CC BY
37
УДК 579.61: 579.25
Хаова Е.А. 1 2, Кашеварова Н.М. 1, Ткаченко А.Г. 1 2
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г Пермь, Россия 2 Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия
E-mail: [email protected]
РЕГУЛЯЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ ПОЛИАМИНАМИ ЧЕРЕЗ СТИМУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ rpoS, yqjD И rmf
Персисторы - это малочисленная субпопуляция клеток, которые, находясь в дормантном состоянии, характеризуются пониженной чувствительностью к воздействию различных стрессорных факторов, в т. ч. антибиотиков. После прекращения воздействия антибактериального препарата персисторы способны возобновлять рост. Благодаря этим особенностям персисторные клетки являются основной причиной рецидивов инфекционных заболеваний. В качестве факторов пер-систенции рассматривают компоненты общего стрессорного ответа, а также полиамины.
Изучена роль полиаминов путресцина, спермидина и кадаверина в регуляции персистенции Escherichia coli при периодическом культивировании. Регуляция осуществляется через стимуляцию экспрессии генов rpoS, yqjD и rmf, являющихся компонентами общего стрессорного ответа. На экспрессию гена rpoS наибольший стимулирующий эффект оказывает спермидин, а экспрессия гена yqjD находится в меньшей зависимости от полиаминов. Нами показан rpoS-зависимый характер экспрессии гена yqjD, что согласуется с ранее опубликованными данными. Вероятно, полиамины регулируют экспрессию гена yqjD через стимуляцию экспрессии гена rpoS. Согласно результатам исследования, мутанты с нокаутами изучаемых генов в целом демонстрируют более низкие значения частоты персистенции по сравнению с контролем. Наибольшее снижение частоты персистенции rpoS-нокаутного штамма по сравнению с родительским штаммом наблюдается в ранней стационарной фазе, а yqjD- и rmf-нокаутных штаммов - в поздней стационарной фазе. Эти выводы подтверждаются данными об уровне персистенции штаммов с множественными нокаутами.
Таким образом, ген rpoS, стимулируемый в большей степени спермидином, вносит максимальный вклад в регуляцию персистенции в ранней стационарной фазе. Ген rmf, также относящийся к полиаминовому модулону, и ген yqjD, экспрессия которого незначительно повышается полиаминами, участвуют в регуляции персистенции в поздней стационарной фазе.
Ключевые слова: персисторы, полиамины, механизмы общего стрессорного ответа.
Организм человека представляет собой своеобразную экосистему, населяемую микроорганизмами. В процессе эволюции между микроорганизмами и макроорганизмом складывались симбиотические отношения. Симбиоз может иметь три формы: мутуализм, комменсализм, паразитизм. Симбионты на разных этапах своего существования и при изменении условий жизни могут переходить из одной формы симбиотических отношений в другую [1]. В «норме» человек и кишечная палочка находятся в мутуалистических отношениях. Однако при попадании в другие органы и полости тела непатогенные штаммы E. coli кишечной микрофлоры могут вызывать развитие различных инфекционных заболеваний [3]. В системе «паразит - хозяин» бактерии подвергаются значительным стрессорным воздействиям. В эволюционном процессе у бактерий возникли различные способы выживания в таких условиях, в т. ч. персистенция [1]. Персисторы - это малочисленная субпопуляция клеток, которые, находясь в дормант-
ном состоянии, характеризуются пониженной чувствительностью к воздействию различных внешних физико-химических факторов, в т. ч. антибиотиков [1], [8]. После прекращения воздействия антибактериального препарата персисторы способны возобновлять рост. Благодаря этим особенностям персисторы являются основной причиной рецидивов инфекционных заболеваний. Изучение механизмов персистенции имеет важное клиническое значение [8].
Персистенцию рассматривают как результат действия механизмов общего стрессорного ответа [8], [9], [14]. Действие этих механизмов направлено на формирование стрессорного ответа при воздействии комплекса стрессоров и сопровождается значительными морфо-физиологическими изменениями и замедлением метаболических процессов в клетке [4]. Согласно опубликованным данным, наибольшее число персисторов формируется в условиях одновременного воздействия нескольких стрессоров: при переходе бактериальной культуры в
стационарную фазу, при диауксии, при воздействии иммунной системы хозяина, в биопленках и т. д. [9].
В регуляции персистенции могут также участвовать такие полифункциональные соединения, как полиамины. Показана роль этих соединений в регуляции генной экспрессии, пролиферации и защите бактериальных клеток от различных стрессоров [6], [11]. Гены, экспрессия которых стимулируется полиаминами, объединены в структуру - полиамино-вый модулон [6]. Ранее показана положительная регуляция персистенции Escherichia coli путресцином через стимуляцию экспрессии полиамин-зависимого гена rpoS [12], продукт экспрессии которого является ключевым регулятором механизма общего стрессорного ответа rpoS-регулона [4]. Мы предположили, что в персистенции могут участвовать и другие полиамин-зависимые гены, относящиеся к механизмам общего стрессорного ответа, в частности гены стационарной фазы yqjD и rmf, продукты экспрессии которых инактивируют рибосомы [13], [15].
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использованы штаммы E. coli (см. табл. 1). Родительский штамм BW25141 любезно предоставлен К.В. Севериновым, остальные штаммы сконструированы в ходе выполнения данной работы.
Для выяснения роли исследуемых генов в персистенции получены штаммы с единичными и множественными нокаутами в генах rpoS, yqjD и rmf по методу Datsenko&Wanner [5]. Частоту персистенции определяли с помощью метода Keren et al. [7]. Для определения экспрессии изучаемых генов сконструированы репортерные трансляционные слияния в соответствии с протоколом, предложенным Simons et al. [10]. Уровень экспрессии определяли с использованием метода Миллера [2]. Для выяснения влияния продукта экспрессии гена rpoS на экспрессию гена yqjD слияние yqjD::lacZ перенесено в rpoS-нокаутный штамм EAT03 с использованием в качестве вектора фага A.RS45 [10]. Для определения влияния полиаминов на экспрессию генов rpoS и yqjD соответствующие репортерные слияния перенесены в полиамин-дефицитный штамм SHT02 с использованием в качестве вектора фага ARS45 [10].
Перед экспериментом штаммы, сохраняемые на скошенном LB-агаре («Sigma», США) под слоем вазелина при +4оС, высевали на 5 мл питательной среды LB («Sigma», США) с добавлением соответствующих антибиотиков: ампициллин (50 мкг/мл) («MP Biomedicals», Франция), канамицин (50 мкг/мл) («Синтез», Россия), стрептомицин (25 мкг/мл) («GERBU Biotechnik GmbH», Германия). После 6 часов культивирования в термостате при 37°С клетки переносили на 50 мл богатой среды LB в колбу Эрленмейера (250 мл) с добавлением антибио-
Таблица 1 - Штаммы, использованные в работе
Штамм Генотип
BW25141 F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), A(phoB-phoR)580, Х-galU95, AuidA3::pir+, recAl, endA9(del-ins)::FRT, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514
EAT01 как BW25141, но Armf
EAT02 как BW25141, но AyqjD
EAT03 как BW25141, но ArpoS
EAT04 как BW25141, но ArpoS Armf
EKH1 как BW25141, но AyqjD Armf
EAT06 как BW25141, но ArpoS Armf AyqjD
EAT08 как BW25141, но XRZ5rpoS742::lacZ(Hyb)
EKH3 как BW25141, но XRS45yqjD234::lacZ(Hyb)
EKH4 как BW25141, но XRS45rmf39::lacZ(Hyb)
EKH5 как EAT03, но \RS45yqjD234::lacZ(Hyb)
SHT02 F-, thr-1, araC14, AspeD98, A(gpt-proA)62, lacYI, glnX44(AS), galK2(Oc), Х-, A(speB-speA)97, A(speC-glcB)63, rpsL25(strR), xylA5, mtl-1, thiE1, ampCp-1, cadA2, A lacZ
EKH7 как SHT02, но XRS45yqjD234::lacZ(Hyb)
SHT03 как SHT02, но XRZ5rpoS742::lacZ(Hyb)
тиков, а клетки полиамин-дефицитных штаммов EKH7 и SHT03 - на 50 мл минимальной среды М9 с добавлением 0,4% глюкозы, пролина (0,1 мг/мл), тиамина (0,01 мг/мл), пантотеновой кислоты (0,01 мг/мл) и соответствующих антибиотиков. Культивировали 16 ч в термостатируемом шейкере GFL1092 («GFL», Германия) при 37оС 120 оборотов/мин. Далее для проведения эксперимента культуру переносили на 50 мл свежей среды с теми же добавками, доводя плотность культуры на среде LB до 0D600=0,1 и на среде М9 до 0D600=0,45. Культивировали при тех же условиях. Биомассу клеток оценивали после предварительного разведения культуры физиологическим раствором по оптической плотности на спектрофотометре UV-VIS Spectrophotometer PD-303UV («Apel», Япония).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием
пакета стандартных программ Statistica for Windows 5.0. Повторность всех экспериментов 3-5-кратная.
Результаты исследования
и их обсуждение
Нами изучено влияние полиаминов на экспрессию генов rpoS и yqjD на трансляционном уровне. Определены уровни экспрессии данных генов в полиамин-дефицитных штаммах SHT03 и EKH7, несущих соответствующие трансляционные слияния, без добавления полиаминов и с добавлением путресцина, спермидина и кадаверина в различных концентрациях при начальной плотности популяции, соответствующей 0D600=0,45 (соответствует 0ч культивирования) (рис. 1). Результаты исследования показывают, что полиамины стимулируют экспрессию изучаемых генов на трансляционном уровне.
Рисунок 1 - Концентрационно - зависимая стимуляция полиаминами экспрессии генов rpoS и yqjD на трансляционном уровне. Pt - путресцин, Sd - спермидин, Cd - кадаверин
При этом стимуляция несет концентрационно-зависимый характер: чем выше концентрация добавки полиаминов, тем сильнее эффект их действия. Наибольшее влияние на экспрессию гена гроБ оказывает спермидин, несколько меньшее - путресцин, наименее выраженный эффект вызывает кадаверин. В отличие от гена гроБ, ген ущВ не упоминается в литературе как член полиаминового модулона [6]. Однако, согласно полученным данным, путресцин, спермидин и кадаверин примерно с одинаковой эффективностью незначительно повышают уровень экспрессии гена ущВ.
Согласно данным литературы ген уд]В входит в состав гроБ-регулона [16]. Поэтому мы предположили, что полиамины регулируют экспрессию гена ущВ через стимуляцию экспрессии гена гроБ. Нами определены уровни экспрессии генау^В в штаммах ЕКН3 (гроБ+) и ЕКН5 (гроБ-) при периодическом культивировании (рис. 2). Показано, что в штамме ЕКН5 экспрессия гена ущВ значительно снижена по сравнению с экспрессией в контрольном штамме ЕКН3. При этом отсутствует характерная для гена ущВ тенденция к увеличению экспрессии в стационарной фазе. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными [15]. Таким образом, хотя ген ущВ не отнесен к полиаминовому модулону, полиамины могут регулировать его экспрессию опосредованно через стимуляцию экспрессии гена гроБ.
Нами определены уровни экспрессии генов гроБ, ущВ и гш/и значения частоты персистен-ции у нокаутных штаммов в сравнении с контрольным родительским штаммом при периодическом культивировании.
Нокаутные штаммы в целом демонстрируют более низкие значения частоты персистен-ции по сравнению с контролем. При этом в стационарной фазе негативный эффект нокаутов носит ген-специфичный характер.
Показано, что экспрессия гена гроБ возрастает при переходе бактериальной культуры в стационарную фазу роста и достигает максимума на 24 ч культивирования (рис. 3 а). В это
время, ч
Рисунок 2 - троЗ-зависимая экспрессия гена уд]В
Рисунок 3 - Влияние единичных нокаутов в генах троЗ (а), уд]В (б) и тш/(в) на частоту персистенции
Рисунок 4 - Влияние множественных нокаутов на частоту персистенции
время гроБ-нокаутный штамм демонстрирует наибольшее снижение частоты персистенции по сравнению с контрольным штаммом. Таким образом, ген гроБ, стимулируемый спермидином, участвует в регуляции персистенции в ранней стационарной фазе.
После 24 ч культивирования частота персистенции гроБ-нокаутного штамма становится примерно равной частоте персистенции контрольного штамма. В это время (на 24-72 ч) ущО- и гт/-нокаутные штаммы, наоборот, демонстрируют наибольший отрицательный эффект (рис. 3 б, в).
Это совпадает с максимальным уровнем экспрессии данных генов (на 48 ч), что подтверждает их роль в формировании персистор-ного состояния в поздней стационарной фазе.
Эти выводы подтверждаются данными об уровне персистенции штаммов с множественными нокаутами (рис. 4). Показано, что в целом
наибольшее снижение частоты персистенции у мутантов по сравнению с контролем наблюдается в ранней стационарной фазе (8-24 ч), обусловленное, видимо, нокаутом гена rpoS, и в поздней стационарной фазе (48-72ч), вызванное нокаутами генов yqjD и rmf. Следует отметить, что значения частоты персистенции у штаммов с двойным нокаутом ArpoSArmf и с тройным нокаутом примерно одинаковые, что говорит о небольшом вкладе гена yqjD в персистообразование по сравнению с генами rpoS и rmf.
Таким образом, полиамины через стимуляцию экспрессии генов rpoS, yqjD и rmf участвуют в регуляции персистенции E. coli. Вклад каждого из полиамин-зависимых генов зависит от фазы роста периодической культуры. Ген rpoS вносит максимальный вклад в персистообразо-вание в ранней стационарной фазе, а гены rmf и yqjD - в поздней стационарной фазе.
04.10.2017
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта «р_а 16-44-590279» и программы УрО РАН проект № 15-4-4-1
Список литературы:
1. Бухарин, О. В. Персистенция бактериальных патогенов как физиологический феномен / О.В. Бухарин // Вестник Московского университета. - 2008. - №1. - С. 6-13.
2. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова под. ред. С.И. Алиханяна - М: Мир. - 1976. - 436 с.
3. Бактериальная транслокация из кишечника: микробиологические, иммунологические и патофизиологические аспекты / Г.И. Подопригора, Л.И. Кафарская, Н.А. Байнов [и др.] // Вестник РАМН. - 2015. - № 6. - С. 640-650.
4. Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов / А.Г. Ткаченко, - Екатеринбург: УрО РАН, 2012. - 268 с.
5. Datsenko, K.A. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products / K.A. Datsenko, B.L. Wanner // PNAS. - 2000. - Vol. 97. - No. 12. - P. 6640-6645.
6. Igarashi K., Polyamine modulon in Escherichia coli: genes involved in the stimulation of Cell growth by polyamines / K. Igarashi, K. Kashiwagi // J. Biochem. - 2006. - Vol. 139. - No. 1. - P. 11-16.
7. Persister cells and tolerance to antimicrobials / I. Keren, N. Kaldalu, A. Spoering [et al] // FEMS Microbiol Lett. - 2004. - Vol. 230. - No. 1. - P. 13-18.
8. Lewis, K. Persister cells / K. Lewis // Annual Review of Microbiology. - 2010. - Vol. 64. - P. 357-372.
9. Maisonneuve, E, Molecular mechanisms underlying bacterial persisters / E. Maisonneuve, K. Gerdes // Cell. - 2014. - Vol. 157. - No. 3. - P. 539-548.
10. Simons, R.W. Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions / R.W. Simons, F. Houman, N. Kleckner // Gene. - 1987. - Vol. 53. - No. 1. - P. 85 - 96.
11. Tabor, C.W. Polyamines in microorganisms / C.W. Tabor, H. Tabor // Microbiological Reviews. - 1985. - Vol. 49. - No. 1. - P. 81-99.
12. Putrescine controls the formation of Escherichia coli persister cells tolerant to aminoglycoside netilmicin / A. Tkachenko, N. Kashevarova, E. Karavaeva [et al] // FEMS Microbiol. Lett. - 2014. - Vol. 361. - No. 1. - P.1-9.
13. Wada, A. Growth phase coupled modulation of Escherichia coli ribosomes / A. Wada // Genes Cells. - 1998. - Vol. 3. - No. 4. - P. 203-208.
14. Wen, Y. Toxin - antitoxin systems: their role in persistence, biofilm formation, and pathogenicity / Y. Wen, E. Behiels, B. Devreese // Pathogens and disease. - 2013. - Vol. 70. - No. 3. - P. 240-249.
15. YqjD is an inner membrane protein associated with stationary-phase ribosomes in Escherichia coli / H. Yoshida, Y. Maki, A. Sakai [et al] // J. Bacteriol. - 2012. - Vol. 194. - No. 16. - P. 4178-4183.
Сведения об авторах:
Хаова Елена Александровна, лаборант-исследователь Лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, студентка 1 курса магистратуры кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13, тел.: (342) 212-21-59 614990 г. Пермь, ул. Букирева, 15, тел.: (342) 2-396-501; e-mail: [email protected]
Кашеварова Наталья Михайловна, младший научный сотрудник Лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13, тел.: (342) 212-21-59; e-mail: [email protected]
Ткаченко Александр Георгиевич, заведующий Лабораторией адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, профессор кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского
университета, доктор медицинских наук, профессор 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13, тел.: (342) 212-21-59 614990 г. Пермь, ул. Букирева, 15, тел.: (342) 2-396-501; e-mail: [email protected]
