CC BY
48
Роль каталазы и супероксиддисмутазы микроорганизмов при их фагоцитозе макрофагальными клетками
А. И. Курбанов, 3. О. Караев
Азербайджанский Медицинский Университет, г. Баку
Известно, что основной механизм обезвреживания поглощенных микроорганизмов фагоцитами осуществляется кислородозависимыми механизмами. При этом фагоциты подвергают поглощенные микроорганизмы киллингу свободными кислородными радикалами, такими, как супероксидный ион - О2-, гидроксильный радикал -ОН-, синглетный кислород - О2, оксид азота - NO и др., которые, в свою очередь, могут нейтрализоваться антиоксидантной системой микроорганизмов (АСМ), в частности, каталазой и супе-роксиддисмутазой (СОД). Таким образом микроорганизмы приобретают резистентность и адаптацию к свойственному для фагоцитарных клеток окислительному стрессу, вследствие чего могут выживать внутри фагоцитов, а нередко и в очаге воспаления [3, 6, 9]. Вероятно поэтому му-тантные по антиоксидантным ферментам штаммы Shigella flexneri (5), Salmonella typhimurium (4), Streptococcus agalactiae (11), Cryptococcus neoformans (10), Candida albicans (7) более чувствительны к киллингу фагоцитами, чем дикие штаммы этих микроорганизмов. Однако, данные о значении антиоксидантных ферментов у естественных популяций микроорганизмов в фагоцитозе отсутствуют. Целью настоящего исследования являлось изучение роли каталазы и СОД естественных популяций микроорганизмов -Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans в фагоцитозе перитонеальными макрофагами белых мышей in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали односу-точные культуры лабораторных штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, выращенных на соответствующих питательных средах. Внутриклеточные антиоксидантные ферменты микроорганизмов определяли спектрофотометрическим методом после соответствующей дезинтеграции их клеток на ультразвуковом дезинтеграторе. Единицей каталазы считали количество фермента, которое разлагает 1 мкмоль Н2О2 в мин. (8), а единицей СОД - количество фермента, которое ингибирует восстановление нитросинего тетразолия на 50% в мин. (2). Фагоцитоз микроорганизмов перитонеальными макрофагами белых мышей изучали in vitro 1 в нашей модификации. В экспериментах использовано 40 неинбредных мышей массой 20-25 г в возрасте 2-3 мес. Животных заби-
вали декапитацией под эфирным наркозом, шкуру смачивали этанолом, проводили надрез кожи в кранио-каудальном направлении, без повреждения перитона. В перитонеальную полость вводили 2-3 мл раствора Хенкса, после чего массировали живот пальцами в течение минуты. Перитонеальную жидкость брали шприцем, центрифугировали, полученные таким образом макрофаги ресуспензиро-вали в растворе Хенкса и подсчитывали в камере Горяева. В эту же суспензию макрофагов добавляли трижды отмытые и заранее опсонизированные микробные клетки в фосфатно-солевом буфере. Рабочая камера для фагоцитоза содержала пери-тонеальные макрофаги и клетки соответствующих микроорганизмов в соотношении 1:10. Спустя 60 и 120 мин. после взаимодействия макрофагов с микроорганизмами определяли фагоцитарную активность и фагоцитарный показатель. Киллинг микроорганизмов определяли спустя 120 мин. путем количественного высева на соответствующие плотные питательные среды. Микробоцидная активность макрофагов при этом оценивалась по степени снижения колониеобразующих клеток (КОЕ) по сравнению с контролем в процентах.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятой методике с определением Р критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Изученные штаммы микроорганизмов отличались по содержанию внутриклеточных антиоксидантных ферментов. У различных штаммов каждого микроорганизма количество и каталазы, и СОД варьировало в широком диапазоне. После определения содержания каталазы и СОД нами выбраны
Таблица. Штаммы микроорганизмов с максимальным и минимальным содержанием каталазы и супероксиддисмутазы
Содержание
Штамм № ферментов (ед/мг)
Каталаза СОД
S. aureus 3 (мин.) 63,8 10,6
S. aureus 5 (макс.) 166,7 27,8
E.coli 5 (мин.) 5,2 5,9
E.coli 2 (макс.) 14,3 11,4
Р. aeruginosa 9 (мин.) 67,3 9,6
Р. aeruginosa 2 (макс.) 241,5 28,8
С. albicans 1 (мин.) 18,5 198,4
С. albicans 4 (макс.) 43,5 384,2
S.aureus E.coli P.aeruginosa C.albicans
Рис. Киллинг различных штаммов микроорганизмов, отличающихся по содержанию антиоксидантных ферментов макрофагами
По оси ординат - процент снижения количества микробных клеток после взаимодействия c макрофагами
штаммы с максимальным и минимальным содержанием этих ферментов для дальнейшего исследования (Таблица).
Далее нами исследован фагоцитоз этих штаммов микроорганизмов перитонеальными макрофагами мышей. Изучение фагоцитарной активности и фагоцитарного показателя макрофагов по отношению к различным штаммам микроорганизмов, отличающимся содержанием антиоксидантных ферментов, не выявило существенных различий этих показателей. Микробо-цидная же активность макрофагов по отношению к штаммам микроорганизмов с максимальным и минимальным содержанием ферментов была разной (Рис.). Так, установлено, что киллинг штамма S. aureus с более низким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 3) после взаимодействия с макрофагами составил 38± 4,4%, однако киллинг штамма этой же бактерии с более высоким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 5) составил 23,2±3,1% (р< 0,05). Киллинг штамма E.coli с более низким содержанием антиоксидантных ферментов (шт.5) после взаимодействия с макрофагами составил 34±2,3 %, а киллинг штамма этой же бактерии с более высоким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 2) составил 20±3% (р<0,05). Процент уничтожения штамма P.aeruginosa с более низким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 9) после взаимодействия с макрофагами составил 28,6±3,6% , в то время, как штамм этой же бактерии с более высоким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 2) уничтожен на 14,8±2,1% (р<0,05). Киллинг штамма C.albicans с более низким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 1) после взаимодействия с макрофагами составил 24,2±2,7%, в то время как у штамма с более высоким содержанием антиоксидантных ферментов (шт. 4) киллинг клеток гриба составил 14,9±2,3% (р<0,05).
Таким образом, штаммы, обладающие максимальным количеством внутриклеточных антиок-
сидантных ферментов, проявляют относительно высокую выживаемость внутри макрофагов, по сравнению со штаммами с минимальным содержанием этих ферментов. Механизм данного явления однозначно можно объяснить антифагоцитарной активностью каталазы и СОД, так как защищая микробные клетки от действия кислородных радикалов внутри фагосом, эти ферменты способствуют более длительному выживанию последних внутри фагоцитов. Таким образом, установлена определенная роль внутриклеточных каталаз и СОД микроорганизмов при фагоцитозе. По вышеуказанному механизму эти ферменты могут играть роль фактора патогенности микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иммунологические методы - под. ред. Г.Фримеля, пер. с нем., -М., Медицина, 1987; 2. Чевари Ф., Чаба И., Сегей И. Способ определения супероксиддисмутазы. - Лаб. дело, 1985, N.11, с.678-681; 3. Babior B.M. Phagocytes and oxidative stress. - Am J Med., 2000, v.109(1), p.33-44; 4. De Groote M.A., Ochsner U.A., Shiloh M.U. et.al. Periplasmic superoxide dismutase protects Salmonella from products of phagocyte NADPH-oxidase and nitric oxide synthase. - Proc Natl Acad Sci USA, 1997, v.94(25), p.13997-4001; 5. Franzon V.L, Arondel J., Sansonetti P.J. Contribution of superoxide dismutase and catalase activities to Shigella flexneri pathogenesis. -Infect Immun., 1990, v.58(2), p.529-535; 6. Fridovich I. Superoxide anion radical (O2-), superoxide dismutases, and related matters. - JBC Online, 1997, v.272(30), p.18515-18517; 7. Hwang C.-S., Rhie G., Oh J.-H., et al. Copper- and zinc-containing superoxide dismutase (Cu/ ZnSOD) is required for the protection of Candida albicans against oxidative stresses and the expression of its full virulence. -Microbiology, 2002, v.148(11), p.3705 - 3713; 8. Katalase. Biochemical information. - Germany, 1975, v.2, p.45-47; 9. Knight J.A. Review: Free radicals, antioxidants, and the immune system. - Ann Clin Lab Sci., 2000, v.30(2), p.145-58; 10. Narasipura S.D., Ault J.G., Behr M.J. et al. Characterization of Cu, Zn superoxide dismutases (SOD1) gene knock-out mutant of Cryptococcus neoformans var. gattii: role in biology and virulence. - Mol. Microbiol., 2003, v.47(6), p.1681-16944; 11. Poyart C., Pellegrini E., Gaillot O. et al. Contribution of Mn-cofactored superoxide dismutase (SodA) to the virulence of Streptococcus agalactiae. - Infect Immun., 2001, v.69(8), p.5098-5106.
SUMMARY
Role of catalase and superoxide dismitase of microorganisms in phagocytosis by macrophages A.Kurbanov, Z.Karaev
Oxygen mediated mechanisms in phagocytosis destroys microorganisms by free oxygen radicals. Antioxidant system of microorganisms including such ferments as catalase, peroxidases, superoxide dismitase (SOD) can protect microorganisms by neutralizing free radicals,, generated by phagocytes.
Presented study is denoted to studying role of catalase and superoxide dismitase some microorganisms - Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans in phagocytosis by mouse macrophages in vitro. In this study are represented that species containing greater amounts of antioxidant ferments render comparatively high viability inwardly phagocytes. Mechanisms of this phenomenon are discussed.
Поступила 17.09.2005
