CC BY
80
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 579.22
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ldcC Escherichia coli КАК ФАКТОР АДАПТАЦИИ К АНТИБИОТИКАМ
М. С. Шумковa, А. В. Гончаренкоb, А. М. Кылосовас, А. Г. Ткаченкоa,c
a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected] b Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, ул. Ленинский проспект, 33, e-mail: [email protected] с Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15: [email protected]
На основе репортерных генных слияний созданы штаммы E. coli, позволяющие изучить экспрессию гена ldcC на транскрипционном и трансляционном уровнях её регуляции. Показано, что антибиотики фторхинолонового ряда (пефлоксацин) вызывают приблизительно 2-кратное повышение экспрессии, в то время как р-лактамы (цефотаксим) проявляют противоположно направленный эффект, приводя к 2-кратному снижению уровня экспрессии ldcC. Выраженная функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков обусловливает различия их эффектов на экспрессию ldcC в зависимости от с класса действующего антибиотика (фторхинолоны или р-лактамы).
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, Escherichia coli, мутантные штаммы, пефлоксацин, цефотаксим,
адаптация, полиамины, экспрессия гена ldcC, лизиндекарбоксилаза LdcC.
Антибиотикотерапия является одним из наиболее широко используемых способов лечения бактериальных инфекций. Вместе с тем, эффективность применения антибиотиков в последнее время неуклонно снижается, что связано с широким распространением антибиотикоустойчивых форм бактерий. Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может формироваться как на основе специфических (обусловленных изменением структуры мишени, приобретением специфических ферментов деградации и т.д.) так и неспецифических механизмов, которые, как правило, не обеспечивают высокого уровня антибиотикорезистентности, но действуют в отношении широкого спектра антибактериальных препаратов. В основе таких механизмов лежит активация общего стрессорного ответа бактериальной клетки, которая может быть обусловлена индукцией rpoS регулона, то есть группы генов адаптации, которые находятся под контролем глобального транскрипционного регулятора с3 ^ро8), и/или естественными защитными свойствами полиаминов - биогенных модуляторов широкого спектра действия.
Ранее нами показано, что сублетальные воздействия представителей наиболее широко используемых классов антибиотиков, фторхинолонов и р-лактамов, индуцируют ответ со стороны системы синтеза полиаминов, что приводит к значительному их накоплению в клетках Е. соН (Ткаченко и др., 2009). При этом количественное соотношение различных полиаминов было специфичным для разных классов антибиотиков. Показано, что наиболее характерным признаком ответа на фторхинолоны
является высокое накопление одного из полиаминов, кадаверина, что сопровождалось существенной индукцией экспрессии rpoS и характеризовалось сильной корреляцией этих параметров (r=0.90, p<0.05).
Известно, что синтез кадаверина в клетках E. coli осуществляется в процессе реакции, катализируемой двумя изоферментами лизиндекарбокси-лазы, CadA и LdcC. При этом синтез LdcC, которая ранее считалась конститутивным ферментом, находится под контролем RpoS (Lemonier, Lane, 1998; Ткаченко и др., 2009). Сравнительное изучение активности двух форм лизиндекарбоксилазы в условиях воздействия различных антибиотиков показало изменение их соотношения в зависимости от класса действующего антибактериального препарата. В частности, рассматриваемая ранее как конститутивная лизиндекарбоксилаза LdcC, демонстрировала существенное возрастание активности в ответ на фторхинолоны (Ахова, Ткаченко, 2009). Исходя из этого, сделано предположение о возможности индуцибельного характера изменения экспрессии гена ldcC, кодирующего данный фермент, в ответ на воздействие фторхинолоновых антибиотиков. Для проверки данного предположения в настоящей работе сконструированы два типа однокопийных репортерных генных слияний ldcC::lacZ, транскрипционное и трансляционное, и проведено изучение их экспрессии в ответ на воздействие двух различных классов антибиотиков, фторхинолонов и Р-лактамов.
© М. С. Шумков, А. В. Гончаренко, А. М. Кылосова, А. Г. Ткаченко, 2010
36
Материалы и методы
Объекты исследования
Использованные в настоящей работе плазмиды и штаммы E. тН с указанием их генотипических свойств перечислены в таблице.
Плазмиды pRS551/6 и pRS552/13 были сконструированы путём лигирования промоторной области гена Ш^, амплифицированной с использованием праймеров LdcRI 5’-
CCGGAATTCGCAAAAGTTCTGAAAAAGGGTC-
3’ и LdcBam 5’-
GGGGATCCCAGATAATCTGAAAGCCTTGCGC-3’, в pGEM-T easy (Promega, США) с последующим переносом EcoRI/BamHI-рестриктов в pRS551 или pRS552 (Simons et al., 1987), соответственно. Полученные плазмиды трансформировали в клетки E. coli BMH 71-18 mutS (Promega, США), XRS45 лизаты которых затем использовали для инфекции E. coli GC4468. Отобранные по результатам KanR мо-но-лизогены несли транскрипционное (SHT36) или трансляционное (SHT40) ldcC::lacZ генное слияние.
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в настоящей работе
ЗНТЗб
SHT4G
BMH 71-18 mutS
Штаммы E. coli и плазмиды
Генотип
Источник
получения
551/б
552/13
GC4468 (XRS45 ldcC::lacZ)
GC4468 (XRS45 ldcC::lacZ [hybr])
thi, supE, A(lac-proAB), [wutS::Tn1G],
la^I4ZAM15]
pRS551 ldcC::lacZ
pRS552 ldcC::lacZ
[F', pro AB,
настоящая работа настоящая работа Promegа, США
настоящая работа настоящая работа
Культивирование микроорганизмов
Перед экспериментом штаммы E. coli, сохраняемые на скошенном LB-агаре, высевали на пробирку с 5 мл LB-бульона. По истечении 11 ч культивирования в термостате при З70С клетки переносили в колбу со 1GG мл LB-бульона и выращивали в течение 13
ч в термостатируемом шейкере (1GG об/мин) при той же температуре. Выросшую культуру использовали в качестве инокулята для посева в колбы с 5G мл LB-бульона. Исследуемые антибиотики, в концентрациях, указанных в подписях к рисункам, вносили при оптической плотности культуры равной G.3 (0D6GG).
Биомассу клеток оценивали по оптической плотности (0D6GG) на спектрофотометре PD-3G3UV (Apel, Япония).
Активность р-галактозидазы измеряли в клетках, предварительно обработанных смесью DS-Na и хлороформа методом Миллера (Miller, 1992).
Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.G (StatSoft, Inc., 2GG1). На рисунках приведены данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех), представленные в формате среднее ± среднее квадратичное отклонение. Оценка статистической значимости различий средних сравниваемых групп для множественных сравнений произведена с использованием критерия Ньюмена-Кейлса. Различия считали значимыми при р^5.
Результаты
Влияние антибиотиков на экспрессию ldcC
Известно, что эффект антибиотиков на генную экспрессию может значительно изменяться в зависи-
мости от величины их воздействующей концентрации (Davies et al., 2006). Исходя из этого, концентрации антибактериальных препаратов, использованные нами для воспроизведения их сублетального эффекта, подбирались таким образом, чтобы обеспечить одинаковое, 70%, снижение накопления биомассы к
5 часу действия антибиотика.
Транскрипция ldcC после внесения в среду 0.12 мкг/мл фторхинолона пефлоксацина возрастала в 2.6 раза, тогда как уровень трансляции в этих условиях увеличивался на 70% (рис. 1).
В отличие от этого внесение 0.4 мкг/мл цефотак-сима, относящегося к классу Р-лактамов, вызывало противоположный эффект, приводя к 55% падению транскрипции ldcC и 40% снижению его трансляции (рис. 1).
Влияние полиаминов на экспрессию в присутствии антибиотиков
Ранее показано, что полиамины могут принимать участие в широком спектре адаптивных реакций бактериальной клетки (Ткаченко, 2004; Ткаченко и др., 2006; Rhee et а1., 2007), в том числе, в ответе на добавку антибиотиков (Ткаченко и др., 2009), где они могут играть роль фактора адаптации, способствующего повышению жизнеспособности. Поскольку одним из механизмов участия полиаминов в приспособлении бактерий к неблагоприятным условиям среды является регуляция экспрессии адаптивных генов, было сделано предположение о возможности участия полиаминов, в частности путресцина и спер-мидина, также и в регуляции экспрессии
пефлоксацин цефотаксим
Рис. 1. Влияние антибиотиков на экспрессию гена 1СсС Е. соїі. на транскрипционном (1) и трансляционном (2) уровнях спустя 4 ч после внесения антибактериальных препаратов. Светлые столбцы - контроль (культивирование в отсутствие антибиотиков), заштрихованные -культивирование в присутствии антибиотика в концентрациях 0.12 мкг/мл пефлоксацина и 0.4 мкг/мл цефо-таксима. Различия средних значений экспрессии ЫсС в стрессированных и контрольных культурах статистически значимы при р<0.05
Проведенные нами исследования показали, что в контрольной культуре, выращенной в отсутствие антибиотиков, полиамины не оказывали существенного влияния на уровень экспрессии ІСсС (рис. 2, 3) и скорость роста бактериальной культуры (рис. 4).
К ПФЛ К ПФЛ транскрипция трансляция
Рис. 2. Влияние полиаминов на экспрессию гена ІСсС на уровнях транскрипции (Е. соїі SHT36) и трансляции (Е. соїі SHT40) при действии пефлоксацина:
1 - контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 -внесение 5 мМ путресцина; 3 - внесение 5 мМ спермидина; К - культуры без антибиотиков; ПФЛ - культуры с добавкой 0.12 мкг/мл пефлоксацина; * - статистически значимые отличия от стрессированной культуры без полиаминов, р<0.05
Иная картина наблюдалась при добавке полиаминов в бактериальную культуру в условиях воздействия антибиотиков. В присутствии пефлоксацина пут-ресцин вызывал 70% повышение транскрипции и 90% возрастание трансляции 1СсС в сравнении со стрессированной культурой без полиаминов, тогда
как внесение спермидина вызывало снижение уровня экспрессии ИсС на обоих уровнях экспрессии до значений нестрессированной культуры (рис. 2).
В условиях добавки в среду цефотаксима транскрипция ИсС при действии путресцина и спермидина не изменялась. В то же время, на уровне трансляции полиамины демонстрировали тенденцию к повышению экспрессии ИсС (примерно на 30% в сравнении со стрессированной культурой без полиаминов), однако их эффект не был статистически значимым (рис. 3).
К ЦФТ К ЦФТ транскрипция трансляция
Рис. 3. Влияние полиаминов на экспрессию гена ldcC на уровнях транскрипции (E. coli Sffl^) и трансляции (E. coli SHT4G) нри действии цефотаксима:
1 - контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 -внесение 5 мМ путресцина; 3 - внесение 5 мМ спермии-дина; К - культуры без антибиотиков; ЦФТ - культуры с добавкой G.4 мкг/мл цефотаксима
На фоне таких изменений экспрессии ldcC привлекают внимание данные, характеризующие рост соответствующих культур (рис. 4). Путресцин в присутствии пефлоксацина не оказывал какого-либо влияния на скорость накопления биомассы, тогда как спермидин вызывал 2-кратное повышение значений оптической плотности, что указывает на его роль как фактора, частично снимающего ингибирующий эффект антибиотика. Вместе с тем, в условиях действия цефотаксима полиамины не оказывали какого-либо влияния на рост бактериальных культур (данные не показаны).
Обсуждение
Первое упоминание о существовании второй, наряду с CadA, лизиндекарбоксилазы E. coli LdcC приводится в работе Kikuchi et al. (1997). Приблизительно в то же время появилось сообщение о вероятном конститутивном характере экспрессии кодирующего её гена ldcC (Yamamoto et al., 1997). Вместе с тем, в последующих за этими публикациями работах Le-monnier, Lane (1998) и Kikuchi et al. (1998) показано,
без антибиотика пефлоксацин
Рис. 4. Влияние полиаминов на рост культуры Е. соН SHT36 при действии 0.12 мкг/мл пефлоксацина:
1 - контрольная культура, без добавки полиаминов; 2 -внесение 5 мМ путресцина; 3 - внесение 5 мМ спермии-
дина; * - статистически значимые отличия от стресси-рованной культуры без полиаминов, р<0.05
что экспрессия МсС зависит от с3-субъединицы РНК-полимеразы ^ро8) и поставлен под сомнение конститутивный характер её регуляции. Что касается возможности участия других факторов в регуляции экспрессии ШсС, информация по данному вопросу до сих пор отсутствовала.
В настоящей работе нами впервые продемонстрировано изменение экспрессии ШсС в ответ на добавку антибиотиков двух различных классов - фторхи-нолонов и р-лактамов (см. рис. 1). Таким образом, с одной стороны, получено несомненное доказательство индуцибельного характера регуляции данного гена, с другой - описаны условия его индукции, которые указывают на возможную адаптивную роль соответствующего фермента в условиях стресса, обусловленного действием антибиотиков фторхиноло-нового ряда.
Известно, что экспрессия rpoS в условиях стресса, вызванного антибиотиками, также существенно изменяется (Ткаченко и др., 2009), однако оставалось неизвестным, связаны ли наблюдаемые изменения экспрессии ШсС в ответ на антибиотики только с влиянием RpoS, или в её регуляции принимают участие другие факторы. Данные об однозначном возрастании экспрессии rpoS в ответ на антибиотики, независимо от их класса (Ткаченко и др., 2009), в отличие от альтернативного ответа со стороны экспрессии ШсС на различные антибиотики (см. рис. 1, 3), свидетельствуют о том, что, по меньшей мере при добавке цефотаксима, в регуляции экспрессии ШсС, помимо RpoS, принимают участие другие генные модуляторы.
Ранее было установлено, что экспрессия rpoS может возрастать при добавке полиаминов даже в отсутствие стрессорного воздействия (Ткаченко, Шумков, 2004). В настоящей работе показано, что полиамины (путресцин и спермидин) вызывали статистически значимое изменение экспрессии ШсС только в присутствии фторхинолонового антибиотика пеф-
локсацина и совсем не влияли на неё в контрольных культурах без антибиотиков (см. рис. 2, 3). Исходя из этого, можно прийти к заключению, что, во-первых, в качестве транскрипционных модуляторов в отношении ldcC, наряду с RpoS, могут выступать полиамины (путресцин и спермидин), во-вторых, наряду с полиаминами, в этом процессе должны участвовать какие-то дополнительные факторы, обусловливающие, в том числе, и противоположный характер эффекта цефотаксима.
Снижение экспрессии ldcC при добавке сперми-дина в присутствии пефлоксацина в среде культивирования (см. рис. 2), очевидно, не связано с негативным влиянием этого полиамина на транскрипцию или трансляцию исследуемого гена. Наиболее вероятно, это обусловлено альтернативными антистрес-сорными функциями спермидина, частично снимающего ингибиторное действие антибиотика, что вызывает пропорциональное снижение силы адаптивного ответа в виде ослабления экспрессии ldcC.
Об этом свидетельствует 2-кратная стимуляция роста культуры E. coli, наблюдаемая в ответ на добавку спермидина в присутствии антибиотика (рис. 4).
В отличие от спермидина, путресцин не оказывал заметного положительного эффекта на уровень биомассы стрессированной культуры (рис. 4), однако двукратно повышал экспрессию ldcC в ответ на воздействие пефлоксацина (см. рис. 2). Исходя из этого, складывается впечатление о преобладании у путрес-цина свойств положительного модулятора ldcC по сравнению с его антистрессорными свойствами, подобными спермидину. Спермидин, как известно, имеет большее, по сравнению с путресцином, сродство к ДНК (Cohen, 1978) и способность улавливать активные формы кислорода (Ткаченко, Федотова, 2007), продуцируемые при действии антибиотиков (Kohansky et al., 2007).
Таким образом, экспрессия ldcC в условиях суб-летальных воздействий антибиотиков регулируется в широких пределах. Фторхинолоны (пефлоксацин) вызывают её 2-кратное повышение, в то время как р-лактамы (цефотаксим) оказывают противоположно направленный эффект, приводя к 2-кратному снижению экспрессии. Такие особенности изменения экспрессии ldcC дают основание считать, что соответствующая лизиндекарбоксилаза играет более существенную роль в защите бактериальной клетки от фторхинолоновых антибиотиков по сравнению с Р-лактамами. Полиамины в этих условиях проявляют выраженную функциональную специализацию с преобладанием антистрессорных свойств у сперми-дина и функций положительного модулятора генной экспрессии у путресцина.
Работа выполнена по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (№ 0120096390), поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 09-04-99006-р-офи, а также
молодежным научным грантом Уральского
отделения РАН.
Библиографический список
Ахова, А.В. Лизиндекарбоксилазная активность как фактор резистентности Escherichia coli к фторхи-нолонам / А.В. Ахова, А.Г. Ткаченко // Микробиология. 2009. Т. 78, № 5. С. 636-640.
Ткаченко, А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов Escherichia coli от токсического эффекта па-раквата, индуцирующего супероксидный стресс // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 234-242.
Ткаченко, А.Г. Роль путресцина в регуляции уровня с^субъединицы. РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при переходе к стационарной фазе / А.Г. Ткаченко, М.С. Шумков // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1079-1087.
Ткаченко, А.Г. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости
Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий / А.Г. Ткаченко, О.Н. Пожидаева, М.С. Шумков // Биохимия. 2006. Т. 71, № 9. С. 1287-1296.
Ткаченко, А.Г. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от силы стрессорных воздействий супероксидных радикалов / А.Г. Ткаченко, М.В. Федотова // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 109-116.
Ткаченко, А.Г. Адаптивные функции полиаминов при сублетальных воздействиях антибиотиков / А.Г. Ткаченко, М.С. Шумков, А.В. Ахова // Микробиология. 2009. Т. 78, № 1. С. 32-41.
Cohen, S.S. What do the polyamines do? // Nature. 1978. Vol. 274. P. 209-210.
Davies, J. The world of subinhibitory antibiotic concentrations / J. Davies, G.B. Spiegelman, G. Yim // Curr. Opin. Microbiol. 2006. Vol. 9. P. 445-453.
Kikuchi, Y. Characterization of a Second Lysine Decarboxylase Isolated from Escherichia coli / Y. Kikuchi, H. Kojima, T. Tanaka [et al.] // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179, № 14. P. 4486-4492.
Kikuchi, Y. RpoS-dependent expression of the second lysine decarboxylase gene in Escherichia coli / Y. Kikuchi, O. Kurahashi, T. Nagano [et al.] // Biosci. Biotechnol. Bio-chem. 1998. Vol. 62. P. 1267-1270.
Kohanski, M.A. A Common Mechanism of Cellular Death Induced by Bactericidal Antibiotics / M.A. Kohanski, D.J. Dwyer, B. Hayete [et al.] // Cell. 2007. Vol. 130. P. 797-810.
Lemonnier, M. Expression of the second lysine decarboxylase gene of Escherichia coli / M. Lemonnier, D. Lane // Microbiology. Uk. 1998. Vol. 144. P. 751760.
Miller, J.H. Experiments in molecular genetics. / J.H.
Miller. Cold Spring Harbor. New York. 1992.
Rhee, H.J. Physiological polyamines: simple primordial stress molecules / H.J. Rhee, E.-J. Kim, J.K. Lee // J. Cell. Mol. Med. 2007. Vol. 11, № 4. P. 685-703. Simons, R. W. Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions / R.W. Simons, F. Houman, and N. Kleckner// Gene. 1987. Vol. 53. P. 85-96.
Yamamoto, Y. The Escherichia coli ldcC gene encodes another lysine decarboxylase, probably a constitutive enzyme / Y. Yamamoto, Y. Miwa, K. Miyoshi [et al.] // Genes Genet. Syst. 1997. Vol. 72. P. 167172.
Поступила в редакцию 29.03.2010
Alterations of Escherichia coli ldcC expression as a factor of adaptation to antimicrobials M. S. Shumkov, candidate of biology, research scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str.,
Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2446712
A. V. Goncharenko, candidate of biology, senior scientist
A.N. Bach Institute of Biochemistry. 33, Leninsky prospekt, Moscow, Russia, 119071; [email protected] A. M. Kylosova, technician
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected] A, G. Tkachenko, doctor of medicine, professor, head of laboratory
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
E. coli strains with single-copy chromosomal operon and protein IdcCr.lacZ reporter gene fusions were constructed. Approximately 2-fold ldcC expression increase following pefloxacin application was demonstrated using these strains. On the contrary, cefotaxime treatment caused a 2-fold decrease in the ldcC expression. Polyamines in the presence of antibiotics demonstrated substantial functional specialization. Their effect strongly depended on the antibiotic applied: either fluoroquinolone or p-lactam.
Key words: antibiotic resistance; Escherichia coli; mutant strains; pefloxacin; cefotaxime; adaptation; polyamines; ldcC gene expression; lysine decarboxylase LdcC.
Шумков Михаил Сергеевич, кандидат биологических наук, научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Гончаренко Анна Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ГУ РАН «Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН»
Кылосова Алена Михайловна, лаборант ГОУВПО «Пермский государственный университет»
Ткаченко Александр Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
