CC BY
89
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 579.22
РОЛЬ ФАКТОРОВ ОБЩЕЙ СТРЕССОРНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В ФОРМИРОВАНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ESCHERICHIA COLI К ФТОРХИНОЛОНАМ
Л. Ю. Нестероваа, А. Г. Ткаченкоа,ь
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Селекционированы мутанты Escherichia coli с разной степенью устойчивости к фторхиноло-ну левофлоксацину. Показано, что в ряду поколений мутантов базовый уровень экспрессии гена rpoS, кодирующего один из основных регуляторов стрессорной устойчивости, возрастает прямо пропорционально степени резистентности. Это сопровождается возрастанием активности LdcC - фермента синтеза кадаверина, повышением способности мутантов к био-плёнкообразованию и снижением бактериального фитнеса. Установлено, что данные признаки являются наследственно закреплёнными и селективно значимыми при отборе антибиотикорезистентных форм.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность; Escherichia coli; мутантные штаммы; левофлоксацин;
стрессорная устойчивость; адаптация; экспрессия гена rpoS; лизиндекарбоксилаза LdcC.
Формирование резистентности бактерий к антибиотикам - неизбежное следствие массового применения антимикробных препаратов. В настоящее время фторхинолоны - одно из наиболее широко используемых средств в лечении бактериальных инфекций человека и животных. Этим обусловлено быстрое возрастание резистентности к данному классу антибиотиков. Наиболее высокий уровень устойчивости к хинолонам возникает в результате специфических мутаций в генах, кодирующих белки-мишени, ДНК-гиразу и топоизо-меразу IV. Помимо этих мутаций обнаружены и другие, менее специфичные, но также вносящие существенный вклад в антибиотикорезистент-ность. Это, как правило, мутации, влияющие на уровень экспрессии белков общей стрессорной устойчивости. Следствием таких мутаций могут быть конститутивная сверхэкспрессия гена marA, ответственного за неспецифический выброс ксенобиотиков из клетки, или soxS, главного регулятора ответа на окислительный стресс (Kern et al.,
2000). В последнее время все большее внимание привлекают к себе полиамины, низкомолекулярные клеточные катионы, обладающие многообразными антистрессорными функциями (Tkachenko et al., 2001; Ткаченко и др., 2003, 2004, 2006). Ранее нами показано, что одним из ответов E. coli на сублетальное действие фторхинолонов является возрастание активности ферментов синтеза полиаминов, которое приводит к накоплению этих со-
единений в клетке и играет роль фактора адаптации (Ахова, Ткаченко, 2009). Действие фторхино-лонов сопровождалось также характерным для данного класса антибиотиков возрастанием уровня экспрессии гена rpoS, продукт которого, как нами показано, играет существенную положительную роль в регуляции содержания полиаминов, в частности кадаверина, в клетке. На основании этих исследований было сделано предположение, что возникновение резистентных к фторхинолонам штаммов E. coli, может происходить в результате отбора мутаций, обусловливающих высокий уровень экспрессии генов-регуляторов и/или генов, кодирующих ферменты синтеза полиаминов. Проверке данного предположения посвящена настоящая работа.
Материалы и методы
Антибиотикочувствительность штаммов оценивали по значению минимальной ингибиторной концентрации (МИК), которую определяли методом двукратных серийных разведений (Методические указания..., 2004) с использованием иммунологических планшет.
Для получения мутантов первого поколения культуру исходного штамма Escherichia coli RO91 выращивали в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл LB-бульона, в термостатируемом шейкере (37°С, 100 об/мин) до плотности 1.0 (OD600), затем
© Л. Ю. Нестерова, А. Г. Ткаченко, 2010
осаждали 5 мин при 4500 g, отделяли от супернатанта и ресуспендировали в физиологическом растворе таким образом, чтобы концентрация полученной суспензии составляла 1010 КОЕ/мл. Иноку-лят в объёме 1 мл вносили в чашки Петри с LB-агаром, содержащим левофлоксацин в концентрации, превышающей МИК в 2-16 раз. Чашки инкубировали 48 ч при 37°С. (Kem et al., 2000), после чего отбирали по 3 колонии с каждой селективной концентрации антибиотика. Для получения мутантов второго и третьего поколения применяли аналогичный подход, используя в качестве родительского штамма мутанты первого и второго поколения, соответственно.
Уровень экспрессии rpoS определяли путём измерения ß-галактозидазной активности в клетках, несущих репортерное генное слияние rpoS::lacZ. Активность ß-галактозидазы оценивали методом Миллера (Miller, 1992).
Активность лизиндекарбоксилазы определяли по количеству образующегося конечного продукта кадаверина в единицу времени. Для этого бактериальную культуру центрифугировали в течение 6 мин при 3000 g и температуре 0°С, дважды отмывали физиологическим раствором. Ресуспендирован-ные клетки разрушали ультразвуком (22 кГц, 10 мА, 3 раза по 10 сек), обломки клеток осаждали центрифугированием (20 мин, 16000 g). Инкубационная смесь включала 100 мМ цитратно-фосфатного буфера (рН 7.5), 0.04 мМ пиридоксаль-фосфата, 1 мМ дитиотрейтола, 10 мМ L-лизина и супернатант, содержащий 100 мкг белка, в конечном объеме 0.5 мл. Реакцию запускали добавлением субстрата, смесь инкубировали в течение 60 мин при 37°С, после чего реакцию останавливали внесением хлорной кислоты до конечной 0.4 молярной концентрации.
Содержание кадаверина определяли методом ВЭЖХ его дансилированного производного. Хроматографическая система включала хроматограф Shimadzu LC-20A (Shimadzu, Япония); колонку Luna С18(2) размером 250*4.6 мм, 5 мкм (Pheno-menex, США), предколонку С18 Securityguard, 4*3 мм, 5 мкм (Phenomenex, США); флуоресцентный детектор RF-10A XL (Shimadzu, Япония). Длины волн экстинкции и эмиссии устанавливали на 400 и 516 нм, соответственно. В качестве мобильной фазы использовали смесь воды и ацетонитрила, которую подавали на колонку со скоростью 1 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 40 до 100% в течение 10 мин с последующим уравновешиванием в течение 10 мин 40% ацетонитрилом.
Определение количества белка проводили методом Лоури.
Способность к биоплёнкообразованию оценивали с помощью окрашивания биоплёнок генциан-виолетом. Для этого ночные культуры, выращенные в пробирках, содержащих 5 мл LB-бульона и 5 г/л глюкозы при 37°С, доводили в физиологиче-
ском растворе до одинаковой плотности 0.1 (OD625), после чего разводили в 25 раз LB-бульоном, содержащим 5 г/л глюкозы. 100 мкл полученного инокулята стерильно вносили в лунки 96-луночного полистиролового иммунологического планшета и культивировали в течение 22 ч при 37°С без перемешивания. Оптическую плотность культур (OD625) измеряли с помощью многофункционального микропланшетного ридера Infinite M200 (Tecan, Швейцария). Бульон с планктонными клетками удаляли, и лунки дважды отмывали 200 мкл дистиллированной воды. Планшеты подсушивали в течение 20 мин, после чего в каждую лунку добавляли по 150 мкл 0.1% генцианвиолета и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Краситель удаляли, и лунки 5-кратно промывали (добавление в лунки 200 мкл дистиллированной воды, встряхивание в течение 5 сек). С целью стандартизации обработки все процедуры по промыванию планшетов проводили автоматически, в микропланшетном ридере. Планшеты высушивали, краситель экстрагировали абсолютным этанолом, после чего измеряли оптическую плотность (OD570). Измерения проводили в 16-кратной повторности. Способность к биоплёнкообразова-нию подсчитывали с использованием уравнения: SBF = (A - B) / C, где SBF - удельное биоплёнко-образование (Specific biofilm formation); А - OD570 в опытной лунке; В - OD570 в контрольной лунке; C - OD625 культуры клеток (Naves et al., 2008).
Для определения бактериального фитнеса ночные культуры всех штаммов, выращенные в пробирках, содержащих 5 мл LB-бульона при 37°С, доводили до одинаковой плотности 0.1 (OD625), после чего разводили бульоном ещё в 4 раза и переносили в планшет. Планшеты культивировали в течение 20 ч при 37°С в микропланшетном ридере без перемешивания. Оптическую плотность культур измеряли каждые 30 мин. Перед каждым измерением планшеты встряхивали в течение 5 сек. Значение фитнеса подсчитывали как отношение времени, за которое каждый мутантный штамм 50-кратно увеличивал начальную плотность (OD600), к времени контрольного штамма (Petersen еt а1., 2009).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.,
2001). На рисунках приведены данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех), представленные в формате среднее ± среднее квадратичное отклонение. Оценка статистической значимости различий произведена с использованием критерия Ньюмена-Кейлса. Различия считали значимыми при р<0.05.
Результаты
Для отбора резистентных к левофлоксацину мутантов в качестве родительского штамма ис-
пользовали Е. соИ RO91, несущий репортерное генное слияние rpoS::lacZ, дающее возможность оценить уровень генной экспрессии rpoS. В лабораторных условиях селекционированы мутанты трёх последовательных поколений с разным уровнем устойчивости к левофлоксацину. Для дальнейшего изучения среди них были отобраны мутанты, обладающие Р-галактозидазной активностью, которые, таким образом, сохраняли исходную репортерную генетическую конструкцию и составляли подавляющую часть популяции устойчивых штаммов. Получено 9 линий мутантов, ведущих происхождение от разных клонов одного и того же родительского штамма.
Минимальные ингибиторные концентрации для левофлоксацина у этих штаммов возрастали пропорционально поколению мутантов в диапазоне 6-6000 МИК исходного штамма.
1000
® 600
(У)
I
В качестве первичного критерия для оценки селективной значимости продукта гена rpoS, с3 субъединицы РНК полимеразы, был использован базовый (в отсутствие антибиотика) уровень активности гена rpoS в клетках исходного и мутантных штаммов. Экспрессия гроантибиотикорези-стентных штаммов статистически значимо превышала уровень исходного штамма более чем у 80% полученных мутантов. За малым исключением данный показатель возрастал прямо пропорционально уровню устойчивости в ряду поколений родственных штаммов (рис. 1). У мутантов первого поколения экспрессия rpoS превышала уровень исходного штамма в среднем в 1.5-2 раза, в то время как в третьем поколении встречались штаммы, превосходящие исходный в 5 раз.
и
ИІІ
исх. 1п. 2п. 3п. исх. 1п. 2п. 3п. исх. 1п. 2п. 3п.
Рис. 1. Базовая экспрессия гена rpoS в клетках исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. - исходный Е. соїі RO91штамм; 1п. - мутант первого поколения; 2п. - мутант второго поколения; 3п. - мутант третьего поколения
Ранее нами показано, что физиологическая реакция клеток исходного штамма RO91 на субле-тальные воздействия левофлоксацина включала увеличение уровня экспрессии гена rpoS (Ахова, Ткаченко, 2009). Ответ культур мутантных штаммов, обладающих высоким базовым уровнем генной экспрессии, на добавку сублетальных для них концентраций левофлоксацина был сходен с реакцией исходного родительского штамма (рис. 2).
Однако уровень индукции rpoS у мутантов снижался по сравнению с родительским штаммом пропорционально возрастанию базовой экспрессии данного гена (в отсутствие антибиотика). У мутантов третьего поколения стимуляция отсутствовала или была минимальной, тогда как базовый уровень экспрессии rpoS сохранялся на высоком значении, характерном для мутантов данного поколения.
Рис. 2. Влияние сублетальных концентраций левофлоксацина на уровень индукции экспрессии гена rpoS в клетках исходного и мутантных штаммов в ответ на добавку антибиотика.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. - исходный штамм; 1п. - мутант первого поколения; 2п. -мутант второго поколения; 3п. - мутант третьего поколения
0
Известно, что RpoS является регулятором большого числа генов, которые принимают участие в адаптации к неблагоприятным условиям среды (Hengge-Aronis, 2002). В их числе особый интерес с точки зрения антистрессорных функций полиаминов представляет ШсС, который кодирует один из ферментов синтеза кадаверина. Кадаверин, как известно, принимает участие в регуляции проницаемости пориновых каналов, через которые
в клетку поступают фторхинолоны (Ахова, Ткаченко, 2009; Samartzidou е! а1., 1999). Проведенный нами анализ левофлоксацинустойчивых мутантов показал, что, несмотря на отсутствие строгой зависимости от уровня антибиотикоустойчивости, большая их часть обладала повышенным, по сравнению с исходным штаммом, уровнем активности фермента LdcC (рис. 3).
Рис. 3. Базовая активность лизиндекарбоксилазы LdcC в клетках исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. - исходный штамм; 1п. - мутант первого поколения; 2п. мутант второго поколения; 3п. - мутант третьего поколения
Известно, что в состав rpoS-регулона входит ген crl, кодирующий основной белковый компонент комплекса внеклеточного матрикса энтеробактерий, определяющий адгезивную способность клеток и способность к образованию биоплёнок (Barnhart, Chapman, 2006). В связи с этим представляла интерес оценка способности селекционированных нами
й
мутантных штаммов к формированию биоплёнок. Эксперименты показали, что способность к био-плёнкообразованию более чем у 90% мутантных штаммов превышала уровень исходного штамма. Как и базовая активность rpoS, способность к формированию биоплёнок возрастала в ряду поколений резистентных мутантов (рис. 4).
Ї
исх. п.1 п.2 п.3
исх. п.1 п.2 п.3
исх. п.1 п.2 п.3
Рис. 4. Способность к формированию биоплёнок клетками исходного и мутантных штаммов. Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. - исходный штамм; 1п. - мутант первого поколения; 2п. мутант второго поколения; 3п. - мутант третьего поколения
3,0
2,4
1,8
1,2
0,6
0,0
Одной из основных функций RpoS является регуляция перехода к стационарной фазе, что способствует активации генов, необходимых клетке в данной фазе развития культуры, и отрицательно регулирует экспрессию генов, ответственных за активный рост. В этой связи представляло интерес исследование зависимости фитнеса антибиотикорезистентных мутантов от уровня экспрессии rpoS. Значение бактериального фитнеса, которое отражает репродуктивные способности бактерий, является важным параметром, характеризующим способность антибиотикоустойчивых мутантов выжи-
вать в различных условиях среды, как в присутствии антибиотика, дающего им селективные преимущества, так и в его отсутствие. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что величина фитнеса обратно пропорциональна уровню экспрессии rpoS и антибиотикоустойчивости (рис. 5), то есть в отсутствие в среде антибиотика преимущество по данному параметру имеют антибио-ткочувствительные штаммы.
Обсуждение
Описанная нами прямо пропорциональная зависимость между базовым уровнем экспрессии rpoS (в отсутствие антибиотика) и величиной ле-вофлоксацинрезистентности мутантов Е. соН (см. рис. 1) свидетельствует о том, что продукт данного
гена имеет селективное значение и признак его высокой продукции закрепляется генетически в процессе отбора. Эти данные хорошо согласуются с описанной нами ранее физиологической защитной реакцией на действие сублетальных концен-
N
її §
N S'
її § s
N s'
s § s
N s'
s § s
N s'
s § s
N s'
s § s
исх. 1п. 2п. Зп.
исх. 1п. 2п. Зп.
исх. 1п. 2п. Зп.
Рис. 5. Бактериальный фитнес культур исходного и мутантных штаммов.
Представлены 3 типичные линии мутантов: исх. - исходный штамм; 1п. - мутант первого поколения; 2п. мутант второго поколения; 3п. - мутант третьего поколения
1.2
1.0
0.8
0.4
0.0
траций антибиотика, которая сопровождалась индукцией rpoS, а также высоким накоплением в клетках полиаминов, в том числе кадаверина, как продукта RpoS-зависимой лизиндекарбоксилазы LdcC (Ахова, Ткаченко, 2009). Возрастание базовой экспрессии rpoS в ряду поколений антибиотикорезистентных мутантов сопровождалось снижением степени ее индуктивности (см. рис. 2), что свидетельствует о конститутивном закреплении данного признака и его высокой значимости для выживания клеток в присутствии антибиотиков.
Высокое содержание с3 в клетках мутантных штаммов, вероятно, является одной из причин повышенной активности RpoS-зависимой изоформы фермента синтеза кадаверина LdcC (см. рис. 3). Одной их функций кадаверина в клетках Е. соН является регуляция проницаемости пориновых каналов, локализованных во внешней мембране, через которые осуществляется транспорт относительно низкомолекулярных гидрофильных соединений, к числу которых относится большинство антибиотиков фе1соиг е! а1., 2003). Благодаря наличию положительных зарядов, кадаверин может посредством ионных взаимодействий связываться с отрицательно заряженными остатками аминокислот внутри поры и таким образом перекрывать просвет канала (De1cour е! а1, 2003; Nikaido, 2003). Отсутствие строгой зависимости между уровнем экспрессии rpoS и активностью LdcC у мутантов с различным уровнем устойчивости, по-видимому, связано с существованием альтернативных механизмов регуляции активности фермента, действующих параллельно с RpoS. Помимо регуляции экспрессии гена МсС, с3 субъединица РНК полимеразы может способствовать формированию ан-тибиотикоустойчивости, отрицательно регулируя экспрессию гена ompF, и, таким образом, ограни-
чивая количество пориновых каналов во внешней мембране E. coli (Liu, Ferenci, 2001).
Одним из факторов, определяющих способность к формированию биопленок клетками E. coli, является количество молекул с3 субъединицы РНК полимеразы. Высокое содержание этого белка в клетках является причиной наблюдаемого нами возрастания способности к биоплёнкообразо-ванию у селекционированных левофлоксацинрези-стентных мутантов, пропорциональное уровню их антибиотикоустойчивости (см. рис. 4).
Оценка репродуктивной способности таких мутантов показала, что повышенное содержании RpoS сопровождается снижением фитнеса (рис. 5), которое, вероятно, обусловлено энергетическими затратами связанными с гиперпродукцией факторов, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, в том числе RpoS. В естественных условиях обитания в отсутствие антибиотиков снижение фитнеса будет способствовать вытеснению антибиотикорезистентных мутантов из популяции.
Таким образом, возрастание экспрессии гена rpoS, ранее описанное нами для исходного штамма RO91, как физиологическая реакция на действие сублетальных концентраций левофлоксацина, при отборе мутантов, устойчивых к различным концентрациям антибиотика, становится наследственно закрепленным признаком и имеет селективное значение в процессе отбора устойчивых форм. RpoS воздействует на активность лизиндекарбок-силазы LdcC, продуктом которой является кадаверин. Высокое содержание кадаверина, регулирующего пориновый транспорт, наряду с повышенной способностью к биоплёнкообразованию, вносит вклад в повышение уровня антибиотикоре-зистентности мутантов.
Работа выполнена по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (№ 0120096390), поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 09-04-99006-р-офи, а также молодежным научным грантом Уральского отделения РАН.
Библиографический список
Ахова, А.В. Лизиндекарбоксилазная активность как фактор резистентности Escherichia coli к фторхинолонам / А.В. Ахова, А.Г. Ткаченко // Микробиология. 2009. Т. 7, № 5. С. 636-640. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к бактериальным препаратам // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2004. Т. 6. С. 306-359. Ткаченко, А.Г. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, Л.Ю. Нестерова // Биохимия. 2003. Т. 68, вып. 8. С. 1040-1048. Ткаченко, А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов E. coli от токсического эффекта па-раквата, индуцирующего супероксидный стресс // Биохимия. 2004. № 69. С. 234-242. Ткаченко, А.Г. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий / А.Г. Ткаченко, О.Н. Пожидаева, М.С. Шумков // Биохимия. 2006. Т. 71, вып. 9. С.1287-1296 Barnhart, M.M. Curly biogenesis and function / M.M. Barnhart, M.R.Chapman // Annu. Rev. Microbiol. 2006. Vol. 60. P. 137-147 Delcour, A.H. Solute uptake through general porins // Front. Biosci. 2003. Vol. 8. P. 1055-1071.
Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the gS (RpoS) subunit of RNA polymerase // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. P. 373-395.
Kern, W.V. Non-target gene mutations in the development of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli / W.V. Kern, M. Oethinger, A.S. Jellen-Ritter, S.B. Levy // Antimicrob. Agents Chemoth-er. 2000. Vol. 44, № 4. P. 814-820.
Liu, X. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of ompF and ompC porin expression under nutrient limitation / X. Liu, T. Ferenci // Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 29812989.
Naves, P. Correlation between virulence factors and in vitro biofilm formation by Escherichia coli / P. Naves, G. del Prado, L. Huelves [et al.] // Microb. Pathog. 2008. Vol. 45. P. 86-91.
Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 593-656.
Miller, J.H. Experiments in molecular genetics / J.H. Miller // Cold Spring Harbor. New York. 1992.
Petersen, A. The in vitro fitness cost of antimicrobial resistance in Escherichia coli varies with the growth conditions / A. Petersen, F.M. Aarestrrup, J.E. Olsen // FEMS Microbiol. Lett. 2009. P. 1-7.
Samartzidou, H. Excretion of endogenous cadaverina leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability / H. Samartzidou, A.H. Delcour // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181, № 3. P. 791-798
Tkachenko, A. The role of the natural polyamine pu-trescine in defense against oxidative stress in Escherichia coli / А. Tkachenko, L. Nesterova, M. Pshenichnov // Arch. Microbiol. 2001. Vol. 176. Р. 155-157.
Поступила в редакцию 29.03.2010
The role of general stress adaptation factors in the development of Escherichia coli
fluoroquinolone resistance
L. Yu. Nesterova, candidate of biology, research scientist A. G. Tkachenko, doctor of medicine, professor, head of laboratory
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2446712
E. coli mutants with different levels of levofloxacin resistance were selected in this work. Basic rpoS expression increased in direct dependence on their levels of antibiotic resistance. It was also accompanied by the growth of LdcC activity as well as its product cadaverine, and the ability to biofilm formation, while the bacterial fitness decreased. These features were shown to be inheritable and important for the development of fluoroquinolone resistance.
Key words: antibiotic resistance; Escherichia coli; mutant strains; levofloxacin; stress tolerance; adaptation; rpoS gene expression; lysine decarboxylase LdcC.
Нестерова Лариса Юрьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник
Ткаченко Александр Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
