру водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. штамм DMMSU-S-39 из коллекции кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова. Культуры выращивали накопительным методом в оптимальных для роста условиях по освещенности и температуре. В качестве тест-объектов использовали культуры бактерий из той же коллекции: грамположительные Staphylococcus aureus шт. 205, Bacillus subtilis и грамотрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (выращивали на чашках Петри на МПА).
Численность клеток определяли прямым счетом в камере Горяева Мертвые клетки определяли по окрашиванию метиленовым синим подсчетом 500—1000 клеток. Ошибка не превышала 5—7%. ВОВ определяли после сжигания с бихроматом калия колориметрически при 630 нм [7]. Для испытания антибактериальной активности метаболитов использовали экстракты среды водоросли C. pyrenoidosa с конца экспоненциальной фазы роста (7 сут.), численность (N) клеток приводили к 500 млн кл./мл. Ступенчатую экстракцию проводили растворителями различной полярности [8]. Антибактериальную активность экстрактов определяли методом дисков на чашках Петри [9]. Тонкослойную хроматографию липидов проводили в
