CC BY
13© Коллектив авторов, 2014 УДК 618.19-006.6-091.8:577.21
РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ 3: RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 -В ОПУХОЛЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
В.И. Логинов1, кандидат биологических наук, И.В. Пронина1, кандидат биологических наук, А.М. Бурденный1, кандидат биологических наук, Д.С. Ходырев2, кандидат биологических наук, Т.П. Казубская3, доктор медицинских наук, Э.А. Брага1, доктор биологических наук, профессор, А.А. Кубатиев1, академик РАН, профессор, Н.Е. Кушлинский3, член-корреспондент РАН, профессор
1Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Российская Федерация, 125315, Москва, ул. Байкальская, д. 8; Федеральный Научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России, Российская Федерация, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28; 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Российская Федерация, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24 E-mail: eleonora10 45@mail.ru
Введение. Эпигенетическая модификация с участием метилирования промоторных CpG-островков служит тонким и динамичным механизмом регуляции экспрессии генов в опухолях. Повышенная и пониженная экспрессия и изменение статуса метилирования гена рассматривают как первичные критерии онкогенной или супрессорной функции гена и как факторы прогноза рака.
Цель исследования. Оценка вклада метилирования в регуляцию экспрессии группы функционально важных генов хромосомы
3 при раке молочной железы (РМЖ); определение новых генов с чертами онкогенов или супрессоров, перспективных как прогностические маркеры.
Методы. Образцы опухолевой и окружающей гистологически неизмененной ткани от 69 больных РМЖ собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦРАМН. Содержание мРНКгенов определяли методом полуколичественной обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Анализ метилирования ДНК проводили с применением 2 метилчувствительных рестриктаз - HpaII и HhaI и последующей полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Результаты. Показана двоякая роль метилирования у генов GPX1, NKIRAS1, RHOA, DAG1 и USP4 с преобладанием опухолей с повышенной экспрессией, что характерно для онкогенов. Впервые установлена значимая корреляция между изменением уровня мРНК и структурными изменениями (метилированием/деметилированием и делециями/амплификациями) (p<W17 по Спирмену) для генов GPX1, NKIRAS1 и RHOA, и предварительно - для DAG1 и USP4. Вклад метилирования в дерегуляцию экспрессии детектирован у NKIRAS1 в 69% (18/26), DAG1 - 67% (4/6), USP4 - 83% (5/6), GPX1 - 34% (11/32), RHOA - 16% (5/32) образцов опухолей. Онкогенные свойства наиболее выражены у генов NKIRAS1, RHOA и DAG1, у которых доминировал повышенный уровень мРНК, ассоциированный с деметилированием или амплификацией локуса.
Заключение. Впервые показано, что изменение статуса метилирования генов GPX1, NKIRAS1, RHOA, DAG1 и USP4может влиять на уровень экспрессии в первичных опухолях больных РМЖ. Выявленные особенности генов NKIRAS1, RHOA и DAG1 (повышенный уровень мРНК, деметилирование или амплификация) могут быть использованы для разработки новых подходов к прогнозированию РМЖ.
Ключевые слова: регуляция экспрессии генов, метилирование/деметилирование, рак молочной железы
METHYLATION INVOLVEMENT IN REGULATION OF EXPRESSION OF FUNCTIONALLY SIGNIFICANT GENES ON CHROMOSOME 3: RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 IN BREAST CANCER
V.I. Loginov1, I.V. Pronina1, A.M. Burdennyy1, D.S. Khodyrev2, T.P. Kazubskaya3, E.A. Braga1, A.A. Kubatiev1, N.E. Kushlinskii3
institute of General Pathology and Pathophysiology, Baltiyskaya str., 8, Moscow, Russian Federation, 125315;
2Federal Research Clinical Center of specialized types of medical care and medical technologies, Orekhovyy bul'var, 28, Moscow, Russian Federation, 115682;
3N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Kashirskoe shosse, 24, Moscow, Russian Federation, 115478
Introduction. Epigenetic changes caused by methylation in promoter CpG-islands are a fine and dynamic mechanism of gene expression regulation in tumors. Increased and decreased expression and alterations in the methylation status of the gene are considered to be primary criteria for oncogenic or suppressor gene function and prediction of cancer.
The aim of the study. The assessment of the methylation contribution in the regulation of the expression of the functionally important genes on chromosome 3; the identification of new genes with features of oncogenes or tumor suppressors in breast cancer as prognostic markers.
Methods. Samples of tumor and surrounding histologically normal tissues from 69 patients with breast cancer were collected and clinically characterized. The level of mRNA was determined by semiquantitative RT-PCR. DNA methylation analysis was performed using two methyl-sensitive restriction endonucleases Hpall and Hhal with following PCR.
Results. For the first time there was studied and shown the dual role of methylation of GPX1, NKIRAS1, RHOA, DAG1 and USP4 with a prevalence of cases with increased expression, that is characteristic feature of oncogenes. There was established the significant correlation (p<10-17 according to Spearman's criteria ) between the alteration of mRNA level and structural modifications (methylation/demethylation and deletions / amplifications) for GPX1, NKIRAS1 and RHOA, and preliminary for DAG1 and USP4. The methylation contribution in the deregulation of expression was detected in NKIRAS1 in 69% (18/26), DAG1 - 67% (4/6), USP4 - 83% (5/6), GPX1 - 34% (11/32), RHOA — 16% (5/32) of breast cancer cases. Oncogenic properties are most pronounced in NKIRAS1, RHOA and DAG1, which have the increased mRNA level associated with demethylation or amplification.
Conclusion. Firstly the methylation status was shown to be potent to affect on the level of GPX1, NKIRAS1, RHOA, DAG1 and USP4 expression in primary tumors of breast cancer. The features of NKIRAS1, RHOA and DAG1 (mRNA increased level, demethylation or amplification) can be used for the development of new approaches to the prediction of breast cancer.
Key words: regulation of gene expression, methylation/demethylation, breast cancer
ВВЕДЕНИЕ
Рак молочной железы (РМЖ) относится к наиболее распространенным опухолям (11,1%) в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями в России, занимая 3-е место после рака кожи (14%) и толстой кишки (11,4%) [1]. Например, в 2010 г. в России выявлено 57 тыс. новых случаев РМЖ [1].
Короткое плечо хромосомы 3 (3p) содержит районы, подверженные делециям, например, район в области 3p21.31, получивший название LUCA (lung cancer), в котором идентифицирован кластер 20 опухоль-ассоциированных генов, в том числе гены-супрессоры роста опухоли, например, RASSF1A и SEMA3B [2]. В результате картирования на 3p ал-лельных дисбалансов (АД) с использованием >25 полиморфных маркеров был идентифицирован другой критичный район, в котором с высокой частотой детектированы аллельные делеции и амплификации [3]. Анализ показал, что в этом районе действительно
содержатся гены со свойствами онкогенов (например, RHOA и MST1R/RON), и амплификация может служить одним из механизмов их активации [4, 5]. В данной работе исследованы экспрессия и метилирование при РМЖ 5 генов, функционально важных в патогенезе эпителиальных опухолей, 4 генов этого района, включая RHOA, GPX1, DAG1 и USP4, а также гена NKIRAS1 (3p24.2). Локализация этих генов на 3p показана на рис. 1.
Ген RHOA (Ras Homolog Gene Family, member A) участвует в процессах формирования актинового ци-тоскелета, играет важную роль в адгезии и подвижности клеток. Ген RHOA может экзогенно вызывать трансформацию клеток in vitro и in vivo, предполагается его участие в инвазии и метастазировании опухолей [4]. С другой стороны, точечных мутаций, приводящих к активации этого потенциального онкогена, выявить не удалось, и возможные пути регуляции транскрипции RHOA не изучены.
Рис. 1. Расположение 5 исследованных генов на 3р. Представлены экзон-интронная организация, направление транскрипции и положение CpG-островков (база данных NCBI, Release 106)
Ген DAG1 (dystrophin-associated glycoprotein 1) кодирует белок адгезии, дистрогликан, который состоит из 2 субъединиц — внеклеточной и трансмембранной, и осуществляет взаимодействие цитоскелета с внеклеточным матриксом. Имеются данные о связи дистрогликана с адгезией клеток, инвазией и мета-стазированием опухолей [6].
Ген GPX1 (glutathione peroxidase 1) — наиболее распространенный член семейства глутатионперокси-даз. Как антиоксидантный селенопротеин он играет центральную роль в защите клеток от окислительного стресса и разрушения [7].
Ген USP4 кодирует убиквитинспецифическую протеазу 4-го типа, которая, отщепляя убиквитин, может на время останавливать процесс протеолити-ческой деградации регуляторных белков, включая циклины, p27, р53 и pRb, транскрипционные факторы E2F, NF-kB, онкогены c-myc, c-jun, c-fos, а также Ser/Thr-киназа c-mos [8]. Показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях легкого, а также онко-генная трансформация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена [9].
Ген NKIRAS1 (NFKB inhibitor interacting Ras-like 1) — гомолог онкогена Ras, взаимодействующий с фактором некроза NF-kB. Белковый продукт гена функционирует как G-белки, проявляющие ОТРазную активность. NKIRAS1 участвует в регуляции деградации IkB и в комплексе с IkB подавляет активность NF-kB [10]. Ген NKIRAS1 идентифицирован с помощью гибридизации Not 1-микропанелей при поиске генов, подверженных метилированию/деле-циям/амплификациям как наиболее частая мишень структурных изменений такого типа в эпителиальных опухолях разных локализаций [11].
Важную роль в поддержании уровня и специфичности экспрессии белоккодирующих генов человека играют эпигенетические механизмы (метилирование ДНК, модификация гистонов, ремоделирование хроматина) [12]. Нарушение этих механизмов может привести к изменению функций генов и злокачественной трансформации клеток и считается одной из основных причин возникновения рака. Повышенную и пониженную экспрессию и метилирование или потерю метилирования в опухолях рассматривают как первичные критерии онкогенной или онкосупрессорной функции гена. Ранее в литературе не было сообщений об изучении механизма регуляция экспрессии генов 3p GPX1, NKIRAS1, RHOA, DAG1 и USP4 на геномном уровне, в частности посредством метилирования, на основе исследования опухолей человека.
Нами проведен экспериментальный анализ изменений уровня мРНК и статуса метилирования 5 функционально важных генов хромосомы 3р в образцах первичных опухолей больных РМЖ. На основании полученных данных охарактеризованы роль этих генов при РМЖ и степень влияния структурных изменений, в частности метилирования, на изменение транскрипционной активности.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Образцы опухолей и гистологически неизмененной ткани молочной железы (МЖ) собраны и клинически охарактеризованы от 69 больных, находившихся на обследовании и лечении в РОНЦ РАМН. В исследование включены больные РМЖ, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [13, 14]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3—5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы тканей хранили при -70°С.
Высокомолекулярную ДНК выделяли из образцов опухоли и неизмененной ткани МЖ по стандартной методике, включающей обработку клеток протеина-зой К при 37°С в течение ночи, последующую экстракцию смесью фенола и хлороформа и осаждение этанолом. ДНК хранили при -20°С. Качество и концентрацию ДНК проверяли с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле с использованием ДНК фага-Х (Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США) в качестве эталона сравнения.
Суммарную РНК выделяли из опухоли и гистологически неизмененной ткани с помощью экстракции смесью гуанидинизотиоцианат-фенол-хлороформ [15]. Образцы РНК перед применением в исследованиях проходили обработку ДНКазой, свободной от РНКазы [15]. Водный раствор РНК хранили при температуре -40°С.
кДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием обратной транскриптазы вируса лейкоза мышей Молони (M-MuLV Reverse Transcriptase, Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США) и вырожденных гептамеров (random heptamers) в качестве праймеров по протоколу, предлагаемому фирмой.
Содержание мРНК определяли методом полуколичественной обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Праймеры и условия ОТ-ПЦР приведены в таблице. ОТ-ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,01% твин-20, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 0,2 мкМ каждого праймера, 2 мкл кДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной Taq ДНК полимеразы (Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию амплификации проводили по программе: 95°С, 5 мин; 35 циклов {94°С, 15 с, Тотж. (см. таблицу) 25 с, 72°С, 45с}, 72°С, 2 мин на амплификаторe DNA Engine Dyad Cycler (Bio-Rad, США). Продукты амплификации анализировали в 2% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромида этидия. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью системы гель-документирования Gel Imager-2 («Хеликон», Россия) и данные анализировали с помощью программы Gel-
Analysis. Учитывали случаи с изменением содержания мРНК в образцах опухолей по сравнению с образцами неизмененной ткани в 5 раз и более.
Анализ аллельных дисбалансов (АД) полиморфных маркеров D3S2409 и D3S3598 (см. рис. 1) в ДНК опухолей. Праймеры и условия ПЦР взяты из базы данных GenBank Amplicon. Буфер содержал: 60 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 25 мМ KCl, 0,1% Тритон Х-100. ПЦР и разделение продуктов на полиакриламидном геле проводили, как описано ранее [2], на приборе DNA Engine Dyad Cycler. Гель фотографировали в проходящем УФ-свете с помощью системы гель-документирования Gel Imager-2 и анализировали с помощью програм-
мы Gel-Analysis. Потерю аллеля учитывали, если интенсивность одной из полосок уменьшалась более чем на 50%. Амплификацию аллеля учитывали, если интенсивность одной или обеих полосок увеличивалась в 5 раз или более.
Анализ метилирования промоторных районов генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1 и NKIRAS1 проводили с применением МЧРА. Использовали 2 метилчувстви-тельные рестриктазы HpaII (CCGG) и HhaI (GCGC) (Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США) в условиях, приведенных в протоколах фирмы. Геномную ДНК (0,5 мкг) обрабатывали 5 ед. рестриктазы в 25 мкл инкубационной смеси в течение 1 ночи. В последующей амплификации использовали 2,5 мкл
ПРАИМЕРЫ и условия проведения исследовании ад,
МЕТИЛЧУВСТВИТЕЛЬНОГО РЕСТРИКТАЗНОГО АНАЛИЗА И ОТ-ПЦР
Исследование Маркер Праймеры Т / Mg, мM отж' Продукт ПЦР, п.н.
АД n3S?df)Q GGTGACAGAGACTCTTGTCTCA 58°c/1 0 115 197 D3S240Q CATTCTGGTTGGGGAACATA 5Öc/I,U 115-197
D3S35Q8 TCCACCCAGTAGTGAGCAT CGAACTCCTGAACTTGTGA 58°C/9,0 173-179
МЧРА TGCCCTCTGGACTGGAACCT 64°C/1 5 K1 CCTGAGCCCAGCCCAAGTC 64C/1,5 445
K2 AGAGTTTGATGGAGTTGGGT CATTCGGTTTGGGTCAATCC 69°C/1,5 999
rpyl GGGAAGCCGAGCACCACCAG 64°C/9 0 438 1 GCTCGGGCGCACTCTCCAG 64 C/9,0 438
RHOA GAGCCCGTCCACGCCCTAAAAGCAAAAC CGCCTCCCACTCCCGCAAGAACTCG 64,9°C/1,5 416
TSP4 GCCGCTGTCTTTTCTCCCCTCCGCTCTC 65 9°C/1 5 598 TTCCCCTGTTGCTATCGCCCCTCTGTGG 65,9 C/1,5 598
NKIRAS1 CGCCCGCAATCCACCCACTCC CGCCGCGGCCGCTATTGTCC 67,0°C/9,0 593
mrl 1 GGGGGCGAGGCTTCCATAAT 64°C/9 0 994 1 pr1 GGAGCCTAGCAACCGCCTGACAC 64C/9,0 994 597*
DAG1 pr2 CCGCCGGCGCTGGGTGAGT CAGCGAGCAGCAGCAGGTGTTCC 64°C/9,0 119
ОТ-ПЦР mrj CAGTGCTCTCAGACCTCCACGA 59°C/9 5 307 DAr1 CGATGGAGAACACACTGGAGGT 59C/9,5 307
GPX1 AAGGTACTACTTATCGAGAATGTG GTCAGGCTCGATGTCAATGGTCTG 55°C/9,5 461
RHOa CTGGTGATTGTTGGTGATGG 58°C/95 183 RHOA GCGATCATAATCTTCCTGCC 58 C/9,5 183
NKIRAS1 ATTTGCTGATGGCTTCGTTCTTGT ACTTTCTCACTTTTTGCCCACTGC 54°C/9,5 901
TSP4 TTTTTGTGGCCTGTTGATGC 64°C/9 5 387 GGGGAAGATGAGCCAGGAAATG 64C/9,5 387
B2M TGACTTTGTCACAGCCCAAGATAG CAAATGCGGCATCTTCAAACCTC 64°C/9,5 80
Примечание. Праймеры для метилчувствительного рестриктазного анализа (МЧРА) и ОТ-ПЦР генов DAG1, NKIRAS1 и USP4 подобраны с помощью программы Primer Select из пакета программ Lasergene7. Праймеры для ОТ-ПЦР генов RHOA, B2Mи GPX1 взяты из литературы [4, 16, 17]. *Продукт МЧРА гена DAG1 длиной 527 п.н. получали при использовании обеих пар праймеров одновременно. Синтез олигонуклеотидных праймеров выполнен в «Евроген» (Россия).
реакционной смеси, содержащей продукт гидролиза. Полноту гидролиза оценивали, используя ПЦР-фрагмент промоторной области гена ß-ЗА-адаптина (К1, 445 п.н., см. таблицу, ID Gen-Bank AF247736.2), который содержит участки узнавания используемых рестриктаз с неметилированными CpG-динуклеотидами (как в неизмененной ткани МЖ, так и в опухоли). Сохранность ДНК до и после гидролиза оценивали с использованием фрагмента экзона 3 гена RARB2, не содержащего участков узнавания указанных рестриктаз, в качестве контроля (К2, 229 п.н., см. таблицу). Праймеры и условия ПЦР приведены в таблице. Буфер содержал: 60 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 25 мМ KCl, 0,1% Тритон Х-100. Амплификацию фрагментов исследованных локусов проводили по программе: 95°С, 2 мин; 35 циклов {92°С, 10 с, Тотж (см. таблицу), 25 с, 72°С, 25с}, 72°С, 3 мин. Для амплификации использовали рекомбинантную термостабильную Taq-ДНК поли-меразу (Fermentas — Thermo Fisher Scientific, США), dATP, dCTP, dGTP, dTTP («СибЭнзим», Россия). ПЦР проводили на приборе DNA Engine Dyad Cycler. Продукты ПЦР исследуемых и контрольных фрагментов генов разделяли одновременно путем электрофореза в 10% полиакриламидном геле.
Статистический анализ данных проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0,05. Конкордантность данных по метилированию и экспрессии генов оценивали с помощью непараметрической ранговой корреляции Спирмена. Значимость корреляции по Спирмену (Rs) проверяли с помощью t-теста Стьюдента: с числом степеней свободы v=N—2, где N — размер выборки. Уровень значимости принят равным 10-6.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение уровня мРНК генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1 и NKIRAS1 при РМЖ
Данные по изменению уровня мРНК у генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1 и NKIRAS1 в исследованных парных образцах РМЖ показаны на рис. 2 и 3. Частое изменение экспрессии в опухолях (в 5 или более раз) выявлено у генов RHOA (32/58; 55,2%), GPX1 (32/58; 55,2%) и NKIRAS1 (26/40; 75%). Причем у этих генов преобладало повышение экспрессии: у GPX1 — в 2 раза (20/58 против 12/58), у RHOA — в 3 раза (24/58 против 8/58), при этом у гена RHOA различие статистически значимо (p<0,002 по Фишеру). У гена NKIRAS1 также существенно преобладали случаи с повышением уровня мРНК (16/40 против 10/40). У обоих генов USP4 и DAG1 изменение экспрессии выявлено в 6/18 (33,3%) случаев, причем в случае USP4 повышение и понижение наблюдали с равной частотой (3/18 против 3/18), а у DAG1 повышение экспрессии доминировало (5/18 против 1/18). Таким образом, по частоте случаев с повышением уровня мРНК гены RHOA, GPX1, DAG1 и NKIRAS1 можно отнести к проопухолевым, а именно — онкогенам и - генам прогрессии опухоли.
Изменение метилирования генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1 и N^^1 при РМЖ
Следует отметить, что CpG-островки генов ЯНОЛ, иБР4, БЛ01 и ЫК1ЯЛ31 перекрывают 5'-область гена, включая старт транскрипции и участок промоторной области (см. рис. 1). У гена ОРХ1 CpG-островок охватывает промоторную область и весь ген.
Статус метилирования CpG-островков 5 указанных генов изучен в 69 парных образцах опухоль/ неизмененная ткань у больных РМЖ (см. рис. 2, 3). Метилирование детектировано незначительно чаще в опухоли, чем в неизмененной ткани, у генов ЯНОЛ (9/69; 13% против 6/69; 9%), ВЛ01 (17/69; 25% против 11/69; 16%) и значимо более часто у гена ОРХ1 (19/69; 28% против 4/69; 6%; р=0,001 по Фишеру). Метилирование наблюдали в гистологически неизмененной ткани МЖ чаще, чем в опухоли, у генов иБР4 (9/69; 13% против 12/69; 17%) и ЫК1ЯЛБ1 (13/69; 19% против 20/69; 29%). Эти данные указывают на двоякую роль метилирования этих генов у больных РМЖ в зависимости от конкретной опухоли и других факторов, возможно, вовлеченных в развитие этого новообразования. Преобладание деметилирования у гена ЫК1ЯЛ31 в опухолях МЖ согласуется с данными о повышенной экспрессии этого гена в РМЖ и подтверждает предположение о его возможной проонкогенной функции.
Связь между изменениями уровня экспрессии и статуса метилирования 5 изученных генов при РМЖ
Изменение статуса метилирования CpG-островка гена ЯНОЛ выявлено в 7 из 32 образцов опухолей с увеличенным/уменьшенным (в 5 раз или более) уровнем мРНК (см. рис. 2): в 4 образцах метилирование обнаружено только в опухоли, в 2 — выявлены метилирование в неизмененной ткани и его потеря в опухоли, в 1-м — метилирование обнаружено в опухоли и неизмененной ткани (см. рис. 2). Из 8 образцов РМЖ с пониженной экспрессией ЯНОЛ метилирование обнаружено в 3 (38%). Снижение экспрессии ЯНОЛ в образце опухоли №919, по-видимому, связано с делецией аллеля (по данным для маркера D3S2409, см. рис. 1). Из 24 образцов РМЖ с повышенной экспрессией ЯНОЛ только 2 случая ассоциированы с де-метилированием, а 8 — с амплификацией локуса (по данным для маркера D3S2409). Установлена статистически значимая корреляция между аномальным уровнем экспрессии и структурными нарушениями — метилированием/деметилированием и делецией/ амплификацией (Ял=0,8644; 1=12,9636; р=2,33^10-18; п=58; по Спирмену). Изменение количества мРНК гена ЯНОЛ связано с изменением статуса метилирования в 16% (5/32) образцов РМЖ.
Изменение статуса метилирования CpG-островка у гена ОРХ1 выявлено в 15 из 58 исследованных опухолей. Снижение экспрессии ОРХ1 обнаружено в 12 из 32 образцов опухолей с аномальным уровнем мРНК: в 11 опухолях оно связано с метилированием и в 1 — с делецией (согласно данным для маркера D3S2409, образец № 919, см. рис. 2). В 20 из 58 опухолей МЖ наблюдали повышение экспрессии ОРХ1 при отсут-
ствии деметилирования. В 4 из 20 опухолей повышенная экспрессия ОРХ1, вероятно, связана с амплификацией гена (согласно данным для маркера D3S2409). Установлена статистически значимая корреляция между изменением уровня экспрессии и структурными нарушениями — метилированием/деметили-рованием и делецией/амплификацией (Яя=0,9239; 1=18,0688; р=4,96*10-25; п=58; по Спирмену). Вклад метилирования в подавление экспрессии гена GPX1 может достигать 92% (11/12), а с учетом всех наблюдений изменения уровня экспрессии (и понижения, и повышения) вклад метилирования в дерегуляцию этого гена при РМЖ составил 34% (11/32).
Необходимо отметить частичную согласованность в инактивации генов ЯНОЛ и 0РХ1, близко расположенных и однонаправленных (транскрипци-онно, см. рис. 1). При этом корреляция между событиями инактивации этих генов, рассчитанная по Спир-мену, оказалась статистически значимой (Яя=0,9185; 1=17,3863;р=3,11*10-24; п=58). Так, в 5 из 8 опухолей с пониженной экспрессией гена ЯНОЛ наблюдали также падение экспрессии гена 0РХ1. Причем в 3 из 5 образцов РМЖ (№733, 818, 890, см. рис. 2) обнаружено метилирование CpG-островков в обоих генах и в 1 опухоли (№919, см. рис. 2) — отмечена делеция (по-видимому, перекрывающая оба гена). Аналогич-
Рис. 2. Изменение уровня мРНК 4 генов в опухоли (T) по сравнению с неизмененной тканью МЖ(N), статус метилирования в образцах РМЖ (T/N), данные по АД для маркера М1 (D3S2409, см. рис. 1). Черные квадратики — метилирование выявлено, белые — не выявлено; А — амплификация, Д — делеция, кружок — сохранение гетерозиготности
но деметилирование ЯНОЛ и амплификация локуса были ассоциированы с повышением экспрессии обоих этих генов в 4 опухолях МЖ (№698, 732, 872, 873, см. рис. 2). Метилирование СрО-островка вышестоящего гена ЯНОЛ (см. рис. 1), возможно, наводит метилирование на СрО-островок гена 0РХ1.
Повышенный уровень мРНК гена БЛ01 наблюдали в 5 образцах РМЖ: в 3 опухолях обнаружено деметилирование, а в 2 — амплификация (по данным для маркера D3S2409, см. рис. 2). Единственный случай выраженного снижения экспрессии гена БЛ01 был ассоциирован с его метилированием в опухоли (№733, рис. 2). Во всех 6 образцах опухолей МЖ с аномальным уровнем мРНК гена БЛ01 показано соответствие выявленным структурным нарушениям. Дерегуляция гена БЛ01, согласно полученным данным, может быть связана с метилированием и амплификацией в преобладающем числе опухолей (на малой выборке — 4/6, 67%).
У гена иБР4 повышение и понижение экспрессии в образцах РМЖ наблюдали с равной частотой (3/18 против 3/18), однако существенное преобладание опухолей с потерей метилирования (6/18 против 2/18; см. рис. 2) позволяет предполагать проопухоле-вые свойства и для этого гена. В 3 образцах опухолей повышенная экспрессия гена иБР4 (в 15, 50 и 100 раз) ассоциирована с его деметилированием. В 2 из 3 образцов снижение экспрессии ассоциировано с метилированием. Дерегуляция гена иБР4 в РМЖ может быть связана с изменением статуса метилирования в 83% (5/6) наблюдений. Однако данные, полученные для генов БЛ01 и иБР4, следует считать предвари -
тельными, поскольку анализ экспрессии этих генов выполнен на малой выборке образцов (18 пар опухоль/неизмененная ткань).
Изменение статуса метилирования СрО-островка гена ЫК1ЯЛ31 выявлено с высокой частотой — в 26 из 40 (60%) образцов РМЖ, исследованных в отношении и экспрессии, и метилирования этого гена, или в 22 из 26 (88%) опухолей с аномальным уровнем мРНК (см. рис. 3). Повышение экспрессии гена ЫК1ЯЛ31 ассоциировано с деметилированием в 10/16 (62%) опухолей, а понижение экспрессии ассоциировано с метилированием гена в 8/10 (80%) опухолей. Тотально дерегуляция гена ЫК1ЯЛ31 в РМЖ может быть связана с изменением статуса метилирования в 69% (18/26) наблюдений. Следует отметить, что, кроме метилирования, на изменение уровня мРНК гена ЫК1ЯЛ31 в случаях №765 и №887 могут влиять амплификация и делеция локуса (по данным маркера D3S3598) (см. рис. 3). Корреляция между изменением уровня мРНК и структурными нарушениями (ме-тилированием/деметилированием и делециями/ам-плификациями) для этого гена составила (№=0,9400; ¡=16,9856;р=2,44*10-19; п=40, по Спирмену).
Полученные результаты о повышенном уровне мРНК генов ЯНОЛ и БЛ01 согласуются с данными SAGE-анализа (http://cgap.nci.nih.gov/SAOE/ SAOEInformation) и литературы [4, 18]. Методом SAGE-анализа детектировано повышение мРНК БЛ01 и ЯНОЛ в опухолях 7 локализаций, включая РМЖ. Выраженные онкогенные свойства ЯНОЛ также согласуются с исследованиями других авторов [4,
^ПИИИИИаИИИИИЗИИЕИЗПВЕаИаЕИИЕИЕИСоИИИИИСЮП
Рис. 3. Изменение количества мРНК гена NKIRAS1 в опухоли (T) по сравнению с неизмененной тканью МЖ (N), статус метилирования в образцах РМЖ (T/N) и данные по АД для маркера М2 (D3S3598, см. рис. 1). Обозначения те же, что на рис. 2
18]. Результаты, показывающие частое деметилиро-вание гена иБР4 в РМЖ, согласуются с данными литературы о повышенной экспрессии и потенциально онкогенной функции иБР4 в нескольких видах рака [19]. Значение метилирования в регуляции 0РХ1 при РМЖ согласуются с недавно опубликованными исследованиями других авторов, выполненными на клеточных линиях РМЖ и образцах опухолей у больных раком желудка [20, 21]. Сведения о роли гена ЫК1ЯЛ31 в развитии РМЖ и других новообразований ранее не сообщались. Публикации, посвященные исследованию метилирования генов ЫК1ЯЛ31, ЯНОЛ, БЛ01, ОРХ1 и ШР4 в опухолях больных РМЖ, другими научными группами не представлены.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нам удалось установить статистически значимую корреляцию (p<10-17, по Спирмену) между изменением уровня мРНК и структурными нарушениями (метилированием/деметилированием и делециями/амплификациями) для генов ОРХ1, ЫК1ЯЛБ1 и ЯНОЛ и предварительно - для БЛ01 и №Р4 в образцах первичных опухолей больных РМЖ. Часто-
та выявления опухолей МЖ с влиянием именно мети-лирования/деметилирования на уровень экспрессии составила для гена МК1ЯЛБ1 - 69% (18/26), БЛ01 - 67% (4/6), ШР4 - 83% (5/6), ОРХ1 - 34% (11/32) и ЯНОЛ - 15,6% (5/32). Итак, нами впервые показано, что изменение статуса метилирования генов ОРХ1, ЫК1ЯЛ31, ЯНОЛ, БЛ01 и иБР4 может влиять на уровень их экспрессии в первичных опухолях МЖ. Для ЫК1ЯЛ31, ЯНОЛ и БЛ01 показаны наиболее выраженные онко-генные свойства в опухолях больных РМЖ: высокая частота встречаемости опухолей с повышенным уровнем мРНК, связанная с деметилированием ЫК1ЯЛ31, амплификацией ЯНОЛ, деметилированием и амплификацией БЛ01. Установленные закономерности важны для определения молекулярно-генетических событий, связанных с патогенезом РМЖ. Выявленные структурные и генетические особенности генов ЫК1ЯЛБ1, ЯНОЛ и БЛ01 в РМЖ могут быть использованы в практической онкологии при разработке новых
подходов в прогнозировании этих новообразований.
* * *
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, Проект РНФ№14-15-00654.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2010г. Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2012; 22 (3). (Прил. 1): 54-61.
[Davidov M.I., Axel E.M. Statistiks of malignant tumors in Russia and UIC in 2010. Vestnick N.N. Blokhin RCRC 2012; 22 (3). (Adit. 1): 54-61 (in Russian)]
2. Zabarovsky E., Senchenko V., Loginov V., Pavlova T., Zabarovska V., Dmitriev A., Lung M., Panda C.K., Kashuba V., Lerman M.I. and Braga E.A. Positional cloning of tumor suppressor genes from 3p21.3 involved
in major human cancers. In: Genetic Mapping. Ed. F. Columbus, Nova Science Publishers, Inc., NY. 2011; 42 (4): 1-32.
3. Braga E., Loginov W., Khodyrev D., Pronina I., Kazubskaya T., Bogatyrova O., Kashuba V.I., Senchenko V.N., Klein G., Lerman M.I., Kisselev L.L., Zabarovsky E.R. A novel MECA3 region in human 3p21.3 harboring putative tumor suppressor genes and oncogenes. Exp Oncol. 2011; 33 (1): 33-41.
4. Horiuchi A., Imai T., Wang C., Ohira S., Feng Y., Nikaido T., Konishi I. Up-regulation of small GTPases, RhoA and RhoC, is associated with tumor progression in ovarian carcinoma. Lab. Invest. 2003; 83: 861-70.
5. Angeloni D., Danilkovitch-Miagkova A., Ivanova T., Braga E., Zabarovsky E., Lerman M.I. Hypermethylation of Ron proximal promoter associates with lack of full-length Ron and transcription of oncogenic short-Ron from an internal promoter. Oncogene. 2007; 26: 4499-512.
6. Brennan P.A., Jing J., Ethunandan M., Gorecki D. Dystroglycan complex in cancer. Eur J Surg Oncol. 2004; 30: 589-92.
7. Hussain S.P., Amstad P., He P., Robles A., Lupold S., Kaneko I., Ichimiya M., Sengupta S., Mechanic L., Okamura S., Hofseth L.J., Moake M., Nagashima M., Forrester K.S.,
Harris C.C. p53-induced up-regulation of MnSOD and GPx but not catalase increases oxidative stress and apoptosis. Cancer Res. 2004; 64: 2350-6.
8. DeSalle L.M., Latres E., Lin D., Graner E., Montagnoli A., Baker R.T., Pagano M., Loda M. The de-ubiquitinating enzyme Unp interacts with the retinoblastoma protein. Oncogene. 2001; 20: 5538-42.
9. Gray D.A., Inazawa J., Gupta K., Wong A., Ueda R., Takahashi T. Elevated expression of Unph, a proto-oncogene at 3p21.3, in human lung tumors. Oncogene. 1995; 10: 2179-83.
10. Chen Y., Vallee S., Wu J., Vu D., Sondek J., Ghosh G. Inhibition of NF-kappaB activity by IkappaBbeta in association with kap-paB-Ras. Mol. Cell. Biol. 2004; 24: 3048-56.
11. Dmitriev A.A., Kashuba V.I., Haraldson K., Senchenko V.N., Pavlova T.V, Kudryavtseva
A.V., Anedchenko E.A., Krasnov G.S., Pronina I.V., Loginov VI., Kondratieva T.T., Kazubskaya T.P., Braga E.A., Yenamandra S.P., Ignatjev I., Ernberg I., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Genetic and epigenetic analysis of non-small cell lung cancer with NotI-microarrays. Epigenetics. 2012; 7 (5): 502-13.
12. Кушлинский Н.Е., Немцова М.В. Молекулярные механизмы опухолевого роста. Патогенез. 2014; 12 (1): 4-14. (Kushlinskii N.E., Nemtsova M.V. Molecular mechanisms of tumor growth. Pathogenesis. 2014; 12(1): 4-14 (in Russian)]
13. Sobin L.Y., Wittekind Ch. N.Y. UICC TNM classification of malignant tumours. Eds. Wiley-Liss INC Publ. 2002; 193-5.
14. Tavassoli FA., Devilee P. World Health Organization. International histological classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. Eds. Lyon: IARCPress. 2003.
15. Пронина И.В., Логинов В.И., Прасолов
B.С., Климов Е.А., Ходырев Д.С.,
Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Сулимова Г.Е., Брага Э.А. Изменение уровня экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях. Молекуляр. биология. 2009; 43: 439-445. [Pronina I.V., Loginov V.I., Prasolov V.S., Klimov E.A., Khodyrev D.S., Kazubskaia T.P., Gar'kavtseva R.F., Sulimova G.E., Braga E.A. Alteration of SEMA3B gene expression levels in epithelial tumors. Mol. Biol. (Mosk). 2009; 43; 403-409 (in Russian)]
16. Angeloni D., ter Elst A., Wei M.H., van der Veen A.Y., Braga E.A., Klimov E.A., Timmer T., Korobeinikova L., Lerman M.I., Buys C.H. Analysis of a new homozygous deletion in the tumor suppressor region at 3p12.3 reveals two novel intronic noncoding RNA genes. Genes Chromosomes Cancer. 2006; 45: 676-91.
17. Li S., Yan T., Yang J.-Q., Oberley T.D. Oberley L.W. The role of cellular glutathione peroxidase redox regulation in the suppression of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase. Cancer Res. 2000; 60: 3927-39.
18. Ma L., Liu Y.P., Geng C.Z., Wang X.L., Wang Y.J., Zhang X.H. Overexpression of Rhoa is associated with progression in invasive breast duct carcinoma. Breast J. 2010; 16 (1): 105-7.
19. Zhang X., Berger F.G., Yang J., Lu X. USP4 inhibits p53 through deubiquitinating and stabilizing ARF-BP1. EMBO J. 2011; 30 (11): 2177-89.
20. Min S.Y., Kim H.S., Jung E.J., Jung E.J., Jee
C.D., Kim WH. Prognostic significance of glutathione peroxidase 1 (GPX1) downregu-lation and correlation with aberrant promoter methylation in human gastric cancer. Anticancer Res. 2012; 32 (8): 3169-75.
21. Kulak M.V, Cyr A.R., Woodfield G.W., Bogachek M., Spanheimer P.M., Li T., Price
D.H., Domann F.E., Weigel R.J. Transcriptional regulation of the GPX1 gene by TFAP2C and aberrant CpG methylation in human breast cancer. Oncogene. 2013; 32 (34): 4043-51.
Поступила 25 апреля 2014 г.
