CC BY
65
Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 2007; (3): 36-40.
28. Chausov E.V., Ternovoi V.A., Kochneva G.V., Sviatchenko V.A., Sivo-lobova G.F., Grazhdantseva A.A., Kiselev N.N., Sakharova E.G., Netesov S.V. Detection of Hepatitis E virus in Acute Hepatitis in Siberia. Moleku-lyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2007; (3): 131-6. (in Russian)
29. Guo Q.S., Yan Q., Xiong J.H., Ge S.X., Shih J.W., Ng M.H., Zhang J., Xia N.S. Prevalence of hepatitis E virus in Chinese blood donors. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(1): 317-8. doi: 10.1128/JCM.01466-09.
30. Kanai Y., Tsujikawa M., Yunoki M., Nishiyama S., Ikuta K., Hagiwara K. Long-term shedding of hepatitis E virus in the feces of pigs infected naturally, born to sows with and without maternal antibodi-es. J. Med. Virol. 2010; 82(1): 69-76.
Поступила 01.09.13
SEARCH FOR RNA OF THE HEPATITIS E VIRUS AUTOCHTHONOUS FOR RUSSIA IN THE MOST LIKELY INFECTION SOURCES
Voronina O. L, KundaM. S, Gudov V. P., Aksenova E. I., Shilova V. S, YaroshL. V., Elgort D. A, LuninV. G, Semenenko T. A.
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
The research carried out for 30 years from the moment of hepatitis E virus (HEV) discovery has proved the presence of the autochthonous HEV in non-endemic areas: Europe and Russia. Monitoring of the HEV antibodies (anti-HEV) among the Russian population has revealed regions with increased seroprevalence that testifies to high probability of local HEV infection in these areas. Contact with HEV can represent special danger for patients of the risk groups. In this work, the blood sera testing was carried out in order to assess the anti-HEV presence among these contingents (groups). Seropositive sera from the patients from the regions with high anti-HEV seroprevalence, risk groups patients, samples with high probability of HEV occurrence including the animals as possible reservoir, have been used for RNA extraction. The developed system of HEV RNA detection both in real-time RT-PCR and in a nested PCR variant has confirmed its sensitivity to the synthetic reference templates and positive control samples in commercial test system (Genesig, Great Britain).
HEV RNA was absent in all tested samples. This indicates a low frequency of the autochthonous HEV carriage occurrence. Sampling enlargement to tens of thousands persons is necessary for significant HEV RNA detection.
Key words: hepatitis E virus; anti-HEV IgG; anti-HEV IgM; HEVRNA
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.832.1:578.53]:615.37
Киселева И.В., Ларионова Н.В., Баженова Е.А., Федорова Е.А., Дубровина И.А.,
Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г.
роль нейраминидазы в формировании чувствительности вирусов гриппа к сывороточным ингибиторам и эффективности
реассортации
Отдел вирусологии ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН, 197376, Санкт-Петербург, Россия
Живая гриппозная вакцина состоит из реассортантных вирусов гриппа, содержащих гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ЫА) от циркулирующего вируса, и 6 генов, кодирующих внутренние белки, от холодоадаптированного донора аттенюации (формула генома 6:2). В данном исследовании описаны сложности, возникающие при получении вакцинных штаммов, в зависимости от фенотипических характеристик эпидемического вируса, использованного для реассортации. Анализ состава генома 849 реассортантных вирусов показал, что более 80% реассортантов, полученных на основе ингибитороустойчивых вирусов, унаследовали ЫА от "дикого" (эпидемического) родителя, тогда как среди реассортантов на основе ингибиторочувствительных вирусов их число не превышало 26%. При этом наибольший процент реассортантов с вакцинной формулой генома удавалось получить в случаях, когда "дикий" родитель был устойчив к неспецифическим ингибиторам нормальной сыворотки крови. Мы показали, что ЫА может играть роль в чувствительности вируса к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Замена ЫА ингибиторочувствительного "дикого" вируса на ЫА ингибитороустойчивого донора аттенюации значительно снижала чувствительность полученных реассортантов к термостабильным сывороточным ингибиторам.
Ключевые слова: вирус гриппа; живая гриппозная вакцина; нейраминидаза; сывороточные ингибиторы; реассортация.
Живая гриппозная вакцина (ЖГВ) состоит из реассортантных вирусов, полученных при скрещивании «дикого» (^Г) вируса и холодоадаптированного (ХА) донора аттенюации и содержащих гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ЫА) от WT вируса гриппа, а остальные 6 сегментов генома - от ХА донора (формула генома 6:2). Успех получения вакцинных реассортантов зависит от комплекса факторов, включающих фенотипические свойства WT родительского вируса. В настоящем исследовании мы проанализировали 849 реассортантов WT-вирусов с ХА-донорами аттенюации и описали некоторые аспекты сложностей подготовки кандидатов в ЖГВ, в частности проблемы при использовании
WT-вирусов гриппа, чувствительных к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки крови, и выявили возможную роль NA в формировании этого признака.
Материалы и методы
Вирусы. В работе использованы 42 вируса гриппа типа А и В: 1) «дикие» вирусы гриппа, полученные из Центра по контролю за заболеваемостью (CDC, Atlanta, GA, USA); 2) реассортантные вакцинные штаммы для парентерально вводимой инактивиро-ванной вакцины подтипа H5N1 (NIBRG-23, INDO/05, VN1203) на основе донора «высокой урожайности» A/PR/8/34 (H1N1) (PR8), полученные из CDC и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). PR8-реассортанты были подготовлены методом обратной генетики с использованием в качестве источников антигенных детерминант H5N1 штаммов А/индюк/Турция/1/05, А/Индонезия/5/05, А/Вьетнам/1203/2004 соответственно. Для снижения патогенности сайтрасщепления НА0 предшественника гемагглютинина был при этом модифицирован путем удаления триплетов, кодирующих 4 основные аминокислоты; 3) ХА-доноры аттенюации, А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) и В/ СССР/60/69 (В60), используемые для подготовки отечественной ЖГВ и являющиеся собственностью ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, Россия).
Вирусы поддерживали путем пассажей в 10-П-дневных развивающихся куриных эмбрионах при температуре 32-33°C.
Получение реассортантов осуществляли по стандартной методике [1] в присутствии поликлональной кроличьей или крысиной антисыворотки к донорам аттенюации.
Выделение РНК. РНК выделяли из вируссодержащей аллан-тоисной жидкости с использованием набора QIAamp Viral RNA minikit по инструкции производителя («Qiagen GmbH Hilden», Germany).
Анализ состава генома реассортантов. Происхождение сегментов РНК реассортантов определяли с использованием ре-стрикционного анализа (RFLP) [2], или методом микс-ПЦР [3]. Секвенирование осуществляли с использованием набора BigDye
Terminator v3.1 и секвенатора 3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems», Carlsbad, CA, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа данных секвенирования использовали программный пакет Lasergene 7.1.
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили по стандартному протоколу [4], в 96-луночных планшетах при комнатной температуре с 1% суспензией эритроцитов кур или человека группы 0(I) Rh+. Для анализа чувствительности вирусов гриппа к неспецифическим ингибиторам использовали неиммунную сыворотку морских свинок (питомник Рапполово, Ленинградская область), прогретую при 80°С в течение 10 мин для удаления термолабильных ингибиторов. Вирус считали устойчивым к неспецифическим сывороточным ингибиторам, если титр сыворотки в РТГА не превышал 40, и чувствительным - при титре 80 и более.
Статистический анализ. Критерий х2 Пирсона использовался для определения значимости различий эффективности реассортации вирусов с разными показателями ингибиторочув-ствительности, и критерий t Стьюдента для зависимых переменных для оценки различий среднегеометрических титров в реакции РТГА с нормальной сывороткой между группами вирусов с различной степенью чувствительности к ингибиторам. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,01.
Результаты и обсуждение
Классический метод получения реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ включает скрещивание в РКЭ при 32°C родительских вирусов (донора аттенюации и WT-вируса, взятых в равных инфекционых дозах), селективные пассажи в присутствии поликлональной антисыворотки к донору аттенюации при
Таблица 1
Распределение наследования сегментов генома реассортантами, полученными на основе вирусов гриппа А (ШШ), А (ИЭШ) и В, циркулировавших в разные периоды
Реассортанты на основе 18 вирусов гриппа А (НШ1) и А (Н3Ы2), циркулировавших:
сег- до 2000 г. после 2000 г.
менты % (n)1 % (n)2 % (n)1 % (n)3
ма от WT-родителя от донора Л172 от WT-родителя от донора Л17
PB2
PB1
PA
HA
NP
NA
M
NS
2,1 5,2 2,1 100,0 29,9 91,8
42.3
47.4
(2) (5) (2) (97) (29) (89) (41) (46)
97,9
94.8
97.9 0,0 70,1 8,2 57,7 52,6
(95) (92) (95) (0) (68) (8) (56) (51)
9,6
40.4 9,6
100,0 44,2
13.5 65,4
(5) (21) (5) (52) (23) (7) (34) (42)
90,4 59,6
90.4 0,0 55,8
86.5
34.6 19,2
(47) (31) (47) (0) (29) (45) (18) (10)
Реассортанты на основе 17 вирусов гриппа В, циркулировавших:
сег- до 2000 г. после 2000 г.
менты генома % (n)1 % («)2 % % («)3
от WT-родителя от донора В603 от WT-родителя от донора В60
PB2 8,3 (1) 91,7 (11) 19,9 (48) 80,1 (193)
PB1 17,0 (2) 83,0 (10) 39,8 (96) 60,2 (145)
PA 16,7 (2) 83,3 (10) 10,0 (24) 90,0 (217)
HA 100,0 (12) 0,0 (0) 100,0 (241) 0,0 (0)
NP 41,7 (5) 58,3 (7) 39,8 (96) 60,2 (145)
NA 91,7 (11) 8,3 (1) 11,2 (27) 88,8 (214)
M 50,0 (6) 50,0 (6) 90,0 (217) 10,0 (24)
NS 66,7 (8) 33,3 (4) 78,0 (188) 22,0 (53)
Примечание. 'Число реассортантов, унаследовавших данный ген от соответствующего родительского вируса; 2Донор ат-тенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2); 3Донор аттенюации В/ СССР/60/69.
пониженной до 25-26°С температуре с последующим клонированием предельными разведениями [1]. Теоретически при скрещивании двух штаммов вируса гриппа возможно формирование 256 различных комбинаций генов. Использование двух мощных селектирующих факторов (антисыворотки к донору аттенюации и пониженной температуры инкубации) приводит к существенному снижению количества нежелательных комбинаций, однако в ряде случаев их число продолжает оставаться достаточно большим.
Ежегодно ВОЗ дает рекомендации по составу гриппозных вакцин на текущий эпидемический сезон [5]. В соответствии с российской нормативной документацией для вакцинного штамма ЖГВ допустимы только формулы генома 6:2 и 5:3 [6] при условии, что третий ген, унаследованный от WT-вируса, не является одним из генов полимеразного комплекса. Подготовка ЖГВ методом классического скрещивания - достаточно долгий и трудоемкий процесс, занимающий как минимум 2,5-3 мес. Успешное и быстрое получение вакцинных реассортантов зависит от комплекса факторов, решающими из которых являются феноти-пические свойства "дикого" родительского вируса.
До конца 1990-х - начала 2000-х годов на основе циркулирующих в те годы вирусов гриппа А и В удавалось регулярно получать вакцинные штаммы с желаемой формулой генома 6:2. При этом гены НА и ЫА практически всегда переходили в геном вакцинного реассортанта от WT-родителя, а гены, кодирующие белки нуклеопротеидного комплекса (РВ2, РВ1, РА и ЫР), - от ХА-донора аттенюации. Процент «холодных» М- и ЫБ-генов был также достаточно высоким (табл. 1). Однако в последние годы при реассортации появляется все больше случаев разобщения генов, кодирующих НА и ЫА. Так, среди реассортантов, полученных от вирусов гриппа А, циркулировавших после 2000 г., только 13,5% содержали ЫА от WT-родительского вируса. Среди реассортантов от вирусов гриппа В тех же лет выделения эта цифра составляла 11,2%. Снизилось также число реассор-тантов, наследующих внутренние гены от доноров аттенюации (см. табл. 1).
В последнее время многие штаммы, рекомендуемые ВОЗ для подготовки на их основе гриппозных вакцин на будущий эпидемический сезон, были высокочувствительны (ИЧ) к неспецифическим ингибиторам нормальной сыворотки крови. Таковы, в частности, целый ряд современных вирусов гриппа А (Н3Ы2) и подавляющее большинство вирусов гриппа В линии Ямагата [7, 8]. Нами проведен анализ 40 WT-родительских вирусов по признаку их чувствительности к термостабильным ингибиторам и полученных из них 849 реассортантов с донорами аттенюации.
ЫА ингибитороустойчивых (ИУ) вирусов гриппа А (Н3Ы2) и В встраивалась в геном реассортантных вирусов значительно чаще, чем ЫА ИЧ-вирусов (95,9 и 87,5% соответственно). Что касается вирусов гриппа сероподтипа А (Н1Ы1), до настоящего времени в литературе не описана циркуляция в природе их ингибиторочув-ствительных вариантов. Анализ распределения WT- или ХА-ЫА среди 136 ингибитороустойчивых реассортантов этих вирусов с донором аттенюации также продемонстрировал преимущественное наследование гена, кодирующего ЫА, от WT-родителя (95,6%) (табл. 2). Малое число использованных для анализа "диких" вирусов гриппа других сероподтипов (два Н2Ы2 и три Н5Ы1) не позволяет сделать однозначные выводы. Возможно, в этом случае включаются какие-то иные, пока не известные механизмы.
В целом геномный анализ реассортантов, подготовленных на основе 20 ИЧ вирусов, показал, что только треть от общего числа клонов (130 из 493) унаследовала ЫА «дикого» типа. Наоборот, среди 356 ИУ-реассортантов, полученных на основе 20 ИУ-вирусов, только 59 приобрели ЫА от донора аттенюации (см. табл. 2). Статистическая обработка полученных данных с использованием критерия х2 Пирсона показала достоверность различий в уровне наследования реассортантными вирусами «дикой» ЫА от ИУ и ИЧ «диких» вирусов (уровень значимости р < 0,0001) (табл. 3).
Ингибиторы гемагглютинирующей активности вируса гриппа присутствуют как в сыворотках крови животных и человека, так и в секреторных жидкостях [9-12]. Слизистая оболочка респираторного тракта является не только входными воротами инфекции, но и местом, где начинается первичная защита организма от респираторных заболеваний. С этих позиций ИУ-вакцинные вирусы имеют определенное преимущество в прикреплении и проникновении в чувствительные клетки организма-хозяина по сравнению с вакцинными штаммами,
Таблица 2
Состав генома и частота наследования WT- или XA-NA реассортантами на основе холодоадаптированного донора аттенуации и циркулирующих вирусов гриппа с различной чувствительностью к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки
морской свинки
«Дикий» родитель Реассортанты1
число вирусов ингибиторчувстви- всего Происхождение NA Формула генома2
тельность WT, % ХА, % 6:2, % 5:3, % 7:1, % Другие, %
Вирусы гриппа А (H3N2)
5 Устойчивые 74 71 (95,9%) 3 (4,1%) 7 (9,5%) 25 (33,8%) 1 (1,4%) 41 (55,3%)
6 Чувствительные 126 26 (20,6%) 100 (79,4%) 12 (9,5%) 13 (10,3%) 10 (7,9%) 91 (72,2%)
Вирусы гриппа А (H1N1)3
7 Устойчивые 136 130 (95,6%) 6 (4,4%) 71 (52,2%) 37 (27,2%) 0 28 (20,6%)
Вирусы гриппа А (H2N2)
1 Устойчивый 5 5 (100%) 0 4 (80,0%) 1 (20,0%) 0 0
1 Чувствительный 29 29 (100%) 0 0 4 (13,8%) 0 25 (86,2%)
Вирусы гриппа A (H5N1)
2 Устойчивые 53 14 (26,4%) 39 (73,6%) 0 0 39 (73,6%) 14 (26,4%)
1 Чувствительный 12 12 (100%) 0 0 0 0 12 (100%)
Все вирусы гриппа А
14 Устойчивые 268 220 (82,1%) 48 (17,9%) 82 (30,6%) 63 (23,5%) 40 (14,9%) 83 (31,0%)
9 Чувствительные 167 67 (40,1%) 100 (59,9%) 12 (7,2%) 17 (10,2%) 10 (6%) 128 (76,6%)
Все вирусы гриппа В
6 Устойчивые 88 77 (87,5%) 11 (12,5%) 21 (23,9%) 30 (34,1%) 1 (1,1%) 36 (40,9%)
11 Чувствительные 326 63 (19,3%) 263 (80,7%) 12 (3,7%) 12 (3,7%) 91 (27,9%) 211 (64,7%)
Все вирусы гриппа (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, В)
20 Устойчивые 356 297 (83,4%) 59 (16,6%) 103 (28,8%) 93 (26,1%) 41 (11,5%) 119 (33,4%)
20
Чувствительные
493
130 (26,4%) 363 (73,6%) 24 (4,9%) 29 (5,9%) 101 (20,5%) 339 (68,7%)
Примечание. 1Все реассортанты наследовали НА от «дикого» вируса; 2формулы генома: 6:2 - реассортанты, унаследовавшие НА и ЫА от «дикого» вируса; 5:3 - реассортанты, содержащие НА и ЫА, а также один из генов ЫР, М, или ^ от «дикого» родителя; 7:1 -одногенные реассортанты, содержащие только НА от «дикого» вируса; 3среди вирусов, относящихся к подтипу Н1Ш, не было обнаружено ингибиторчувствительных вариантов.
подготовленными на основе ИЧ WT-вирусов, и могут лучше подходить для вакцинации человека. В литературе нет единого мнения о том, какой WT-штамм лучше использовать для подготовки ЖГВ: ИУ или ИЧ, однако допускается, что ИУ-штаммы могут быть предпочтительнее при подготовке вакцины для людей [13].
Стандартный протокол подготовки реассортантных штаммов для ЖГВ включает обработку антисыворотки к донору аттенюа-ции с помощью receptor destroying enzyme (RDE) для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Однако даже обработанная таким образом сыворотка содержит остаточный уровень термостабильных ингибиторов [9, 14, 15], что искажает значения ее титра и осложняет получение вакцинных реассортантов на основе ИЧ-эпидемических вирусов.
Известно, что чувствительность или устойчивость вируса гриппа к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови определяются свойствами его НА [16]. Указанный признак наследуется реассортантными вирусами вместе с геном, кодирующим этот поверхностный белок. Некоторые авторы отводят определенную роль в формировании ингибиторочувствительности не только к HA, но и NA. В частности, установлено, что ингибиторы сыворотки препятствуют проникновению ИЧ-вируса в клетку в результате конкуренции за сайт связывания HA с рецептором SA-альфа-2,6-Gal. Ингибирование NA природно устойчивых к ингибиторам вирусов гриппа приводило к тому, что эти вирусы становились ингибиторочувствительными [17]. Возможно, обнаруженное нами в ряде случаев преимущественное наследование реассортант-ным штаммом НА от "дикого", а NA - от ХА родителя может быть связано с особенностями НА и NA "дикого" вируса.
Реассортанты, несущие НА ИУ-донора аттенюации, в процессе реассортации нейтрализуются антисывороткой к донору, а его NA, вероятно, имеет определенные преимущества перед NA ИЧ "дикого" вируса и каким-то образом конкурирует с ней при встраивании в геном реассортантного вируса. Возможно, такие
конкурентные отношения могут быть объяснены определенной, еще не установленной ролью NA в формировании ИЧ-фенотипа вируса гриппа. Ниже мы попытались найти ответ на этот вопрос.
Анализ эффективности получения штаммов с вакцинной формулой генома показал, что ряд использованных нами вирусов легко вступали в реассортацию с донорами аттенюации с формированием значительного числа клонов с формулой генома 6:2 (например, ИУ-вирусы гриппа H1N1). При скрещивании с донорами других вирусов мы столкнулись с определенными трудностями. В частности, из 29 реассортантов на основе ИЧ-вируса гриппа H2N2 только 4 обладали формулой генома 5:3 и ни один - вакцинной формулой 6:2.
При попытке получения вакцинного штамма ЖГВ против двух ИУ высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 скрещиванием И5№^8-реассортантов (VN1203 и IND0/05) с ХА-донором аттенюации Л17 оказалось, что 73,6% изолированных клонов унаследовали от родителей VN1203 и INDO/05 только гем-агглютинин (формула генома 7:1). Невозможность получения 6:2 реассортантов при скрещивании ХА-донора аттенюации с Н5Ш-РР8-штаммами для ИГВ описана и в работе [18]. Что же касается ИЧ Н5№-РР8-реассортанта - NIBRG-23, то он в классическую реассортацию не вступал вообще. Вероятно, связь генов H5N1-PR8 в геноме вируса NIBRG-23 настолько прочна, что ее практически невозможно нарушить, используя классический метод реассортации с донором аттенюации.
Мы проанализировали частоту получения реассортантов с вакцинными формулами генома и всеми другими возникающими комбинациями с помощью критерия х2 Пирсона. Реассортан-ты с вакцинной формулой генома получались достоверно чаще при использовании в качестве WT-родительского вируса ИУ штамма (х2 195,78; p < 0,0001) (см. табл. 2, 3).
В литературе описаны вирусы, с трудом поддающиеся скрещиванию. В ряде случаев авторам не удалось получить 6:2 ре-
Таблица 3
Статистический анализ полученных данных с использованием критерия х2 Пирсона и ¿-критерия Стьюдента
Исследованные вирусы
Чувствительность к ингибиторам1
Группа сравнения
Количество реассортантов/всего
Уровень значимости (p)
Эффективность наследования NA реассортантами
Все вирусы гриппа А
Все вирусы гриппа В
Все вирусы А и В
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
WT-NA ХА-NA WT-NA ХА-NA WT-NA
ХА-NA
220/268 67/167 48/268 100/167 77/88 63/326 11/88 263/326 297/356 130/493 59/356 363/493
80,74
143,90
269,21
Эффективность получения штаммов с вакцинной формулой генома (6:2 и 5:3) путем реассортации
Все вирусы гриппа А
Все вирусы гриппа В
Все вирусы А и В
Группа сравнения
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Устойчивые Чувствительные
Вакцинная формула генома
Другие комбинации Вакцинная формула генома
Другие комбинации Вакцинная формула генома Другие комбинации
145/268 29/167 123/268 138/167 51/88 24/326 37/88 302/326 196/356 53/493 160/356 440/493
57,
119,57
195,78
/-критерий
Снижение ингибиторочувствительности у реассортантных вирусов (титр РТГА)
Ингибитороустойчивый "дикий" родитель (титр в РТГА4 < 10)
6:2 WT/ХА-реассортанты с HA2 и NA2 от ингибитороустойчивого родителя (титр в РТГА < 10)
Ингибиторочувствительный "дикий" родитель 6:2 WT/ХА-реассортанты с HA3 и NA3 от ингибиторо-
(титр в РТГА = 2560-10240)
чувствительного родителя (титр в РТГА 2560-10240) 7:1 реассортанты, содержащие НА3-ингибиторочувствительного и NA2-ингибитороустойчивого родителя (титр в РТГА 80-320)_
0 0
11,09
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,0001
p < 0,0001
Уровень значимости (p)
p > 0,99 p > 0,99 p < 0,0001
Примечание. 1Чувствительность к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки морской свинки; 2гены, полученные от вируса, устойчивого к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки морской свинки; 3гены, полученные от вируса, чувствительного к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки морской свинки; 4РТГА: реакция торможения гемагглютинации.
ассортанты [19]. Так, несмотря на многочисленные попытки, авторы не получили 6:2 реассортанты на основе эпидемических вирусов А/Кавасаки/1/86 (H1N1) или А/Техас/36/91 (H1N1). В геноме полученных реассортантов постоянно присутствовали гены PB2, NP и NS только от эпидемических родительских вирусов. Авторы предполагают некую функциональную несовместимость генов вирусов, использованных ими для скрещивания.
Существуют определенные методы повышения эффективности процесса реассортации, в частности инактивация «дикого» родителя нагреванием [20] или ультрафиолетовым облучением (УФО) [21, 22]. В наших опытах предварительная инактивация УФО вируса NlBRG-23 (H5N1) не привела к формированию 6:2 или 5:3 реассортантов, однако удалось получить штаммы с формулой генома 7:1 [23].
Неудачи с попыткой получения ХА вакцинных штаммов H5N1 с формулой генома 6:2 методом классической реассортации не должны обескураживать. Возможно, формула генома 7:1 вакцинного штамма ЖГВ против высокопатогенных, пандемически опасных вирусов гриппа птиц подтипа A (H5N1) имеет свои преимущества: присутствие в вакцинном штамме еще
одного гена от донора аттенюации (NA) является дополнительной гарантией его безопасности. Кроме того, согласно общепризнанным представлениям [24], именно антитела к HA вируса гриппа являются одним из важных компонентов протекции от вирусов гриппа человека, и в значительно меньшей степени - к NA. Вирусы гриппа птиц H5N1 в этом отношении не являются исключением [25].
Обнаруженный нами избирательный переход в состав генома реассортантных штаммов вирусов гриппа NA от WT- или ХА-вируса в зависимости от ИЧ фенотипа WT-родителя ставит вопрос об участии NA в формировании чувствительности к неспецифическим термостабильным ингибиторам сыворотки крови. Хотя известно, что именно НА определяет чувствительность вирусов гриппа к неспецифическим ингибиторам [17], некоторые авторы отводят определенную роль в формировании этого признака и NA [17]. Мы проанализировали 9 WT-вирусов гриппа А и В, 2 ХА-донора аттенуации, 6 - 6:2 реассортантов, содержащих HA и NA от WT-вируса и внутренние гены от донора аттенюации (R2, R10, R13, R15, R16, R19), а также 13 7:1 реассортантов, унаследовавших от WT всего один ген, кодирующий НА,
х
Таблица 4
Чувствительность вирусов гриппа к нормальной сыворотке морских свинок в реакции торможения гемагглютинации
Вирус Название штамма Происхождение гена Титр РТГА Чувствительность к ингибиторам
код тип (подтип) HA NA
Вирусы гриппа А
Л171 А/Ленинград/135/17/57 H2N2 Л17 Л17 < 10 Устойчивый4
WT2 A/Калифорния/07/04 H3N2 WT WT 2560 Чувствительный5
R13 A/Калифорния /07/04 х Л17 H3N2 WT Л17 320 Чувствительный (<)7
R2 A/Калифорния /07/04 х Л17 H3N2 WT WT 2560 Чувствительный (=)7
WT NIBRG-23 H5N1 WT WT 5120 Чувствительный
R3 NIBRG-23 х Л17 H5N2 WT Л17 640 Чувствительный (<)
R4 NIBRG-23 х Л17 H5N2 WT Л17 640 Чувствительный (<)
R5 NIBRG-23 х Л17 H5N2 WT Л17 640 Чувствительный (<)
WT IND0/05 H5N1 WT WT 10 Устойчивый
R6 IND0/05 х Л17 H5N2 WT Л17 10 Устойчивый (=)
R7 IND0/05 х Л17 H5N2 WT Л17 10 Устойчивый (=)
WT VN1203 H5N1 WT WT < 10 Устойчивый
R8 VN1203 х Л17 H5N2 WT Л17 < 10 Устойчивый (=)
R9 VN1203 х Л17 H5N2 WT Л17 < 10 Устойчивый (=)
R106 A/Вьетнам/1203/2004 х Л17 H5N2 WT WT < 10 Устойчивый (=)
Вирусы гриппа В
В60 В/СССР/60/69 B В60 В60 < 10 Устойчивый
WT B/Харбин/07/94 B WT WT 10240 Чувствительный
R11 B/ Харбин /07/94 х В60 B WT В60 2560 Чувствительный (<)
WT B/Техас/26/08 B WT WT < 10 Устойчивый
R12 B/Техас/26/08 х В60 B WT В60 < 10 Устойчивый (=)
R13 B/Техас/26/08 х В60 B WT WT < 10 Устойчивый (=)
WT B/Висконсин/1/10 B WT WT 5120 Чувствительный
R14 B/Висконсин/1/10 х В60 B WT В60 320 Чувствительный (<)
R15 B/Висконсин/1/10 х В60 B WT WT 5120 Чувствительный (=)
R16 B/Висконсин/1/10 х В60 B WT WT 5120 Чувствительный (=)
WT B/Бангладеш/1994/10 B WT WT 5120 Чувствительный
R17 B/Бангладеш/1994/10 х В60 B WT В60 640 Чувствительный (<)
WT B/Техас/06/11 B WT WT 640 Чувствительный
R18 B/Техас/06/11 х В60 B WT В60 80 Чувствительный (<)
R19 B/Техас/06/11 х В60 B WT WT 640 Чувствительный (=)
Примечание. 'Донор аттенюации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) или В/СССР/60/69 (B60). 2Эпидемический вирус (либо реассортант на основе PR8 с RA и NA от соответствующего «дикого» вируса). 3Реассортанты «дикого» вируса с донором аттенюации; реассортанты, унаследовавшие НА от «дикого» вируса, а NA от «дикого» вируса (формула генома 6:2) или от донора аттенюации (формула генома 7:1). 4Вирус, устойчивый к термостабильным неспецифическим ингибиторам сыворотки. 5Вирус, чувствительный к термостабильным неспецифическим ингибиторам сыворотки. 66:2 реассортант R10 получен с использованием метода обратной генетики по методике, описанной в [26]. Чувствительность реассортантного вируса к температуростабильным неспецифическим ингибиторам сыворотки в сравнении с «диким» родительским вирусам; p < 0,0001).
а остальные 7 генов - от донора аттенюации ^1, R3-R9, R11, R12, R14, R17, R18). Было показано, что 6 из 9 WT-вирусов были высоко ИЧ к ингибиторам нормальной сыворотки крови морской свинки (табл. 4). Оба донора аттенюации и вирусы УЫ1203, ШВ0/05 и В/Техас/26/08 оказались высоко ИУ (их титр в РТГА не превышал 10).
Степень ингибиторочувствительности реассортантных вирусов с формулами генома 6:2 и 7:1 существенно различалась, если в качестве источника поверхностных антигенов использовали ИЧ WT-вирус. Отмечено как минимум 4-кратное снижение титра в РТГА с нормальной сывороткой морской свинки у всех 7:1 реассортантов, унаследовавших НА от ИЧ-родителя, а ЫА - от ИУ донора аттенюации, по сравнению с аналогичными 6:2 реаассортантами и/или родительскими вирусами ^ = 11,09; р < 0,0001; см. табл. 3). В частности, титр в РТГА высоко ИЧ-вируса NIBRG-23 (Н5№) составлял 5120. Титр же его 7:1 реассортанта R3 при использовании той же самой сыворотки был только 640.
Чтобы понять, связано ли отмеченное снижение ингибиторо-чувствительности 7:1 реассортантных вирусов непосредственно с изменившимся функционированием ЫА, мы сравнили нуклео-тидные и аминокислотные последовательности этого гена у
WT-родителей и соответствующих им реассортантов. Что интересно, мы обнаружили идентичные мутации у некоторых реас-сортантов вируса гриппа типа А (нуклеотид 765 у реассортантов R3 и R9) и типа В (нуклеотид 1085 у реассортантов R11 и R17, нуклеотид 1359 у реассортантов R14 и R18) (табл. 5).
Эти замены могут быть новыми спонтанными мутациями в позициях, ответственных за адаптацию вируса к куриным эмбрионам, или являться проявлением гетерогенности исходной популяции использованного вируса по данным позициям. Как бы там ни было, эти мутации не влияют на фенотип реассор-танта R4 и ни одна из описанных мутаций не изменила чувствительность вирусов к термостабильным ингибиторам. Например, реассортант R3 был так же чувствителен к ингибиторам, как два других реассортанта (R4 и R5), подготовленных на основе NIBRG-23 и донора Л17.
Таким образом, изменения в степени ингибиторочувстви-тельности 7:1 реассортантов скорее возникают в результате каких-то изменений функционирования NA, чем мутаций в ней.
Полученные нами данные позволяют предположить, что NA играет важную роль в эффективности реассортации WT-родительских вирусов гриппа с донорами аттенюации. Наибо-
Таблица 5
Отличия последовательностей гемагглютинина и нейраминидазы у одногенных реассортантов вирусов гриппа
Родительские вирусы Реассортанты Замены в HA и NA по сравнению с родительским вирусом
код принадлежность гена нуклеотидные замены аминокислотные замены
WT-вирус или реассортант на основе вируса PR8 донор HA NA HA NA HA1 NA
A/Калифорния/07/04 (H3N2) Л171 R1 WT Л17 Нет Нет Нет Нет
NIBRG-23 (H5N1) Л17 R3 WT Л17 M G-765-T M Arg-249-Ile
NIBRG-23 (H5N1) Л17 R4 WT Л17 M Нет M Нет
NIBRG-23 (H5N1) Л17 R5 WT Л17 M " M "
INDO/05 (H5N1) Л17 R6 WT Л17 M " M "
INDO/05 (H5N1) Л17 R7 WT Л17 M " M "
VN1203 (H5N1) Л17 R8 WT Л17 M " M "
VN1203 (H5N1) Л17 R9 WT Л17 Т-50-С G-765-T M Arg-249-Ile
T-417-C Нет Ile-114-Thr Нет
В/Харбин/07/94 В602 R11 WT В60 Нет G-1085-A Нет "
В/Техас/26/08 В60 R12 WT В60 " Нет " "
В/Висконсин/1/10 В60 R14 WT В60 " G-1359-A " Glu-436-Lys
В/Бангладеш/1994/10 В60 R17 WT В60 " G-1085-A " Нет
В/Техас/06/11 В60 R18 WT В60 " G-1359-A " Glu-436-Lys
Примечание. 'Донор аттенюации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). 2Донор аттенюации В/СССР/60/69.
лее высокий процент получения реассортантных штаммов ЖГВ с вакцинной формулой генома 6:2 и 5:3 достигался при скрещивании доноров аттенюации с "дикими" вирусами, устойчивыми к неспецифическим ингибиторам. Кроме того, было показано, что NA вносит определенный вклад в формирование ингиби-торочувствительного фенотипа вируса гриппа. Очевидно, что процесс подготовки ЖГВ выиграет от лучшего понимания генетических особенностей и механизмов неспецифической ингиби-тороустойчивости вирусов гриппа. Такие исследования должны продолжаться, чтобы установить механизмы этого явления.
Настоящая работа частично финансировалась Программой развития новых технологий в медицине (PATH, Вашингтон, США).
Сведения об авторах:
Киселева Ирина Васильевна - д-р биол. наук, рук. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии, ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН, 197376; Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, е-mail: [email protected]; [email protected];
Ларионова Наталья Валентиновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии; е-mail: [email protected];
Баженова Екатерина Андреевна - науч. сотр. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии; е-mail: [email protected];
Федорова Екатерина Алексеевна - мл. науч. сотр. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии; е-mail: fedorova.iem@ gmail.com;
Дубровина Ирина Анатольевна - науч. сотр. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии, е-mail: [email protected]
Исакова-Сивак Ирина Николаевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. общей вирусологии отдела вирусологии; е-mail: [email protected];
Руденко Лариса Георгиевна - д-р мед. наук, проф., зав. отделом вирусологии; е-mail: [email protected].
ЛИТЕРАТУРА
1. Wareing M.D., Marsh G.A., Tannock G.A. Preparation and characterization of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain. Vaccine. 2002; 20(16): 2082-90.
2. Klimov A., Cox N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortants live influenza vaccines. J. Virol. Methods.1995; 52(1-2): 41-9.
3. Киселева И.В., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Ларионова Н.В., Дубровина И.А., Бердыгулова Ж.А. и др. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 4: 29-36.
4. WHO Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. 2002. URL: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/whocdscsrnc-s20025rev.pdf (accessed 1 August 2013).
5. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines (2013). URL: http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommen-dations/en/index.html (accessed 1 August 2013).
6. О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрение в производство вакцин и диагностических препаратов. Приказ Министерства Здравоохранения РФ № 156/29 (1998). URL: http:// www.recipe.ru/docs/nd/print.php?id=1745 (accessed 1 Augeust 2013).
7. Larionova N., Kiseleva I., Isakova I., Litvinova O., Klimov A., Rudenko L. Naturally-occurring temperature-sensitive strains of influenza B virus. In: Influenza Vaccines for the World: Proc. IVW-2004 Conf. Losbon, Portugal, May 24-26, 2004; 92-7.
8. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Исакова И.Н., Литвинова О.М., Руденко Л.Г. Фенотипические особенности вирусов гриппа В разных лет выделения. Вопросы вирусологии. 2006; 51(5): 38-41.
9. Krizanova O., Rathova V. Serum inhibitors of mixoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1969; 47: 125-51.
10. Husseini R.H., Sweet C., Collie M.H., Smith H. The relation of interferon and nonspecific inhibitors to virus levels in nasal washes of ferrets infected with influenza viruses of differing virulence. Br. J. Exp. Pathol. 1981; 62(1): 87-93.
11. Ryan-Poirier K.A., Kawaoka Y. Distinct glycoprotein inhibitors of influenza A virus in different animal sera. J. Virol. 1991; 65(1): 389-95.
12. White M.R., Helmerhorst E.J. Multiple components contribute to ability of saliva to inhibit influenza viruses. Oral Microbiol. Immunol. 2009; 24: 18-24.
13. Peetermans J. Live influenza virus vaccines and preparation thereof. US patent N 3953592; 1976.
14. Choppin P.W., Tamm I. Studies of two kinds of virus particles which comprise influenza A2 virus strains. II. Reactivity with virus inhibitors in normal sera. J. Exp. Med. 1960; 112: 921-44.
15. Cohen A., Belyavin G. Hemagglutination inhibition of Asian influenza viruses: a new pattern of response. Virology. 1959; 7(1): 59-74.
16. Matrosovich M., Gao P., Kawaoka Y. Molecular mechanisms of serum resistance of human influenza H3N2 virus and their involvement in virus adaptation in a new host. J. Virol. 1998. 72(8): 6373-80.
17. Gimsa U., Grotzinger I., Gimsa J. Two evolutionary strategies of influenza viruses to escape host non-specific inhibitors: alteration of hemag-glutinin or neuraminidase specificity. Virus Res. 1996. 42(1-2): 127-35.
18. Gambaryan A.S., Lomakina N.F., Boravleva E.Y., Kropotkina E.A.,
Mashin V.V., Krasilnikov I.V. et al. Comparative safety, immunogenicity, and efficacy of several anti-H5N1 influenza experimental vaccines in a mouse and chicken models (Testing of killed and live H5 vaccine). Influenza Other Respi. Viruses. 2012; 6(3): 188-95.
19. SubbaraoK., Webster R.G., Kawaoka Y., Murphy B.R. Are there alternative avian influenza viruses for generation of stable attenuated avian-human influenza A reassortant viruses? Virus Res. 1995; 39(2-3): 105-18.
20. Lind P.E., Burnet F.M. Further studies of recombination between heat-inactivated virus and active virus. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1957; 35 (6): 531-40.
21. Gotlieb T., Hirst G.K. The experimental production of combination forms of virus. VI. Reactivation of influenza viruses after inactivation by ultraviolet light. Virology. 1956; 2 (2): 235-48.
22. Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Varich N.L., Ilyushina N.A. et al. Effect of gene constellation and post-reassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants. Arch. Virol. 2007; 152(6): 1139-45.
23. Larionova N., Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Rudenko L. Peculiarities of reassortment of cold-adapted influenza A master donor virus with viruses possessed avian origin HA and NA H5N1. Influenza Other Respi. Viruses. 2011; 5(Suppl. 1): 346-9.
24. Wilschut J.C., McElhaney L.E., Palache A.M., eds. Influenza. Amsterdam: Elsevier; 2006.
25. NayakB, Kumar S., DiNapoli J.M., PalduraiA., PerezD.R., CollinsP.L. et al. Contributions of the avian influenza virus HA, NA, and M2 surface proteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity. J. Virol. 2010; 84(5): 2408-20.
26. GustinK.M., Maines T.R., Belser J.A., van Hoeven N., Lu X., Dong L. et al. Comparative immunogenicity and cross-clade protective efficacy of mammalian cell-grown inactivated and live-attenuated H5N1 reassortant vaccines in ferrets. J. Infect. Dis. 2011; 204(10): 1491-9.
Поступила 18.06.13
REFERENCES
1. Wareing M.D., Marsh G.A., Tannock G.A. Preparation and characterization of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain. Vaccine. 2002; 20(16): 2082-90.
2. Klimov A., Cox N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortants live influenza vaccines. J. Virol. Methods.1995; 52(1-2): 41-9.
3. KiselevaI.V., Voeten J.T.M., TeleyL.C.P., LarionovaN.V., DubrovinaI.A., Berdygulova Zh. A. et al. Genome composition analysis of reassortant influenza viruses used in seasonal and pandemic live attenuated influenza vaccine. Mol. Gen. Microbiol. Virol. 2011; 4: 29-36.
4. WHO Manual on animal influenza diagnosis and surveillance (2002). URL: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/whocdsc-srncs20025rev.pdf (accessed 1 Augest 2013).
5. WHO Recommendations on the composition of influenza virus vaccines (2013). URL: http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommen-dations/en/index.html (accessed 1 Augest 2013).
6. Development of new influenza vaccine strains and diagnostics. Introduced by Order of the Ministry of Health of Russian Federation N 156/29 (1998). URL: http://www.recipe.ru/docs/nd/print.php?id=1745 (accessed 1 August 2013) (in Russian).
7. Larionova N., Kiseleva I., Isakova I., Litvinova O., Klimov A., Rudenko L. Naturally-occurring temperature-sensitive strains of influenza B virus. In: Proceedings of IVW-2004 Conf. Lisbon, Portugal, May 24-26, 2004: 92-7.
8. Larionova N.V., Kiseleva I.V., Isakova I.N., Litvinova O.M., Rudenko L.G. Phenotype of epidemic influenza B virus strains isolated in different years. Vopr. Virusol. 2006; 51(5): 38-41 (in Russian).
9. Krizanova O., Rathova V. Serum inhibitors of mixoviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1969; 47: 125-51.
10. Husseini R.H., Sweet C., Collie M.H., Smith H. The relation of interferon and nonspecific inhibitors to virus levels in nasal washes of ferrets infected with influenza viruses of differing virulence. Br. J. Exp. Pathol. 1981; 62(1): 87-93.
11. Ryan-Poirier K.A., Kawaoka Y. Distinct glycoprotein inhibitors of influenza A virus in different animal sera. J. Virology. 1991; 65(1): 389-95.
12. White M.R., Helmerhorst E.J. Multiple components contribute to ability of saliva to inhibit influenza viruses. Oral Microbiol. Immunol. 2009; 24: 18-24.
13. Peetermans J. Live influenza virus vaccines and preparation thereof. US patent N 3953592; 1976.
14. Choppin P.W., Tamm I. Studies of two kinds of virus particles which comprise influenza A2 virus strains. II. Reactivity with virus inhibitors in normal sera. J. Exp. Med. 1960; 112: 921-44.
15. Cohen A., Belyavin G. Hemagglutination inhibition of Asian influenza viruses: a new pattern of response. Virology. 1959; 7(1): 59-74.
16. Matrosovich M., Gao P., Kawaoka Y. Molecular mechanisms of serum resistance of human influenza H3N2 virus and their involvement in virus adaptation in a new host. J. Virol. 1998. 72(8): 6373-80.
17. Gimsa U., Grotzinger I., Gimsa J. Two evolutionary strategies of influenza viruses to escape host non-specific inhibitors: alteration of hemagglutinin or neuraminidase specificity. Virus Research. 1996. 42(1-2): 127-35.
18. Gambaryan A.S., Lomakina N.F., Boravleva E.Y., Kropotkina E.A., Mashin V.V., Krasilnikov I.V. et al. Comparative safety, immunogenicity, and efficacy of several anti-H5N1 influenza experimental vaccines in a mouse and chicken models (Testing of killed and live H5 vaccine). Influenza Other Respi Viruses. 2012; 6(3): 188-95.
19. Subbarao K., Webster R.G., Kawaoka Y., Murphy B.R. Are there alternative avian influenza viruses for generation of stable attenuated avian-human influenza A reassortant viruses? Virus Research. 1995; 39(2-3): 105-18.
20. Lind P.E., Burnet F.M. Further studies of recombination between heat-inactivated virus and active virus. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1957; 35 (6): 531-40.
21. Gotlieb T., Hirst G.K. The experimental production of combination forms of virus. VI. Reactivation of influenza viruses after inactivation by ultraviolet light. Virology. 1956; 2 (2): 235-48.
22. Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Varich N.L., Ilyushina N.A. et al. Effect of gene constellation and post-reassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants. Arch. Virol. 2007; 152(6): 1139-45.
23. Larionova N., Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Rudenko L. Peculiarities of reassortment of cold-adapted influenza A master donor virus with viruses possessed avian origin HA and NA H5N1. Influenza Other Respi. Viruses. 2011; 5(Suppl. 1): 346-9.
24. Wilschut J.C., McElhaney L.E., Palache A.M., eds. Influenza. Amsterdam: Elsevier; 2006.
25. Nayak B., Kumar S., DiNapoli J.M., Paldurai A., Perez D.R., Collins P.L. et al. Contributions of the avian influenza virus HA, NA, and M2 surface proteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity. J. Virol. 2010; 5: 2408-20.
26. Gustin K.M., Maines T.R., Belser J.A., van Hoeven N., Lu X., Dong L. et al. Comparative immunogenicity and cross-clade protective efficacy of mammalian cell-grown inactivated and live-attenuated H5N1 reassortant vaccines in ferrets. J. Infectious Diseases. 2011; 204(10): 1491-9.
Received 18.06.13
CONTRIBUTION OF NEURAMINIDASE OF INFLUENZA VIRUSES TO THE SENSITIVITY TO THE SERUM INHIBITORS AND REASSORTMENT EFFICIENCY
Kiseleva I. V., Larionova N. V., Bazhenova E. A., Fedorova E. A., Dubrovina I. A., Isakova-Sivak I. N., Rudenko L. G.
Department of Virology, Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russia The live attenuated influenza vaccine (LAIV) consists of reassortant viruses with hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) gene segments inherited from the circulating wild-type (WT) parental viruses and the 6 internal protein-encoding gene segments from the cold-adapted attenuated master donor viruses (genome composition 6:2). In this study, we describe the obstacles to developing LAIV vaccine strains depending on the phenotypic peculiarities of the WT viruses used for reassortment. The genomic composition analysis of 849 reassortants revealed that over 80% of the reassortants based on the inhibitor-resistant WT viruses inherited WT NA as compared to 26% of reassortants based on the inhibitor-sensitive WT viruses. In addition, the highest percentage of the vaccine genotype reassortants was achieved when WT parental viruses were resistant to the non-specific serum inhibitors. We demonstrate that NA may play a role in the influenza virus sensitivity to the non-specific serum inhibitors. Replacing NA of the inhibitor-sensitive WT virus with the NA of the inhibitor-resistant master donor virus significantly decreased the sensitivity of the resulting reassortant virus to the non-specific inhibitors.
Key words: influenza virus; live attenuated influenza vaccine; neuraminidase; serum inhibitors; reassortment.
Индекс 71452 Индекс 72152
для индивидуальных подписчиков для предприятий и организаций
ISSN 0208-0613. Молекул. генетика, микробиология и вирусология, 2014. № 3. 1-40.
